花生种皮颜色调控相关基因AhPSC1及其相关应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种花生果实种皮颜色调控相关基因AhPSC1、编码蛋白、引物及其相关应用。

背景技术

花生又名落花生、长生果、其全身都是宝。花生（Arachis hypogaea L.）是一种经济上重要的豆科作物，在全世界100多个国家种植，2021年总产量为5,392万吨，面积3,272万公顷（FAOSTAT 2021）。花生种皮富含各种营养成分，如维生素B1、B3、B9和E、生物素、白藜芦醇、异黄酮、植酸和原花青素等。种皮颜色是一个重要的质量特征，如白色、粉色、红色、紫红色、黑色和混合色影响商品价值。特别是颜色越深，种皮中含有的抗氧化剂就越多。花青素是植物中重要的植物色素，不仅发挥着重要的生理功能，而且具有很强的抗氧化能力和重要的营养价值。尤其是颜色越深，种皮中含有的抗氧化剂就越多。花青素是植物中重要的植物色素，不仅发挥着重要的生理功能，而且具有很强的抗氧化能力和重要的营养价值。重要的是，高花青素品种已经成为水稻、玉米和小麦育种的重要方向之一。因此，培育种皮颜色不同的花生新品种将具有更高的经济价值和更广阔的市场前景。

花生的种皮颜色是花生的一个重要性状，如白色、粉红色、红色、深紫色和黑色。花青素的含量和组成是决定板栗颜色的重要因素。在高等植物中，花青素有六种，分别是飞燕草苷、花青素、天竺葵苷、芍药苷、矮牵牛花苷和锦葵苷。不同花色花生的花青素种类和含量存在显著差异，其中飞燕苷、花青素和天花苷的含量被认为与花色密切相关

在花青素生物合成过程中会受多种因素的调控，如液泡ｐＨ值、温度、光照等环境因子对花青素最终成色的影响，但是起决定性作用的是代谢途径中的结构基因和调控因子及其相互之间的作用关系。并且，花生的种皮颜色在苗期是无法观察到的，在苗期很难通过检查芽或叶的外观对种皮颜色进行初步选择。揭示控制红色种皮的遗传机制和开发其紧密联系的分子标记将有助于我们提前识别种皮颜色，加速红色种皮花生栽培品种的育种进程。在过去的100年里，为了提高对决定花生种皮颜色的遗传的理解，已经进行了大量的研究。

Zhao使用QTL-seq方法将控制种皮颜色的

发明内容

本申请通过提供一种花生果实种皮颜色调控相关基因

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

第一方面，提供一种果实种皮花青素调控相关基因

（1）如SEQ ID NO.1所示的基因组核苷酸序列；

（2）如SEQ ID NO.2所示的CDS核苷酸序列；

（3）如SEQ ID NO.2所示的核酸序列衍生的具有同等功能的核酸序列。

第二方面，本发明提供了一种果实种皮花青素调控相关基因

（1）如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；

（2）在SEQ ID NO.4所示的核酸序列的基础上进行一个或多个核酸的添加、删除或替换而获得活性片段或保守性变异体的序列。

第三方面，本发明提供了一种果实种皮花青素调控相关基因编码的AhPSC1蛋白，其特征在于，氨基酸序列为系列序列之一：

（1）如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；

（2）在SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的基础上进行一个或多个氨基酸的添加、删除或替换而获得活性片段或保守性变异体的序列。

第四方面，本发明提供了一对用于检测果实种皮花青素调控相关基因AhPSC1的引物，其特征在于，所述引物对的引物核苷酸序列为：

AhPSC1-1F：5’- ATGGCTGACGATGAGGAT -3’ （SEQID NO.5）；

AhPSC1-1R：5’- TCTTAGAAGTGCTCCTCCGTAG -3’ （SEQID NO.6）。

第五方面，本发明提供了一种含有果实种皮花青素调控相关基因

进一步地，该表达载体或重组菌或表达盒，其特征在于通过将核苷酸序列插入pCAMBIA1300-GFP过表达载体中获得。

第六方面，本发明提供了含有果实种皮花青素调控相关基因

第七方面，本发明还提供了果实种皮花青素调控相关基因

进一步地，所述植物育种为培育果实种皮花青素含量增加的转基因植物。

更进一步地，所述植物为花生，所述果实种皮花青素含量增加在花生种皮上表现为紫红色。

第八方面，本发明提供了一种花生果实种皮花青素调控相关的SNP分子标记AhPSC1-203在植物分子标记辅助选择育种中的应用，含有所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，SEQ ID NO.2所示序列自5’端起第203位碱基为SNP位点，所述SNP位点为G或A。

进一步地，所述SNP 位点的碱基为A 的为果实种皮花青素含量高表型，SNP 位点的碱基为G 的为果实种皮花青素含量低表型。

进一步地，所述果实种皮花青素含量高表型在花生种皮上表现为紫红色，所述实种皮花青素含量低表型在花生种皮上表现为粉色。

第九方面，本发明提供了一种果实种皮花青素调控相关的SNP分子标记AhPSC1-203在植物果实种皮中花青素含量高低鉴定的应用。

第十方面，本发明提供了一种引物对，其特征在于，所述引物用于扩增和/或检测权利要求1所述的果实种皮花青素调控相关的SNP分子标记AhPSC1-203，所述引物对的引物核苷酸序列为：

