一种鉴定PGPR趋化根系分泌物到达根际的趋化速率的方法及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及植物促生根际细菌的趋化物，特别是指一种鉴定PGPR趋化根系分泌物到达根际的趋化速率的方法及其应用。

背景技术

植物通过根系分泌其固定的高达30％的碳，与根际细菌紧密互作。在植物根际生活着对植物生长有促进作用的细菌，称为植物促生根际细菌(plant growth promotingrhizobacteria， PGPR)。微生物肥料(菌肥)中应用的根瘤菌、固氮菌、解磷菌、解钾菌、促生菌和生防菌等，都是PGPR。大量研究表明，使用PGPR菌肥，能够减少化肥用量20％-30％，减少农药用量30％以上，农作物增产10％-80％，在发展可持续农业中的作用越来越受到重视，是实现化肥、农药双减目标的重要途径。

然而，PGPR在实际应用中的使用效果并不稳定，实验室和温室效果明显，大田效果较差，严重制约了PGPR菌剂的推广应用。PGPR能否发挥作用，取决于其能否在与土著微生物竞争中获得优势，从而在植物根际(根周围、根表、根组织)定殖。PGPR在根际定殖的第一步是识别根系分泌物作为趋化物，通过趋化运动到达根际，在根际繁殖并形成菌膜。PGPR 在根际的定殖量与促生效果呈显著正相关。植物根系分泌物包括有机酸、氨基酸、糖类等近百种，其中哪种成分是PGPR根际定殖的强趋化物质呢？许多研究发现，PGPR对苹果酸、草酸或谷氨酸、精氨酸等有强的趋化响应，可能是PGPR根际定殖的关键趋化物质。然而，这些分泌物成分也能吸引土著微生物趋化到达根际定殖，因此，可能并不是PGPR在根际趋化定殖的关键趋化物。在鉴定出根系分泌物中PGPR强趋化物的基础上，应用基因工程技术提高PGPR在植物根际的趋化定殖竞争力，是解决PGPR促生效果不稳定的重要途径。

确定PGPR在根际趋化定殖的关键趋化物常用的方法体外平板趋化和毛细管趋化实验，比较PGPR对趋化物的趋化响应；PGPR在根际定殖实验，比较添加某种根系分泌物对PGPR 在根际定殖量的影响，或构建PGPR某种(些)趋化物趋化受体的缺失突变株，考察这些趋化受体缺失突变株在根际的定殖量和定殖速率。体外平板趋化和毛细管趋化实验条件，与根际定殖条件有很大的不同，得到的结果仅可用作初步筛选。根际定殖实验则是测定PGPR在根际长时间定殖的结果，得到的定殖速率是PGPR趋化到达根际的速率和在根表繁殖的速率的总和，不能区分PGPR趋化到达根际的速率和在根表繁殖的速率。比较PGPR趋化不同趋化物到达根际的速率(简称为趋化速率)才是鉴定PGPR在根际趋化定殖的关键趋化物的金标准；但是现有的方法并不能准确鉴定不同趋化物到达根际的速率，进而鉴定PGPR在根际趋化定殖的关键趋化物。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提出一种鉴定PGPR趋化根系分泌物到达根际的趋化速率的方法及其应用。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种鉴定PGPR趋化根系分泌物到达根际的趋化速率的方法，步骤为：

(1)从微生物基因组的注释中查找该微生物的胞外配体结合域，筛选能够识别胞外趋化物的趋化受体，利用分子对接技术将趋化受体与根系分泌物成分进行分子对接，并计算结合自由能，筛选自由能值低的根系分泌物成分作为候选趋化物；

(2)根据候选趋化物确定与候选趋化物对应的受体蛋白，以微生物的基因组DNA为模板，构建含有受体蛋白的胞外配体结合域片段的表达载体和敲除受体蛋白的重组载体；

(3)将含有步骤(2)的重组载体的大肠杆菌通过接合方法转入微生物中获得趋化受体敲除突变株；

(4)以微生物的基因组DNA为模板，构建步骤(2)中候选趋化物对应的受体蛋白的回补质粒和回补空载质粒，分别转入步骤(3)的趋化受体敲除突变株中，获得趋化受体敲除突变株的回补株和回补空载株；

