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一种副溶血弧菌类脂A提取纯化与结构分析的方法

文献发布时间:2023-06-19 18:46:07


一种副溶血弧菌类脂A提取纯化与结构分析的方法

技术领域

本发明属于类脂A提取领域,具体涉及到一种副溶血弧菌类脂A提取纯化与结构分析的方法。

背景技术

副溶血弧菌是一种嗜盐和革兰氏阴性的人类病原体,它广泛地分布在包括河水、海水以及海水沉积物的水生环境中。能感染鱼类、虾类以及甲壳类等多种水产动物,但更重要的是,它是世界范围内细菌性海鲜相关胃肠炎的主要原因。尤其是食用生的或半熟的海鲜会增加海鲜食物中毒的机会,感染后的症状包括腹泻伴腹部绞痛、恶心、呕吐、头痛和低烧。

脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁中普遍存在的成分,由类脂A、核心多糖和O抗原三部分组成。它通过与宿主防御系统的相互作用产生炎症介质,从而增强革兰氏阴性菌感染的致病过程。LPS的生物合成起始于细胞质中类脂A的形成。而类脂A则代表了LPS的保守分子模式,是LPS免疫反应的主要诱导因子。宿主的Toll样受体(TLR4)或先天性免疫受体MD-2共同负责LPS的生理识别,试图清除入侵的病原体,并启动特定的免疫反应。在大肠杆菌中,类脂A的生物合成方法已经被阐明,并且该途径中的关键酶也已经被分离鉴定出。野生型大肠杆菌的类脂A结构比较单一,包含六条脂肪酸链和两个磷酸基团。且大肠杆菌中的类脂A是与LPS的核心多糖共价结合的,目前没有报道存在游离的类脂A。游离类脂A在沙门氏菌、阪崎肠杆菌等常见的肠杆菌中也鲜有报道。但野生型副溶血弧菌的类脂A具有种类与结构多样化的特点。除了常见的,与LPS连接的类脂A,还存在游离的类脂A。

目前采用Bligh-Dyer氯仿/甲醇/水混合相萃取法对大肠杆菌类脂A进行提取,首先需要采用大量液体培养基对菌株进行培养,菌体收集之后再采用76~152ml的BD一相系统进行磁力搅拌,低速离心分相后使用pH4.5的醋酸钠进行酸水解,最后再采用87~116ml的BD二相系统混合。但该方法较难提取副溶血弧菌类脂A,并且花费的试剂较多,时间周期也较长。所以使得副溶血弧菌类脂A的种类与结构还未得到很好的研究。因此,亟需一种针对副溶血弧菌类脂A的提取方法,并对其结构进行分析。

发明内容

为解决上述技术问题,本发明提供了如下技术方案:一种副溶血弧菌类脂A提取纯化与结构分析的方法。

本发明的一个目的是提供一种副溶血弧菌LPS连接类脂A提取纯化方法,包括,

步骤1:将副溶血弧菌通过LB液体培养基培养;

步骤2:收集菌体,用磷酸盐缓冲溶液冲洗,加入氯仿/甲醇/水的混合液重悬菌体后室温下磁力搅拌2.5h,离心后加入醋酸钠溶液重悬沉淀,然后调节pH值到2-2.5,超声10min后于100℃煮30min,得到混合溶液;

步骤3:混合溶液冷却到25℃以下后加入氯仿和甲醇,上下颠倒混匀,离心后收集下层有机相,吹干得到副溶血弧菌LPS连接类脂A。

作为本发明的副溶血弧菌LPS连接类脂A提取纯化方法的一种优选方案,其中:步骤1中所述LB液体培养基组成为:酵母粉5g/L,蛋白胨10g/L,NaCl 10g/L。

