鸡滑液囊支原体蛋白BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体的制备和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及鸡滑液囊支原体蛋白BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体的制备和应用。

背景技术

鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是家禽致病菌中重要的病原体之一，其发病主要感染鸡的呼吸道、关节等部位，发病时可导致宿主生长速度减慢和产蛋量下降等问题，给世界养鸡业造成了巨大的经济损失。并且病原可长期定植于呼吸道，当机体免疫力下降时扩散至全身，并且与其他禽类疾病协同致病，引发更加严重的症状。

目前现有技术中较多的制备鸡滑液囊支原体单克隆抗体，仅仅针对一种特定的蛋白，无法针对鸡滑液囊支原体全细胞起特异性，如论文“温政.鸡滑液囊支原体LP78蛋白单克隆抗体的制备及鉴定[D].山东.山东农业大学2018.06中利用滑液囊支原体上的LP78蛋白作为抗原制备单克隆抗体，但是其免疫反应仅仅针对滑液囊支原体膜表面已知基因序列的LP78蛋白。

发明内容

本发明针对上述现有技术存在的问题，提供鸡滑液囊支原体蛋白BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体的制备和应用，通过大肠杆菌表达鸡滑液囊支原体蛋白BMP、RS01790、RS00275；制备多克隆抗体；通过ELISA检测多克隆抗体效价，通过Western blot检测多克隆抗体特异性；应用Western blot和免疫荧光实验检测蛋白BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体与鸡滑液囊支原体的特异性反应。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的，鸡滑液囊支原体蛋白，所述鸡滑液囊支原体蛋白为BMP、RS01790或RS00275；所述鸡滑液囊支原体蛋白BMP优化基因如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列，鸡滑液囊支原体蛋白RS01790优化基因如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列,鸡滑液囊支原体蛋白RS00275优化基因如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；所述鸡滑液囊支原体蛋白BMP氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，鸡滑液囊支原体蛋白RS01790氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示,鸡滑液囊支原体蛋白RS00275氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

鸡滑液囊支原体蛋白制备多克隆抗体的方法，所述方法步骤如下：

步骤S1：利用BMP、RS01790、RS00275三个蛋白的基因分别构建表达菌株BL21(pET28a-BMP)、BL21(pET28a-RS01790)、BL21(pET28a-RS00275)；

步骤S2：分别对步骤S1中三种表达菌株进行纯化与鉴定得到蛋白BMP、RS01790、RS00275；

步骤S3：将纯化的蛋白BMP、RS01790、RS00275稀释，与等体积的QuickAbody-Mouse3W佐剂混合，分别在小鼠腿部肌肉内进行免疫，小鼠被饲养在常规动物设施中，自由饮水和进食，最后一次免疫后一周，从免疫小鼠中采集血样离心，得到BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体。

优选的，所述步骤S1具体如下：将鸡滑液囊支原体蛋白BMP、RS01790、RS00275的基因分别进行大肠杆菌密码子优化以及替换终止密码子TGA为TGG；将优化后的基因插入表达载体pET28a分别获得重组表达质粒pET28a-BMP、pET28a-RS01790、pET28a-RS00275；随后将重组表达质粒转化至工程菌大肠杆菌BL21中，挑取单克隆株，通过PCR和测序鉴定，获得三种蛋白的原核表达菌株BL21(pET28a-BMP)、BL21(pET28a-RS01790)、BL21(pET28a-RS00275)。

优选的，所述步骤S2具体如下：将BL21(pET28a-BMP)、BL21(pET28a-RS01790)、BL21(pET28a-RS00275)接种含有卡那霉素的液体LB培养基中，其中卡那霉素的浓度为25μg/L，37℃震荡培养至OD

优选的，步骤S3中所述小鼠为雌性6周龄BALB/c小鼠。

优选的，所述步骤S3中将纯化的蛋白BMP、RS01790、RS00275稀释，与等体积的QuickAbody-Mouse3W佐剂混合，分别在小鼠腿部肌肉内进行免疫，三只免疫小鼠使用的剂量均为50μg/只。