(5)将微生物、趋化受体敲除突变株、趋化受体敲除突变株的回补株和回补空载株与候选趋化物进行先进行平板趋化实验验证受体蛋白与趋化物的对应性，再利用微环境系统测定微生物、趋化受体敲除突变株和趋化受体敲除突变株的回补株在小麦根际的趋化速率和增殖速率。

进一步的，所述步骤(1)中根系分泌物成分包括氨基酸类、有机酸类和糖类；分子对接通过分子对接软件AutoDock 4.2实现；结合自由能是通过软件Amber17计算的。

进一步的，所述步骤(2)中根据候选强趋化物确定与候选强趋化物对应的受体蛋白是先利用毛细管趋化方法测定微生物趋化阈浓度值，确定该微生物对趋化物的响应强度，再采用荧光热漂移法和平板趋化法进一步鉴定该候选强强趋化物的受体蛋白。

进一步的，采用荧光热漂移法筛选趋化物与受体蛋白的荧光热漂移值高于2.0℃。

进一步的，所述步骤(3)中大肠杆菌为大肠杆菌S17-1。

进一步的，所述步骤(5)中利用微环境系统的具体操作为：

a.向带盖试管中加入接种菌悬液的0.5×MS培养液，并将无菌小麦苗的根茎结合部用滤网固定在液面处；

b.将步骤a处理后的小麦苗样品置于16h光照8h黑暗培养，其中一半小麦苗接菌培养 2h后取出转移至未接种菌悬液的微环境系统中培养，作为转移组，另一半为未转移组；

c.步骤b中的两组麦苗分别在2h、6h、10h、14h、18h、22h、26h、30h、34h和 38h时取样，测定根际定殖的细菌数量；

d.采用Logistic方程拟合细菌在根际的生长动力学方程，并求其一阶导数得到生长速率值，通过计算获得不同接种菌的小麦根际趋化速率和增殖速率。

进一步的，所述步骤a中接种菌指微生物、趋化受体敲除突变株和趋化受体敲除突变株的回补株。

进一步的，所述步骤b中小麦苗样品置于16h光照8h黑暗培养时小麦苗的根部需要遮光处理。

进一步的，所述步骤d中小麦根际增殖速率为转移组生长速率，小麦根际趋化速率为未转移组生长速率与转移组生长速率的差值。

优选的，所述微生物为假单胞菌UW4。

上述方法在鉴定趋化物是PGPR在根际趋化定殖的关键趋化物中的应用，具体方法为：如果趋化受体敲除突变株的趋化速率显著低于微生物和趋化受体敲除突变株的回补株，即可确定该趋化物是PGPR在根际趋化定殖的关键趋化物。

本发明具有以下有益效果：

1、本申请的方法可以实现区分PGPR趋化某种趋化物时的趋化速率和在根表的繁殖速率，通过比较PGPR某种趋化物的趋化受体缺失株与野生型和回补株趋化速率的差异，如果缺失株的趋化速率显著低于野生型和回补株，即可确定该趋化物是PGPR在根际趋化定殖的强趋化物。

2、本申请以假单胞菌UW4为例，首先对假单胞菌UW4趋化受体与根系分泌物成分进行了分子对接和结合自由能分析，发现根系分泌物成分与假单胞菌UW4趋化受体的结合自由能与UW4毛细管趋化根系分泌物成分的趋化阈值的对数呈正相关；进而鉴定了假单胞菌UW4的3个趋化受体，分别是1-氨基环丙烷-1-羧酸趋化受体、半胱氨酸趋化受体和苹果酸趋化受体；再应用微环境系统测定了假单胞菌UW4及其3个趋化受体缺失突变株和回补株趋化定殖小麦根际的趋化速率；最后根据假单胞菌UW4及其3个趋化受体缺失突变株趋化定殖小麦根际的趋化速率，确定了UW4趋化小麦根际的强趋化物是1-氨基环丙烷-1-羧酸。而微生物的趋化物与受体结合自由能、趋化性、生长规律上具有通用性，利用假单胞菌UW4 验证了该方法的通用性及可行性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为假单胞菌UW4族I趋化受体和部分根系分泌物成分的结合自由能与其趋化这些根系分泌物成分的趋化阈浓度的相关性分析。