作为本发明的副溶血弧菌LPS连接类脂A提取纯化方法的一种优选方案,其中:步骤2中所述氯仿/甲醇/水的混合液中氯仿、甲醇和水的体积比为1:2:0.8。

作为本发明的副溶血弧菌LPS连接类脂A提取纯化方法的一种优选方案,其中:步骤2中所述醋酸钠溶液浓度为12.5mM。

作为本发明的副溶血弧菌LPS连接类脂A提取纯化方法的一种优选方案,其中:步骤2中采用盐酸溶液调节pH值,盐酸溶液浓度为36-38wt%。

作为本发明的副溶血弧菌LPS连接类脂A提取纯化方法的一种优选方案,其中,步骤3中加入的氯仿和甲醇的体积比为1:1。

作为本发明的副溶血弧菌LPS连接类脂A提取纯化方法的一种优选方案,其中,步骤2和步骤3中所述的离心的转速为2000rpm。

本发明的目的之二是提供一种副溶血弧菌游离类脂A提取纯化方法,包括,

步骤1:将副溶血弧菌通过LB固体培养基划线培养;

步骤2:收集菌体,将其加入到氯仿/甲醇/水的混合液中,室温摇晃1h,高速离心后吸取上清液;其中菌体的质量与氯仿/甲醇/水的混合液的体积比为0.1g:(9-10)mL;

步骤3:向上清液中加入氯仿和水,摇晃混合后高速离心,收集下层有机相,吹干得到副溶血弧菌游离类脂A。

作为本发明的副溶血弧菌游离类脂A提取纯化方法的一种优选方案,其中:步骤1中所述LB固体培养基组成为:酵母粉5g/L,蛋白胨10g/L,NaCl 10g/L,琼脂粉15g/L。

作为本发明的副溶血弧菌游离类脂A提取纯化方法的一种优选方案,其中:步骤2中所述氯仿/甲醇/水的混合液中氯仿、甲醇和水的体积比为1:2:0.8。

作为本发明的副溶血弧菌游离类脂A提取纯化方法的一种优选方案,其中,步骤3中加入的氯仿和水的体积与步骤2中加入的氯仿的体积相等。

作为本发明的副溶血弧菌游离类脂A提取纯化方法的一种优选方案,其中,步骤2和步骤3中所述的高速离心的转速为10000rpm。

本发明的目的之三是提供一种按上述方法提取得到的副溶血弧菌LPS连接类脂A和副溶血弧菌游离类脂A的结构分析方法,包括:

将提取得到的两种类脂A样品分别复溶于氯仿/甲醇的混合液中,然后采用毛细玻璃管点样于TLC(薄层层析检测)薄板上,再将该薄板置于展层剂中,层析20-30min,吹干后用硫酸乙醇喷洒,并在160-170℃下加热,以观察类脂A条带。

作为本发明的副溶血弧菌LPS连接类脂A和副溶血弧菌游离类脂A的结构分析方法的一种优选方案,其中,LPS连接类脂A复溶的氯仿/甲醇的混合液中氯仿和甲醇的体积比为4:1;游离类脂A复溶的氯仿/甲醇的混合液中氯仿和甲醇的体积比为2:1。

作为本发明的副溶血弧菌LPS连接类脂A和副溶血弧菌游离类脂A的结构分析方法的一种优选方案,其中,展层剂由氯仿、甲醇、水和氨水组成,氯仿、甲醇、水和氨水的体积比为40:25:4:2。

本发明的目的之四是提供一种按上述方法提取得到的副溶血弧菌LPS连接类脂A和副溶血弧菌游离类脂A的结构分析方法,包括:

将提取得到的两种类脂A样品复溶于氯仿/甲醇混合液中,进行LC-MS检测。

作为本发明的副溶血弧菌LPS连接类脂A和副溶血弧菌游离类脂A的结构分析方法的一种优选方案,其中,LC-MS检测过程中,在-150V电压下进行ESI/MS、ESI/MS/MS和离子碰撞活化。

与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:

1)在现有提取方法中使用到的有机试剂量很大,本发明提供的方法步骤简单,操作过程对设备要求低,对操作人员要求较低,提取时间缩短,使用到的试剂均为实验室常用试剂且对剂量要求很小,较大程度上避免了使用毒性较高试剂对操作人员的伤害。采用本方法提取的副溶血弧菌类脂A可直接用于TLC检测与质谱分析。