优选的，所述步骤S3中在小鼠腿部肌肉内进行免疫两次，第一次与第二次免疫间隔2周。

优选的，所述步骤S3中从免疫小鼠中采集血样37℃温箱放置2h后离心，离心条件为3000rpm/min,15min。

BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体在鸡滑液囊支原体的检测中的应用。

本发明具有以下有益效果：本发明公开了鸡滑液囊支原体蛋白BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体制备和应用。结果显示制备的多克隆抗体具有特异性和较高的抗体效价，并且可以应用于Western blot和免疫荧光实验。Western blot检测鸡滑液囊支原体蛋白BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体与鸡滑液囊支原体具有良好的反应性，免疫荧光检测蛋白BMP、RS01790、RS00275可以在鸡滑液囊支原体细胞膜上表达。本发明提供的BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体对鸡滑液囊支原体的检测及相关研究工作具有重要意义，具有较大的市场应用潜力和潜在的经济效益。本发明提供的BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体可用于检测鸡滑液囊支原体与蛋白BMP、RS01790、RS00275的功能机制研究。

附图说明

图1，BL21(pET28a-BMP)、BL21(pET28a-RS01790)、BL21(pET28a-RS00275)的菌液PCR鉴定。

图2，BMP、RS01790、RS00275蛋白纯化SDS-PAGE鉴定。

图3，BMP、RS01790、RS00275蛋白Western blot鉴定。

图4，Western blot检测BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体特异性

图5，Western blot检测BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体与鸡滑液囊支原体反应

图6，免疫荧光检测BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体与鸡滑液囊支原体反应

具体实施方式

实施1蛋白BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体制备

1.1表达菌株BL21(pET28a-BMP)、BL21(pET28a-RS01790)、BL21(pET28a-RS00275)的构建

对三个蛋白的基因进行大肠杆菌密码子优化，并将序列中终止密码子TGA替换为TGG，将优化后的序列见SEQ ID NO.1-3，将优化后的基因插入表达载体pET28a形成重组表达质粒pET28a-BMP、pET28a-RS01790、pET28a-RS00275。随后将重组表达质粒转化至工程菌大肠杆菌BL21中，挑取单克隆株，通过PCR和测序鉴定，鉴定均正确的克隆株为阳性克隆株，命名为BL21(pET28a-BMP)、BL21(pET28a-RS01790)、BL21(pET28a-RS00275)。PCR结果如图1所示，pET28a通用T7引物(SEQ ID NO.7：F:5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3',SEQ ID NO.8:R:5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3')扩增出符合预期大小的片段证实成功获得三种蛋白的原核表达菌株。

1.2蛋白BMP、RS01790、RS00275表达纯化与鉴定

将BL21(pET28a-BMP)、BL21(pET28a-RS01790)、BL21(pET28a-RS00275)和BL21(pET28a)接种含有卡那霉素的液体LB培养基中，其中卡那霉素的浓度为25μg/L，37℃震荡培养至OD

1.3蛋白BMP、RS01790、RS00275鼠源多克隆抗体制备

将纯化的蛋白BMP、RS01790、RS00275质稀释至1mg/mL，与等体积的QuickAbody-Mouse3W佐剂(购买于博奥龙公司)混合，在雌性6周龄BALB/c小鼠腿部肌肉内免疫两次(每只小鼠50μg)，第一次与第二次免疫间隔2周。雌性BALB/c小鼠被饲养在常规动物设施中，自由饮水和进食。最后一次免疫后一周，从免疫和未免疫小鼠中采集血样37℃温箱放置2h后离心(3000rpm/min,15min)，分离抗重组蛋白小鼠血清和未免疫小鼠血清通过间接ELISA测定其抗体滴度。实施2蛋白BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体效价与特异性检测

2.1ELISA方法检测蛋白BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体效价

使用0.1M碳酸钠缓冲液(pH 9.6)稀释蛋白BMP、RS01790、RS00275至0.5μg/ml，包被微滴定板在4℃下过夜。用含有0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤平板5次。用5％脱脂乳37℃封闭3h，PBST洗涤平板5次后加入PBST稀释的蛋白BMP、RS01790、RS00275多抗血清(1:1000至1:1080000)100μL在37℃孵育2h。PBST洗涤平板5次后，每孔加入100μL HRP标记的山羊抗鼠IgG(稀释至1:8000)，并在37℃下孵育1.5h。添加100μL TMB显色15分钟后，用50μL 2M H