图2为荧光热漂移反应程序。

图3为趋化受体wp116的受体结合域(LBD)与根系分泌物成分的荧光热漂移分析结果。

图4为趋化受体wp375-LBD蛋白与根系分泌物成分荧光热漂移分析结果；其中ACC：1-氨基环丙烷-1-羧酸；A05：琥珀酸；B09：L-乳酸；B10：甲酸；C03：D,L-苹果酸；C08：乙酸；E02：酒石酸；F02：柠檬酸；F05：富马酸；F07：丙酸；F08：粘酸；F09：乙醇酸 F10：乙醛酸；G07：乙酰乙酸；G11：D-苹果酸；G12：L-苹果酸；H08：丙酮酸。

图5为趋化受体wp616-LBD蛋白与根系分泌物成分荧光热漂移分析结果；其中ACC：1-氨基环丙烷-1-羧酸；A07：L-丙氨酸；A08：L-精氨酸；A09：L-天冬酰胺；A10：L-天冬氨酸；A11：L-半胱氨酸；A12：L-谷氨酸；B01：L-谷氨酰胺；B02：甘氨酸；B04：L-异亮氨酸；B05：L-亮氨酸；B06：L-赖氨酸；B07：L-蛋氨酸；B08：L-苯丙氨酸；B09：L-脯氨酸；B11：L-苏氨酸；B12：L-色氨酸；C02：L-缬氨酸；C03：D-丙氨酸；C04：D-天冬酰胺； C05：D-天冬氨酸；C06：D-谷氨酸；C07：D-赖氨酸；C08：D-丝氨酸；C09：D-缬氨酸。

图6为假单胞菌UW4的3个受体突变株及其回补株和回补空载菌株对1-氨基环丙烷-1- 羧酸、半胱氨酸和苹果酸的趋化反应。

图7为微环境示意图。

图8为假单胞菌UW4、UW4Δwp116、UW4Δwp116+wp116小麦根际最大定殖速率、增殖速率和趋化速率；数据柱上标记的不同大写字母表示差异显著(p＜0.01)。

图9为假单胞菌UW4、UW4Δwp616、UW4Δwp616+wp616小麦根际最大定殖速率、增殖速率和趋化速率。

图10为假单胞菌UW4、UW4Δwp375和UW4Δwp375+wp375小麦根际最大定殖速率、增殖速率和趋化速率。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种鉴定PGPR趋化根系分泌物到达根际的趋化速率的方法，步骤为：

(1)从微生物基因组的注释中查找该微生物的胞外配体结合域，筛选能够识别胞外趋化物的趋化受体，利用分子对接技术将趋化受体与根系分泌物成分进行分子对接，并计算结合自由能，筛选自由能值低的根系分泌物成分作为候选强趋化物；

(2)根据候选强趋化物确定与候选强趋化物对应的受体蛋白，以微生物的基因组DNA 为模板，构建含有受体蛋白的胞外配体结合域片段的表达载体和敲除受体蛋白的重组载体；

(3)将含有步骤(2)的重组载体的大肠杆菌感受态转入微生物中获得趋化受体敲除突变株；

(4)以微生物的基因组DNA为模板，构建步骤(2)中候选强趋化物对应的受体蛋白的回补质粒和回补空载质粒，分别转入步骤(3)的趋化受体敲除突变株中，获得趋化受体敲除突变株的回补株和回补空载株；

(5)将微生物、趋化受体敲除突变株、趋化受体敲除突变株的回补株和回补空载株与候选强趋化物先进行平板趋化实验验证受体蛋白与趋化物的对应性，再利用微环境系统测定微生物、趋化受体敲除突变株和趋化受体敲除突变株的回补株在小麦根际的趋化速率和增殖速率。

进一步的，所述步骤(1)中根系分泌物成分包括氨基酸类、有机酸类和糖类；分子对接通过分子对接软件AutoDock 4.2实现；结合自由能是通过软件Amber17计算的。

进一步的，所述步骤(2)中根据候选强趋化物确定与候选强趋化物对应的受体蛋白是先利用毛细管趋化方法测定微生物趋化阈浓度值，确定该微生物对趋化物的响应强度，再采用荧光热漂移法和平板趋化法进一步鉴定该候选强趋化物的受体蛋白。