2)不同菌株的细胞膜壁结构以及提取的复杂程度不同,本发明的方法是针对特定的副溶血弧菌开发的游离与非游离类脂A的提取与提纯方法,在提取副溶血弧菌LPS连接类脂A时,加入醋酸钠水解时将pH值调节到2.0-2.5,与此同时,将磁力搅拌时间增长为2.5h,从而实现了副溶血弧菌LPS连接类脂A的高效提取,此外,在提取副溶血弧菌游离类脂A时,本申请创新性的采用极少量的菌体以及少于传统方法约100倍有机试剂(氯仿、甲醇)的量进行副溶血弧菌的游离类脂A的提取,是一种较新且省时省力的提取菌株中游离类脂A的方法。

附图说明

图1为从对比例1-2、4的大肠杆菌W3110和实施例1-2和对比例3的副溶血弧菌ATCC33846中分离出的磷脂和类脂A的薄层色谱图;

图2为从对比例1的大肠杆菌W3110和实施例1的副溶血弧菌ATCC33846中提取的LPS连接类脂A的质谱分析图,其中图2A-副溶血弧菌ATCC33846的LPS连接类脂A质谱及离子峰m/z 1796.23的二级质谱,图2B-大肠杆菌W3110的类脂A质谱及离子峰m/z 1796.21的二级质谱,图2C-与质谱中离子峰对应的LPS连接类脂A的预测结构;

图3为从对比例3的液体培养副溶血弧菌ATCC33846中提取的游离类脂A的质谱分析图,其中图3a-游离类脂A的质谱,图3b-与质谱中离子峰对应的游离类脂A的预测结构;

图4为从实施例2的固体培养副溶血弧菌ATCC33846单菌落中提取的游离类脂A的质谱分析图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明,但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施,本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广,因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次,此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例,也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

实施例中所采用的其他原料如无特别说明均为商业购买。

实施例中所用大肠杆菌W3110公开于“Construction and Characterizationofan Escherichia coli Mutant Producing Kdo2-LipidA”。

实施例中所用副溶血弧菌ATCC33846公开于“Structure analysis oflipid Aspecies in Vibrio parahaemolyticus by constructing mutants lacking multiplesecondary acyltransferases oflipidA”。

实施例1、副溶血弧菌LPS连接类脂A的提取

步骤1:

LB液体培养基组成为:酵母粉5g/L,蛋白胨10g/L,NaCl 10g/L,使用ddH

菌株培养:将副溶血弧菌ATCC33846通过LB液体培养基在37℃下震荡培养至OD

步骤2:

通过4000rpm离心20min收集细胞,使用磷酸盐缓冲溶液冲洗一次,加入30mL氯仿、60mL甲醇、24mL水的混合液悬浮菌体,室温下磁力搅拌2.5h,2000rpm离心20min,弃上清液,收集沉淀加入36mL浓度为12.5mM的醋酸钠溶液,然后采用37wt%的盐酸溶液调节pH值为2,超声10min后100℃下煮沸30min。

步骤3:

待混合液冷却到25℃以下后,加入40mL氯仿和40mL甲醇,上下颠倒5次,然后于2000rpm离心20min,收集下相有机层,吹干后得到副溶血弧菌LPS连接类脂A。

对比例1:本对比例与实施例1的不同之处在于:所用菌株由副溶血弧菌ATCC33846替换为大肠杆菌W3110,步骤2中将pH值调节为4.5。其他步骤及参数与实施例1相同。

实施例2、固体培养副溶血弧菌游离类脂A的提取

步骤1:

LB固体培养基组成为:酵母粉5g/L,蛋白胨10g/L,NaCl 10g/L,琼脂粉15g/1L,使用ddH

菌株培养:将副溶血弧菌ATCC33846通过LB固体培养基在37℃下划线培养48h。

步骤2:

用无菌牙签从平板上刮下单个菌落,并将其加入到含有250μL氯仿、500μL甲醇和200μL水的混合液的Eppendorf试管中,室温摇晃1h,10000rpm离心5min后吸取上清液,将上清液转移到另一个Eppendorf试管中;

步骤3:向混合溶液中加入250μL氯仿和250μL水,将Eppendorf管中的混合物上下倒置10次,摇晃混合后10000rpm下离心5min,将含有脂质的下层有机相收集到新的Eppendorf管中并吹干,得到的样品即为副溶血弧菌游离类脂A。