2.2Western blot方法检测蛋白BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体特异性

通过Western blot方法检测BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体与重组蛋白反应。将10μg纯化的重组蛋白或10μg BL21(pET28a)样品进行SDS-PAGE，然后转移到PVDF膜上。一抗用BMP、RS01790、RS00275重组蛋白免疫的小鼠血清(1:1000)孵育，二抗用HRP标记的山羊抗鼠IgG(1:5000)孵育。结果如图4所示，BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体可以与重组蛋白发生特异性反应，而与BL21(pET28a)样品不发生反应。Western Blot试验验证BMP、RS01790、RS00275阳性血清特异性较好，表明鸡滑液囊支原体蛋白BMP、RS01790、RS00275具有免疫原性。

实施3蛋白BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体与鸡滑液囊支原体反应性检测

3.1Western blot检测蛋白BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体与鸡滑液囊支原体全细胞具有特异性反应

通过Western blot方法检测蛋白BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体与鸡滑液囊支原体全细胞的反应。将10μg鸡滑液囊支原体全细胞样品进行SDS-PAGE，然后转移到PVDF膜上。一抗用蛋白BMP、RS01790、RS00275多抗血清(1:1000)孵育，二抗用HRP标记的山羊抗鼠IgG(1:5000)孵育。结果如图5所示，蛋白BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体可以与鸡滑液囊支原体全细胞发生特异性反应。

3.2免疫荧光检测蛋白BMP、RS01790、RS00275可在鸡滑液囊支原体表面表达

使用免疫荧光法测定蛋白BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体与鸡滑液囊支原体全细胞的特异性反应。收集50mL处于对数中期生长阶段的鸡滑液囊支原体培养物，洗涤并重新悬浮在含有2％(w/v)BSA的PBS缓冲液中，并在37℃孵育1h。离心后与蛋白BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体(PBST中稀释1:100)在37℃恒温箱孵育1小时。将鸡滑液囊支原体样品与山羊抗小鼠FITC标记的IgG抗体(PBST中稀释1:500)在37℃恒温箱孵育1小时。洗涤后，将鸡滑液囊支原体样品铺展到载玻片上并通过荧光显微镜观察。免疫荧光结果如图6所示，在鸡滑液囊支原体的表面可以观察到明显的荧光信号，蛋白BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体与鸡滑液囊支原体全细胞的特异性反应，并可以用于免疫荧光实验。结果还证明蛋白BMP、RS01790、RS00275可在鸡滑液囊支原体表面表达。