进一步的，采用荧光热漂移法筛选趋化物与受体蛋白的荧光热漂移值高于2.0℃。

进一步的，所述步骤(3)中大肠杆菌为大肠杆菌S17-1。

进一步的，所述步骤(5)中利用微环境系统的具体操作为：

a.向带盖试管中加入接种菌悬液的0.5×MS培养液，并将无菌小麦苗的根茎结合部用滤网固定在液面处；

b.将步骤a处理后的小麦苗样品置于16h光照8h黑暗培养，其中一半小麦苗接菌培养 2h后取出转移至未接种菌悬液的微环境系统中培养，作为转移组，另一半为未转移组；

c.步骤b中的两组麦苗分别在2h、6h、10h、14h、18h、22h、26h、30h、34h和 38h时取样，测定根际定殖的细菌数量；

d.采用Logistic方程拟合细菌在根际的生长动力学方程，并求其一阶导数得到生长速率值，通过计算获得不同接种菌的小麦根际趋化速率和增殖速率。

进一步的，所述步骤a中接种菌指微生物、趋化受体敲除突变株和趋化受体敲除突变株的回补株；其中MS培养液配方(mg/L)：硝酸钾1900、硝酸铵1650、磷酸二氢钾170、硫酸镁370、氯化钙440、碘化钾0.83、硼酸6.2、硫酸锰22.30、硫酸锌8.6、钼酸钠0.25、硫酸铜0.025、氯化钴0.025、硫酸亚铁27.8、肌醇100、甘氨酸2、盐酸硫胺素0.1、盐酸盐吡哆醇0.5、烟酸0.5、乙二胺四乙酸二钠37.3。PH值为5.7，常温保存。

进一步的，所述步骤b中小麦苗样品置于16h光照8h黑暗培养时小麦苗的根部需要遮光处理。

进一步的，所述步骤d中小麦根际增殖速率为转移组生长速率，小麦根际趋化速率为未转移组生长速率与转移组生长速率的差值。

优选的，所述微生物为假单胞菌UW4。

以假单胞菌UW4为例，本申请采用的材料如无特殊说明均为商品级购买获得，具体操作如下：

实施例

1、分子对接技术分析根系分泌物成分(趋化物)与趋化受体的结合自由能

以假单胞菌UW4为例，假单胞菌UW4(Pseudomonas sp.UW4)：一种美国农业研究菌种保藏中心保藏编号为NRRL B-50193(保藏日为2008年6月9日)的、可公开获得的常用菌株(美国农业研究菌种保藏中心，英文全称Agrieultutal Research Service CultureColleetion，简称NRRL，该中心位于伊利诺伊州皮契里亚，为一个由美国农业部农业研究中心支持的政府性质的菌种保藏中心)。

该菌基因组中(基因组序列GenBank登录号：CP003880)共注释具有胞外配体结合域能够识别胞外趋化物的族I趋化受体共有15个。选择常见的典型根系分泌物成分59个，其中氨基酸类26个，有机酸类21个，糖类12个。采用分子对接软件AutoDock 4.2对趋化受体和根系分泌物成分进行分子对接，用软件Amber17计算结合自由能。结合自由能值越小，表明受体对趋化物的亲和力越高，趋化响应强度越高。某种趋化物与某趋化受体的结合自由能越低，表明二者可能是配体(趋化物)与受体的关系。

2、趋化物和趋化受体结合自由能与趋化响应强度的关系

根据趋化物和趋化受体结合自由能的大小由低、中和高，从氨基酸类化合物中选取代表性的化合物1-氨基环丙烷-1-羧酸、赖氨酸、苏氨酸、谷氨酸和丝氨酸，从有机酸类化合物中选取代表性的化合物乙醇酸、番石榴酸、丙酸和反丁烯二酸，从糖类化合物中选取半乳糖、鼠李糖、麦芽糖、蔗糖、低聚糖和葡萄糖(表1)，共18种化合物，分别进行毛细管趋化分析，测定假单胞菌UW4趋化阈浓度值。假单胞菌UW4对某种趋化物的趋化阈浓度值，表明该菌对这种趋化物的趋化响应越强。将该18种化合物与假单胞菌UW4族I趋化受体的最低结合自由能的绝对值与UW4毛细管趋化阈浓度值的对数进行相关性分析，呈现出显著的正相关(p<0.0001)(图1)，表明趋化物与受体结合的自由能越低，UW4对趋化物的趋化阈浓度也越低，即UW4的趋化响应越强。