对比例2:本对比例与实施例2的不同之处在于:所用菌株由副溶血弧菌ATCC33846替换为大肠杆菌W3110。其他步骤及参数与实施例2相同。

对比例3、液体培养副溶血弧菌游离类脂A的提取

步骤1:

LB液体培养基组成为:酵母粉5g/L,蛋白胨10g/L,NaCl 10g/L,使用ddH

菌株培养:将副溶血弧菌ATCC33846通过LB液体培养基在37℃下震荡培养至OD

步骤2:

通过4000rpm离心20min收集细胞,使用磷酸盐缓冲溶液冲洗一次,加入30mL氯仿、60mL甲醇、24mL水的混合液悬浮菌体,室温下磁力搅拌2.5h,2000rpm离心20min,收集全部上清液。

步骤3:

向上清液中加入30mL氯仿和30mL水,上下颠倒5次,然后于2000rpm离心20min,收集下相有机层,吹干后得到副溶血弧菌游离类脂A。

对比例4:本对比例与对比例3的不同之处在于:所用菌株由副溶血弧菌ATCC33846替换为大肠杆菌W3110。其他步骤及参数与对比例3相同。

实施例3、副溶血弧菌两种类脂A的结构分析

将实施例1提取得到的副溶血弧菌LPS连接类脂A与对比例1的产物全部分别复溶于1mL氯仿、甲醇(4:1,V/V)的混合液中。

将实施例2提取得到的副溶血弧菌游离类脂A与对比例2-4的产物全部分别复溶于200μL氯仿、甲醇(2:1,V/V)的混合液中。

采用毛细玻璃管将复溶后的样品点样于Gel 60的TLC薄板上,再将该薄板置于展层剂中,展层剂由氯仿、甲醇、水和氨水(40:25:4:2,V/V/V/V)组成,层析20min,层析结束后吹干薄板,用乙醇、硫酸(9:1,V/V)混合液喷洒,并在165℃下加热显色,结果如图1所示。

非游离类脂A以共价键附着在LPS的多糖上,可通过酸水解释放。大肠杆菌类脂A水解的酸性条件为pH值4.5。然而,副溶血弧菌LPS碎片在pH值为4.5时水解产生的类脂A要比酸性条件(pH值为2.0-2.5)下的类脂A少得多。用薄层色谱法分离对比例1(pH值为4.5时)水解的大肠杆菌W3110类脂A和实施例1(pH值为2.5时)水解的副溶血弧菌ATCC33846类脂A如图1(左侧两条泳道)所示。大肠杆菌类脂A样品只显示一个条带,但副溶血弧菌类脂A样品显示了几个条带,迁移速度与大肠杆菌类脂A相似。这一结果表明,副溶血弧菌ATCC33846中不止一种类脂A附着于LPS的多糖上。

对比例3-4中总脂质直接从大肠杆菌W3110和副溶血弧菌ATCC33846中提取得到,如图1中间两条泳道所示。众所周知,大肠杆菌磷脂主要含有25%的PG和70%的PE。从大肠杆菌W3110中分离的脂质样品在TLC上观察到两条典型磷脂带。从副溶血弧菌ATCC33846中分离的脂质样品中也观察到这两条典型的磷脂带,表明副溶血弧菌ATCC33846具有与大肠杆菌W3110相似的磷脂组成。然而不同的是,只有在副溶血弧菌ATCC33846的样品中观察到与类脂A相似的迁移速度,而在大肠杆菌W3110的样品中没有观察到。这表明该方法能够提取到副溶血弧菌中不附着于LPS的游离类脂A,而对比例大肠杆菌无此现象。