SEQ ID NO.1

ATGAAGAAGAAGTTCATCCTGCCGATTATTATTACCCCGATTGCAGCCACCGCCATTATTGCAACCGCCTGCGGTGATCAGAGTGAAGCCCAGAAACCGAGCGGTTGGATTCCGAAAGAAGAACGTGTTGCCCAAATTAAAACCGTTGATCTGACCAGCGTTAAAGAAGAAGCACGTAGCCAGAAATATGTTCTGATTACCGATAAAGGTGATGTGCATGATAAAAGTTTTAACCAGAGTAGCTGGGAAGCCCTGAATCAGCTGTATGATCAGACCGGCGCCGAAGTTAATTTTATTCAGCCGAGCACCGAAAATTATACCCAGGCCTATAATCAGGCACTGAGCCAGGGTTATACCGTGTGGATTCTGAGTGGCTTTACCCATAGTGCAAGTCTGAAAAGCTTTATTGAGCAAAATTACCAGACCCTGGTTGATCGCAAAATTCAGATTATTGGCGTGGATTTTAGTCTGACCGGTGCCAATGCACTGAGTAAGCAATATCCGTATTTTTTTGGTCTGCTGTTTAAATTTGACCAGAGCGCCTGGATTGTGGGTTATGCAACCGCCAAATATCTGGCATATAAATATCCGAATGACGCAGATAAACGTATTGTGGCCAGTTTTGCAGGTGGCGATAATGTTGGCACCACCCGCTTTAATACCGGTTTTGCAAAAGGCGTGCTGGCATATAATCAGGACCCTAAAAATACCGTTAAAGTTAAGCATCAGTTCCCGGTTCCGCTGGATAGTGGTTATGAAACCAATGAAAAAATGCAGACCGTTATTACCAGCGTGCTGAGTGGCCAGTATGGTAAAACCCCGACCGTTGTTCTGCCGGTTGCAGGTCCGGCCACCGGTGAAGTTCTGAATGCCTATGCCCGTAGTCAGGCCAATGCAGATAAACTGGTTATTGGCGTTGATGTTGATCAGAGCCTGAGCTATCCGGATAAAGCAGGCAAATTTCTGACCAGCATTACCAAAAATATCGCCCAAGCAGAATATGATATTATGACCGAAATTCTGCTGAGCGCAAAAAATAGCCGCGAAAATAAATTTCTGGTGGGTCATGATAAAAGCAAAACCTTTACCCTGGAAGGCACCTTTGCCCAAGGCTGGGCCGGCTTTACCAAAAGCCATCTGACCAATGCCGCAGATCGTGCAAAAATGGATCAGTTTCTGACCGATGCAGAAAATCTGTTTAAAAGCAAAAGTCAGGCCTTTGTGGATTATATTAGTGATGATAGTAAGGCAACCGAAGGCGGCCAGCAGAGTTATACCACCGTTACCGATCTGCTGAAAGCCGTGACCGATCTGATTAATCAGACCAATACCACCCAGCAGTAA。

SEQ ID NO.2

ATGAAGCTGAGCAAAAAATTCCTGCTGATTGGCAGTGCCCTGAGCGCCGCCGCCGTGCCTGTTATTGCCATTAGCTGCGGTGGCCAGAGTGAAAGTGAGCAAGATAAAAAAGTTAAGGCCCTGGTGGCAAAAATGGAAGCAGATGCCAAAGCCGTTGCACTGAAAACCACCCTGGAAGGCTATAGCAAAGATAGTATGATTATTCTGAGCAATAAGGCCGAAGCCAAAGAAGGCAGTGAACTGCTGATTAAAGCATTTAATCAGTTTTACGGTACCAATCTGAGCATTGTTCAGGTTGGCGGTAGCGAAAATTATCAGACCACCCTGAAAAATCGTTTTGCAGCAGGTCCGGGTCAGATTCTGCTGGTGGGCGCCGAAAGCCAGAGTGCATTTGGTGATATTAATAGTAATCTGGTGAATACTGACGCCAAAACCTTTCTGAATATTACCGATACCAGTAAAACCTTTGATAATATTGTGCTGGGCGATAAGCATTTTATGCCGCAGAGTCGCGAAGCCTATGGTGTTATTTATAATAAAAAGAACTTCGCCGACGCAAAAATTACCGTGTTTGAAGGTAAAAGCTTTAGTGCAAGTCCGAAAACCGGTCTGAATCTGACCAAACCGGAAAAATATGATGGCACCGTTAAAATGGGTGATAATCTGTATGTGTTTGCCGCCGATCTGACCGTTGATGGTTATAAAGTGATTAAAGCCCAGCTGGCCGAAAAACTGCCGACCAAGCAAGTGTTTTATAGCACCATTAAAGCCGGCAAAAGCGATATTTGGCCGATTACCAATCATCTGCTGCAGGCAGCAATTGTGAGCGCAAATCTGGGTACCAAAGGTGTTGGCAGTCCGGAATATACCAAACTGGTTGCCAAAATGAAAGATAAAACCAAAACCGCCGAATGGCTGAATGAAGCAGTGGCCAAAAGCCTGAAAGATGCCCTGGATGTTTATGGCTATAGCGATCCGAAAAATAGCGATCAGAATAAAGTGGTTAACTCTAGCAGCCTGATTGCACTGGGCACCGTGAGCATGGTTCAGAATGGCACCTGGGCACTGAGCCAGATTAGCGATACCCTGGAAGGTGAAGTGAAAGATCTGGTTGGCTTTCTGCCGGTGCCGACCCCGAATAAAACCACCGGTAAACTGCCGCTGTTTGCCGGTGCAAGTCAGCGTTGGGCCGCCACCACCCTGGCCAATGATGAAGCCAAAAAAAAAACCGCCCAACTGTTTCTGCGTTTTATTTATCAGACCAATAGTGGCGTTACCAATCTGGGTAATCTGCTGGGCAGCCTGAGTCCGTATAGTGTTAGTAATCTGGGCGAAATTAAAAGCAATAATGAACTGTTTGACTCCGTTTTTAACTATGGTGATGAAAGTGTGGATAGTTGGATTCAGGCCCATCTGGTGAAAAATTTTAATAATGATAGCGAGGAGCTGGTTACCCTGTTTAATCAGGGTCTGCCGGGCACCGATGCAGAAGTGGCAAAAAAACTGCAGGATATTTATAATCGTCTGCTGGATCAGTTTGTTGATCGCAGCTAA。