毛细管趋化方法：将液体LB中培养24h的UW4按1:100(v/v)接至TB液体培养基中培养24h，分别取20ml菌液收集菌体，灭菌超纯水洗涤两次后接至两瓶250ml甘油盐培养基(加甘油0.5％、趋化物3.0mM)过夜培养至OD660＝0.3～0.45，收集菌体采用4℃预冷的趋化缓冲液清洗两次后重悬至15ml，分别吸取300ul菌液置于96微孔板每一小孔中。

分别将趋化物配制成5×10

表1假单胞菌UW4族I趋化受体与部分根系分泌物成分的结合自由能及假单胞菌UW4对部分根系分泌物成分的趋化阈浓度

3、选择假单胞菌UW4的候选强趋化物并构建其受体缺失突变株

依据上述趋化物与受体结合的自由能越低，菌株的趋化响应越强的结论，从氨基酸类化合物中选择1-氨基环丙烷-1-羧酸和半胱氨酸、在有机酸类化合物中选择苹果酸为候选强趋化物。由于许多PGPR菌株对糖类化合物的趋化响应较弱，所以不从糖类化合物中选择候选强趋化物。1-氨基环丙烷-1-羧酸与wp116的结合能是-9.51kcal/mol，是所有根系分泌物成分中与受体结合能最低的化合物。半胱氨酸与受体蛋白wp616(GenBank登录号WP_015096616) 的结合能最低，为-7.47kcal/mol。有机酸中苹果酸与受体蛋白wp375(GenBank登录号 WP_015093375)的结合能最低，为-7.29kcal/mol。

为构建候选强趋化物的受体突变株，需要鉴定该3个候选强趋化物的受体。采用荧光热漂移法和平板趋化法鉴定该3个候选强趋化物的受体。

3.1异源表达候选强趋化物受体的配体结合域

3.1.1候选强趋化物受体的配体结合域表达载体的构建

以假单胞菌UW4基因组DNA为模板，引物序列见表2，PCR反应得到候选强趋化物受体的配体结合域DNA片段。PCR反应条件见表3。

表2引物表

下划线序列分别是BamHI和HindIII酶切位点序列

表3PCR反应体系与程序

PCR产物与质粒pET-28a双酶切后酶连，得到3个候选强趋化物受体的配体结合域的表达质粒pET-28a-LBD116、pET-28a-LBD616和pET-28a-LBD375。酶切和酶连反应体系和反应条件见表4、表5。

表4酶切体系与反应条件

表5重组体系与反应条件

3.1.2候选强趋化物受体的配体结合域蛋白表达和纯化

将表达载体pET-28a-LBD116、pET-28a-LBD616和pET-28a-LBD375分别转化E.coliBL21 (DE3)，将验证正确的BL21转化子接种于含100μL/mL Kana抗性的LB液体培养基中，37℃、220rpm摇床培养至OD600为0.5，加入0.3mM的IPTG诱导剂诱导蛋白表达，16℃、180rpm诱导8h。蛋白纯化方法如下：

1)将诱导后的BL21菌液250mL，12000rpm、4℃离心10min收集菌体，弃上清用无菌水重悬冲洗三次，最后用20mL PBS buffer重悬，用1mL一次性使用无菌注射器过滤，防止细胞团堵塞细胞破碎仪(纯化操作均在冰上进行，防止蛋白变性)；

2)用低温超高压破碎仪将重悬过滤后的菌体破碎5次至液体澄清透亮，低温超高压破碎仪压力值设置为1000pa；

3)将破碎后的样品12000rpm、4℃离心20min，取出上清即为粗酶液，沉淀用20mL无菌水重悬；

4)用10mL无菌水清洗预装镍离子蛋白纯化柱；

5)用5mL、20mM咪唑冲洗镍柱；

6)用0.22μm孔径的微孔滤膜将上清过滤，并将过滤后的上清缓慢通过镍柱，收集流穿液并反复上柱3次；

7)用20mM、50mM、100mM、250mM、500mM不同浓度咪唑洗脱镍柱，每个浓度收集10mL，并用核酸蛋白检测仪测定蛋白浓度；

8)用20mM咪唑重生镍柱并用10mL无菌水冲洗镍柱；

9)用5mL 20％乙醇封存镍柱；

10)将上清沉淀和各洗脱浓度样品进行SDS-PAGE检测。

11)将含有单一目的蛋白条带的洗脱液10mL加入超滤管内管中，4℃、4000g离心至内管液体剩余1.5mL；

12)补加无菌水至10mL，4℃、4000g离心至内管液体剩余1.5mL，重复三次；

13)用移液枪吸取内管中浓缩蛋白液转移至离心管中4℃保存。

3.2荧光热漂移分析LBD与根系分泌物成分结合的熔解温度变化值(ΔTm)