实施例2和对比例2中脂质也直接从大肠杆菌W3110或副溶血弧菌ATCC33846的单个菌落中分离出来,如图1(右侧两条泳道)所示。从大肠杆菌W3110和副溶血弧菌ATCC33846分离的样品中均观察到典型的磷脂条带。然而,只有在副溶血弧菌ATCC33846的样品中观察到与类脂A相似的迁移速度,而在大肠杆菌W3110的样品中没有观察到。副溶血弧菌ATCC33846单菌落中游离类脂A的组成和结构可能与液体培养基中生长的类脂A的TLC板上显示的位置不同。这些波动可能是由于副溶血弧菌在不同培养基或不同环境下生长时的相位变化所致。副溶血弧菌类脂A的数量和结构会因细菌生长环境的不同而受到影响。薄层色谱分析表明,副溶血弧菌类脂A在液体培养基中培养比在固体培养基中培养更多。更重要的是,无论副溶血弧菌细胞在固体培养基或液体培养基中均能产生游离类脂A。

实施例4、副溶血弧菌两种类脂A的结构分析

将实施例1提取得到的副溶血弧菌LPS连接类脂A与对比例1的产物全部分别复溶于1mL氯仿、甲醇(4:1,V/V)的混合液中。

将实施例2和对比例3提取得到的副溶血弧菌游离类脂A全部分别复溶于200μL氯仿、甲醇(2:1,V/V)的混合液中。

将复溶后的样品使用WATERSACQUITYUPLC和SYNAPT Q-TOF质谱仪进行检测,采用ESI离子源,阴离子检测模式,检测范围小于m/z 2500,在-150V电压下进行ESI/MS、ESI/MS/MS和离子碰撞活化,结果如图2-4所示。

用LC-MS分析从实施例1副溶血弧菌ATCC33846中分离的与LPS共价连接的类脂A,如图2A所示。主峰为m/z 1797.25,离子峰m/z 1825.32与主峰相差28amu,即两个亚甲基单位。已有研究表明,类脂A的1位磷酸在脂多糖糖链的去除过程中很容易丢失。m/z 1717.29处的离子峰来源于主峰m/z 1797.25,损失了一个80amu基团,可能是一个磷酸,这说明从核心寡糖中切割类脂A的水解条件较为苛刻,导致1位磷酸的部分损失。离子峰m/z 2052.46比m/z 1797.25大256amu,这表明前者应该是由含有额外3-羟基棕榈酰基脂肪酸链的类脂A产生的。离子峰m/z 2175.51比m/z 2052.46大123amu,说明前者应该是由一个含有额外pEtN基团的类脂A产生的。已有研究表明,副溶血弧菌中类脂A的pEtN修饰是由VP_RS21300编码的酶催化的。离子峰m/z 2074.43和2198.46与m/z2052.46和2175.51分别相差22amu,这一结果表明,m/z 2074.43和2198.46处的离子分别是后者的钠加合物。为了进一步确认对比例1的大肠杆菌和实施例1的副溶血弧菌质谱中离子峰为m/z 1796.3的类脂A的结构,对其进行了MS/MS分析,如图2A和2B所示。从大肠杆菌和副溶血弧菌中分离得到的类脂A在m/z1796.3处的MS/MS模式相似,表明这些类脂A具有相似的结构。预测的各种类脂A衍生物的化学结构如图2C所示。虽然大肠杆菌和副溶血弧菌中离子峰为m/z 1797.22的类脂A分子量相同,但其细节结构略有不同。

对比例3直接从副溶血弧菌ATCC33846中分离得到的总脂质经LC-MS分析如图3a所示。除上述m/z 1797.24和1717.27两个峰之外,还观察到其他离子峰。离子峰m/z 1819.21应该为m/z 1797.24的钠加合物。离子峰m/z 1745.31可能是由另一种类脂A产生,因为它与m/z 1717.27处的峰值相差28amu。离子峰m/z 2035.45和2057.42相差22amu,表明后者是前者的钠加合物。离子峰m/z 2035.45比1797.24大238amu,这表明它可能是在类脂A结构上增加了一条C16:0次级脂肪酸链,如图3b所示。离子峰m/z 1955.48可能是由m/z 2035.45的1位磷酸丢失而产生的。

实施例2从副溶血弧菌ATCC33846单菌落中直接分离的脂质用MS进行分析如图4所示。在这种情况下,主峰在m/z 1955.51处产生。这再次说明副溶血弧菌ATCC33846无论在液体培养基还是固体培养基中均存在游离类脂A,但游离类脂A的组成和结构因生长条件的不同而不同。

应说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

技术分类

06120115687293