SEQ ID NO.3

ATGAAGAAGTTCGAATTCCTGCTGCTGGGTAGCGCCACCCTGCCGCTGATGGCAGTTGCCGCCGCATGCGGTGCCCAGCAAGAAAAAGTGAAAGAACCGGATTTTGTTCATGAAACCCTGACCGATGCCGAAAAAACCGCATTTCAGAGTGCAGTTGGCAGTAATCTGCGTACCATGGGCCGTATGCGCCTGGTTGTTCGTGCCGCACTGGTTAATAATGATAAAACCCTGGTGAGCCGCTTTACCACCCTGGCAGGCGAAGATGCAACCAAAAAAGCAGCCGTTGAAACCTTTAAAACCGAATGGACCGGTAAATGGGGCGCCCTGTTTGGTACCCTGAGCGATGGCGATAAAAATGTGTTTAGCGGTGAAAATAAGTACGCCAATGGTACCGCCACCCTGGCAGAATATCAGGCCCTGAAAACCGCCTTTACCGAAAAAGCCAAAGATCTGCTGGCAAGTGTGGCCAAAGTGGTGAAAGCCCTGGGTCTGGGCGATCTGAGTGATGATTATAAAACCTATCTGGATAGTGCCAATGTGAGTGCACTGCAGACCCGCTTTAATTATACCGGTGCACTGGTGCCGAATAGTAGCACCCTGAATGATTTTGAACGTTTTCTGGAAAGCATTGTGGGTGAAGATACCAGTAAAGATCAGAGCAATCCGACCCCGACCGGCAATATGGTTACCGTTCTGAGTGGTCTGGAAGATAATGCCGTTTTTAGCAAAACCGTGATGAGTCTGGTGGCCCTGCTGACCGATCGCATGGTGCGCCTGGTGGAAGGTGCAGAAGCAGCAAAAGTGCTGGTGAGTACCGGTACCGCAACCGCCGAAGCAGCCAAAGAAACCTATCTGGCACTGCGCAAATATGATAAATGGCCGGCCAGCACCCTGAAAACCCGTGGCGCAGCACTGAGCACCCCGGTTCAGGCACTGGGCCCGGTTCTGAAAAATGTTGAAACCGTGCTGAGCCCGCTGTTTGCAGAAGGCGGTAAAGGCAAAAGCCTGGTTGATACCCTGAAAGCCAAAGAAAGTAAAACCGATAAAGAAACCATGCTGCTGAGTCGTCTGGAAAGTCTGGCAAATCTGGCCAAAGCCAATAGTGAACTGGAAAAACTGAGCAGTCTGGTTTATAAAGATGGCGTGGCACTGGATTATGAAGCCGCCGTTCTGAAAAGTGTTAAAACCTATGCCGATTTTTACGCCAAAGTTGGTCTGAGTTGGCAGTGGGCCCTGAATGTGCTGCTGTGGGCCAATCCGGCCAAAGATTTAGTTACCTATTTTACCGCAAGTGGTCTGGCAGATAAATTTGCCGATAAAAAAGCAGATGTTGAAGCCGTTGTTGCCGAAGTGACCAAACTGAATGTTGCCGCAACCCTGGCCAATTTTGATAAATTTAAAGCCGCCGGCGATACCCTGAATCTGGGCCTGTTTAATCAGAAAGCACGTGCACTGACCAGCCATCTGCAGGCAATGCTGGCAGCCACCAAAAAATAA。