使用BIOLOG生态板作为配体，每块平板有95种配体物质和一个阴性对照。使用赛默飞Protein Thermal Shift

表6荧光热漂移反应体系

使用QuantStudio7Flex荧光定量仪器进行荧光热漂移检测，程序设置见图2。

使用Protein Thermal Shift Software 1.3软件分析数据，参数设置ΔTm阈值为2.0℃。wp116 的LBD蛋白与1-氨基环丙烷-1-羧酸、γ-氨基丁酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺酸、L-苯基丙氨酸、L-丝氨酸、γ-羟基丁酸、L-苏氨酸、衣康酸及甘氨酰-L-谷氨酸的ΔTm均大于2.0℃，说明此受体蛋白与以上各配体物质间亲和力较强，尤其与1-氨基环丙烷-1-羧酸反应的ΔTm 值为7.99℃，据此推测wp116应为1-氨基环丙烷-1-羧酸的趋化受体(图3)。

wp375-LBD域蛋白仅与D,L-苹果酸的荧光热漂移值超过了阈值2.0℃，为3.545℃(图4)。说明wp375-LBD域蛋白与D,L-苹果酸亲和力较强，故推测D,L-苹果酸为UW4 wp375受体蛋白趋化受体。wp616-LBD域蛋白仅与L-半胱氨酸的荧光热漂移值超过了阈值2.0℃，为3.15℃(图5)，说明wp616-LBD域蛋白与L-半胱氨酸亲和力较强，故推测L-半胱氨酸为 UW4wp616受体蛋白趋化受体。

3.3假单胞菌UW4趋化受体突变株和回补株的构建

采用双亲本杂交技术构建假单胞菌UW4的3个候选强趋化物受体的突变株。

3.3.1同源重组无痕敲除趋化受体质粒的构建

以假单胞菌UW4基因组DNA为模板，采用受体上下游同源臂引物，引物序列见表7，PCR反应得到3个候选强趋化物受体同源重组敲除的上下游同源臂DNA片段。PCR反应条件见表3。PCR产物与自杀载体pEX18Gm双酶切后酶连，得到3个候选强趋化物受体同源重组无痕敲除趋化受体质粒pEX18Gm-116、pEX18Gm-616和pEX18Gm-375。酶切和酶连反应体系和反应条件见表4、表5。将该3个质粒分别转入大肠杆菌S17-1中。

表7各受体蛋白上下游同源臂及基因表达盒扩增引物序列

注：下划线标注为酶切位点，名称在后面括号中注释。

3.3.2双亲本杂交

将验证正确的含敲除质粒的大肠杆菌S17-1与恶臭假单胞菌UW4按1％(v/v)接菌量分别接至液体LB培养基中，分别置于37℃和30℃摇床，220rpm过夜培养。培养结束后收集1mL S17-1菌液于离心管中(可多做几个平行)，12000rpm离心1min后将上清弃去，用500μL0.85％ NaCl溶液将菌体重悬，12000rpm离心1min后将上清弃去，在该离心管中加入1.5mLUW4菌液，12000rpm离心后弃上清，用500μL 0.85％ NaCl溶液将菌体重悬，重复该步骤5次，最后用100μL 0.85％NaCl溶液将菌体重悬，菌液滴加在平铺于LB固体平板上的硝酸纤维素膜上，30℃恒温静置培养24h。培养结束后用750μL 0.85％ NaCl溶液将菌体从硝酸纤维素膜冲洗下来，将菌液重悬后吸取50μL涂布于含庆大霉素25μg/mL和氨苄100μg/mL的LB固体平板上，置于30℃恒温静置培养12-16h使之发生单交换。

挑取单交换子在液体LB中30℃，220rpm传代培养5h，然后涂布蔗糖含量为10％含氨苄100μg/mL固体LB平板，30℃恒温静置培养24-36h。能够长出的菌落即为双交换子。双交换子即为趋化受体敲除突变株，分别命名为UW4Δwp116、UW4Δwp616和UW4Δwp375。 3.3.3趋化受体突变株的回补株的构建

以假单胞菌UW4基因组DNA为模板，采用受体回补引物，引物序列见表7，PCR反应得到3个候选强趋化物受体的蛋白表达盒。PCR反应条件见表3。PCR产物与广宿主表达质粒pBBR1MCS2双酶切后酶连，得到表达3个候选强趋化物受体的回补质粒 pBBR1MCS2-116、pBBR1MCS2-616和pBBR1MCS2-375。酶切和酶连反应体系和反应条件见表4、表5。将该3个质粒和空载质粒分别转入大肠杆菌S17-1中。采用双亲本杂交法将回补质粒和空载质粒分别转入UW4Δwp116、UW4Δwp616和UW4Δwp375中，命名为UW4 Δwp116-wp116、UW4Δwp616-wp616和UW4Δwp375-wp375，以及回补空载菌株UW4 Δwp116-pBBR1MCS2、UW4Δwp616-pBBR1MCS2和UW4Δwp375-pBBR1MCS2。

双亲本杂交法是：将上述构建好的含回补质粒和回补空载质粒的大肠杆菌S17-1(供体菌)和趋化受体敲除突变株(受体菌)接至液体LB中30℃过夜培养，将培养好的菌液按1％(v/v)接至LB液体中培养3-4h。培养结束后分别收集2mL供体菌菌液于离心管中，12000rpm离心1min将上清弃去，用500μL 0.85％的NaCl溶液重悬菌体，12000rpm离心1min后弃上清，加入2mL受体菌菌液12000rpm离心1min后弃上清，用500μL 0.85％的NaCl溶液重悬菌体，12000rpm离心1min后弃上清，最后用75μL 0.85％的NaCl溶液重悬菌体，将该菌液滴加在硝酸纤维素膜上于LB固体平板上，30℃恒温培养24h。培养结束后用750μL 0.85％NaCl溶液将菌体从硝酸纤维素膜冲洗下来，取50μL重悬后的菌液涂布于含卡那 100μg/mL和氨苄100μg/mL的LB固体平板上，30℃恒温静置培养12-16h。长出的菌落即为趋化受体突变株的回补株和回补空载菌株。

3.3.4趋化受体突变株平板趋化验证

将菌株接种于甘油盐培养基中，28℃、200rpm培养至OD

甘油盐培养基配方：甘油5g(单独灭菌)，K

趋化缓冲液(CMB)：(pH7.0磷酸缓冲液10

细菌趋化培养基：(pH7.0磷酸缓冲液10

假单胞菌UW4及其趋化受体突变株、回补株和回补空载菌株平板趋化结果见图6。3个受体突变株及其回补空载菌株均不能趋化相应的趋化物，而回补株与出发菌株均能够趋化相应的趋化物，表明该3个受体与相应趋化物是受体和配体的关系。

4、假单胞菌UW4及其受体突变株和回补株趋化定殖小麦根际趋化速率的测定

采用微环境系统测定UW4及其受体敲除株和受体敲除回补株在小麦根际的趋化速率和增殖速率。微环境系统是在带盖试管中装有接种菌悬液的0.5×MS培养液，无菌小麦苗的根茎结合部用滤网固定在液面处(图7)，16h光照8h黑暗培养，根部遮光。一半麦苗接菌培养2h后取出转移至未接种菌悬液的微环境系统中培养。两组麦苗分别在2h、6h、10h、 14h、18h、22h、26h、30h、34h和38h时取样，测定根际定殖的细菌数量。采用Logistic 方程拟合细菌在根际的生长动力学方程，并求其一阶导数得到生长速率值。未转移组的生长速率是趋化速率与增殖速率之和，转移组生长速率即是增殖速率，未转移组生长速率与转移组生长速率的差值即是趋化速率。由速率方程可求出最大速率值。UW4-Δwp116的最大趋化速率显著低于UW4和UW4-Δwp116+wp116，UW4的最大趋化速率与UW4-Δwp116+wp116 无差异。三个菌株的最大趋化速率与增殖速率之和及最大增殖速率无差异(图8)。UW4、 UW4-Δwp616和UW4-Δwp616+wp616三个菌株间最大趋化速率与增殖速率之和、最大增殖速率以及最大趋化速率无差异(图9)。UW4、UW4-Δwp375和UW4-Δwp375+wp375三个菌株间最大趋化速率与增殖速率之和、最大增殖速率以及最大趋化速率亦无差异(图10)。表明缺失ACC趋化受体显著降低UW4趋化根际的速率，而缺失半胱氨酸趋化受体和苹果酸趋化受体对UW4趋化根际的速率没有影响，ACC是UW4趋化根际定殖的强趋化物。