SEQ ID NO.4

MKKKFILPIIITPIAATAIIATACGDQSEAQKPSGWIPKEERVAQIKTVDLTSVKEEARSQKYVLITDKGDVHDKSFNQSSWEALNQLYDQTGAEVNFIQPSTENYTQAYNQALSQGYTVWILSGFTHSASLKSFIEQNYQTLVDRKIQIIGVDFSLTGANALSKQYPYFFGLLFKFDQSAWIVGYATAKYLAYKYPNDADKRIVASFAGGDNVGTTRFNTGFAKGVLAYNQDPKNTVKVKHQFPVPLDSGYETNEKMQTVITSVLSGQYGKTPTVVLPVAGPATGEVLNAYARSQANADKLVIGVDVDQSLSYPDKAGKFLTSITKNIAQAEYDIMTEILLSAKNSRENKFLVGHDKSKTFTLEGTFAQGWAGFTKSHLTNAADRAKMDQFLTDAENLFKSKSQAFVDYISDDSKATEGGQQSYTTVTDLLKAVTDLINQTNTTQQ。

SEQ ID NO.5

MKLSKKFLLIGSALSAAAVPVIAISCGGQSESEQDKKVKALVAKMEADAKAVALKTTLEGYSKDSMIILSNKAEAKEGSELLIKAFNQFYGTNLSIVQVGGSENYQTTLKNRFAAGPGQILLVGAESQSAFGDINSNLVNTDAKTFLNITDTSKTFDNIVLGDKHFMPQSREAYGVIYNKKNFADAKITVFEGKSFSASPKTGLNLTKPEKYDGTVKMGDNLYVFAADLTVDGYKVIKAQLAEKLPTKQVFYSTIKAGKSDIWPITNHLLQAAIVSANLGTKGVGSPEYTKLVAKMKDKTKTAEWLNEAVAKSLKDALDVYGYSDPKNSDQNKVVNSSSLIALGTVSMVQNGTWALSQISDTLEGEVKDLVGFLPVPTPNKTTGKLPLFAGASQRWAATTLANDEAKKKTAQLFLRFIYQTNSGVTNLGNLLGSLSPYSVSNLGEIKSNNELFDSVFNYGDESVDSWIQAHLVKNFNNDSEELVTLFNQGLPGTDAEVAKKLQDIYNRLLDQFVDRS。

SEQ ID NO.6

MKKFEFLLLGSATLPLMAVAAACGAQQEKVKEPDFVHETLTDAEKTAFQSAVGSNLRTMGRMRLVVRAALVNNDKTLVSRFTTLAGEDATKKAAVETFKTEWTGKWGALFGTLSDGDKNVFSGENKYANGTATLAEYQALKTAFTEKAKDLLASVAKVVKALGLGDLSDDYKTYLDSANVSALQTRFNYTGALVPNSSTLNDFERFLESIVGEDTSKDQSNPTPTGNMVTVLSGLEDNAVFSKTVMSLVALLTDRMVRLVEGAEAAKVLVSTGTATAEAAKETYLALRKYDKWPASTLKTRGAALSTPVQALGPVLKNVETVLSPLFAEGGKGKSLVDTLKAKESKTDKETMLLSRLESLANLAKANSELEKLSSLVYKDGVALDYEAAVLKSVKTYADFYAKVGLSWQWALNVLLWANPAKDLVTYFTASGLADKFADKKADVEAVVAEVTKLNVAATLANFDKFKAAGDTLNLGLFNQKARALTSHLQAMLAATKK。