MS培养液配方(mg/L)：硝酸钾1900、硝酸铵1650、磷酸二氢钾170、硫酸镁370、氯化钙440、碘化钾0.83、硼酸6.2、硫酸锰22.30、硫酸锌8.6、钼酸钠0.25、硫酸铜0.025、氯化钴0.025、硫酸亚铁27.8、肌醇100、甘氨酸2、盐酸硫胺素0.1、盐酸盐吡哆醇0.5、烟酸0.5、乙二胺四乙酸二钠37.3。PH值为5.7，常温保存。

小麦苗制备：选择饱满无霉点无破损的小麦种子做为实验材料，选取200粒小麦种子在工作台中用无菌水清洗三次，然后用0.1％ HgCl

印记分析：取表面消毒后的种子在无抗LB培养基上放置30s，取走小麦后平板放置在 25℃培养24h，以检验灭菌效果。

微环境建立：将聚氯乙烯材质的滤网剪成20cm长条形状倒U型放入50mL带盖玻璃试管中，加入20mL、0.5×MS培养基制成微环境，将装有MS培养基的试管拧盖(不要拧太死防止热胀冷缩炸瓶)放入灭菌锅121℃灭菌20min，待完全冷却后在超净工作台中用无菌镊子将发芽种子放置在滤网上，根部穿过滤网孔，使液面刚好接触到种子，根部完全浸泡在液面以下。玻璃试管底部用锡纸包裹防止光照。将菌株30℃、220rpm振荡培养至5h至对数生长期，将各菌液用0.5×MS培养基调整OD600至0.5，每个微环境中接入200μL。

根取样与细菌计数：用无菌镊子把植物从微环境中取出，用无菌PBS缓冲液冲洗3次，用乙醇消毒的单面刀去除叶际部分(下胚轴基部以上部分)只留根部分，放置于1.5mL离心管中称重，每个离心管单独称重，总重减去净离心管重得出根重，在1.5mL离心管中加入500μL PBS缓冲液用玻璃微槌把根研磨成匀质，释放定殖在根中的细菌。

取研磨成匀质的液体100μL加入无菌96孔板第一列中，后五列加入180μL PBS缓冲液，用排枪取前一列溶液20μL加入后一列中，并吹打混匀，重复至样品稀释至10

菌落计数：将培养24h后的平板取出，纪录菌落数在3-30之间的样品稀释梯度和菌落数。

实施效果分析

利用本申请的鉴定方法，将假单胞菌UW4基因组中注释的15个具有胞外配体结合域、能够识别胞外趋化物的族I趋化受体与常见的59种典型根系分泌物成分进行了分子对接和结合自由能分析，根据趋化物和趋化受体结合自由能的大小由低、中和高，选择出部分氨基酸、有机酸和糖类共18种化合物，分别进行毛细管趋化分析，发现趋化物与受体结合的自由能越低，UW4对趋化物的趋化阈浓度也越低，即UW4的趋化响应越强。据此筛选出1-氨基环丙烷-1-羧酸、半胱氨酸和苹果酸为UW4的候选强趋化物及其对应的拟趋化受体。通过拟趋化受体配体结合域重组蛋白与根系分泌物成分的荧光热漂移实验分析，该3个拟趋化受体与3 个候选强趋化物的ΔTm值均在所有根系分泌物成分中最高，且均超过阈值2.0℃。构建的UW4 的该3个趋化受体突变株平板趋化均对对应的候选强趋化物无趋化响应，表明该3个拟趋化受体与对应的候选强趋化物为受体与配体关系。应用微环境系统测定了UW4及其3个趋化受体突变株和回补株趋化定殖小麦根际的趋化速率，只有1-氨基环丙烷-1-羧酸趋化受体突变株的趋化速率显著低于UW4，表明1-氨基环丙烷-1-羧酸应是UW4趋化定殖根际的强趋化物。应用能够识别胞外趋化物的族I趋化受体与根系分泌物成分分子对接和结合自由能分析，能够快速简便地鉴定出细菌趋化定殖植物根际的强趋化物。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。