AhPSC1-SNPF: 5’- CTTAAGTTGGGTTTTAGACTTTA-3’ （SEQID NO.7）；

AhPSC1-SNPR: 5’- ATCGTCCAGAGCATATTTGATGCAG-3’ （SEQID NO.8）。

第十一方面，本发明提供了一种用于鉴定果实种皮花青素调控相关的SNP分子标记的试剂盒，包含上述的引物对。

第十二方面，本发明提供了一种使用上述引物对和/或含有所述引物对的试剂盒在植物分子标记辅助选择育种中的应用。

进一步地，所述应用为在植物果实种皮中花青素含量鉴定的应用。

进一步地，所述植物为花生。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：

1. 本发明首次公开、并确认了一种可以应用于植物新品种培育的新的果实种皮花青素调控相关的基因，命名为AhPSC1，该基因位于花生03染色体上，CDS序列长度为1401bp，包含7个外显子，其表达的蛋白长度为466个氨基酸。

2. 本发明通过对紫红色和粉色种皮花生的基因序列比对，定位了花生果实种皮颜色调控相关基因AhPSC1，明确了AhPSC1的DNA序列，CDS序列和编码蛋白序列通过调控花青素含量影响花生果实种皮的颜色，为花生育种的应用实践打下基础。

3 本发明首次公开并确认了一种果实种皮花青素调控相关的基因SNP位点，命名为AhPSC1-203。并明确了AhPSC1-203位点在AhPSC1基因的cDNA序列5’端起第203位碱基上。

4. 本发明通过将AhPSC1基因及其相关SNP位点应用于模式生物拟南芥中，有助于揭示植物果实种皮中花青素调控的分子遗传基础。对利用基因工程技术提高植物果实，尤其是花生快速高效培育富含花青素的深色种皮的品种起到重要作用，对于植物的新种质资源开发提供新技术支持。

附图说明

图1为ND_F和ND_Z的特征；其中，图1a为ND_F和ND_Z种皮颜色表征，图1b为ND_F和ND_Z的花青素含量；误差条表示3个生物重复的标准偏差。** P<0.01 (双尾t检验)；

图2为AhPSC1基因特征及AhPSC1-203位点的G/A群体特征；

图3为AhPSC1在花生材料中不同植物体部位的表达水平；

图4为野生型（WT）与表达AhPSC1基因的拟南芥种皮颜色表征对比以及花青素质量检测；其中图4a为种皮颜色表征对比，图4b为花青素质量检测；显著差异采用单向方差分析(ANOVA)进行评估，随后进行事后Tukey’s多重比较检验，并在每个柱状图上方用小写字母表示。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。引物合成及测序工作均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

实施例1：花生果实种皮颜色和花青素调控相关基因AhPSC1的获得。

正向遗传学结合基因工程进行花生果实种皮颜色调控相关基因挖掘，具体如下：

（1）为了确定控制花生果实种皮颜色和花青素调控相关基因，我们选择ND_F（粉红色种皮）作为母本，ND_Z（紫红色种皮）作为父本进行杂交。如图1所示，ND_Z种皮中含有0.6mg/g花青素，而ND_F种皮中只有0.2 mg/g的花青素，与现已发现的控制紫红色种皮颜色的基因相比，如表一所示，这两个材料是一个新的突变位点。花生的种皮是由胚珠的珠被发育而成的，所以80个F

表1 ND_F和ND_Z材料特异性鉴定

（2）为了进一步对目的基因进行精细定位，我们在候选区间内继续开发了更加精密的分子标记InDel 52、InDel 32、InDel16、InDel 60、InDel 70、InDel 48、SNP_7J、InDel49和InDel 51，之后利用这些分子标记对F

（3）为验证上述ND_F和ND_Z种皮颜色的差异是否由基因

具体步骤如下：

1.1 DNA的提取

利用CTAB法分别提取ND_F和ND_Z的DNA。

1.2 总RNA提取及cDNA第一条链的合成

不同花生组织的RNA提取使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的RNA常温提取试剂盒（RC411, 诺唯赞，南京，中国），分别提取ND_F和ND_Z的总RNA。将质量达标的RNA用反转录试剂盒进行反转录合成cDNA，用TransScript® One-Step gDNA Removal and cDNASynthesisSuperMix Kit（AT311-02，全式金，北京，中国）

1.3

设计PCR引物，引物设计在起始密码子ATG和终止密码子TAA两端，分别如下：

AhPSC1-1F：5’- ATGGCTGACGATGAGGAT-3’；（SEQ ID NO.5）

AhPSC1-1R：5’- TCTTAGAAGTGCTCCTCCGTAG-3’；（SEQ ID NO.6）

以ND_F和ND_Z的DNA为模板，用AhPSC1-1F/R引物对进行PCR扩增，PCR产物进行1%琼脂糖胶电泳，回收后连接到5 x TA/Blunt-Zero Cloning Kit （C601-01，诺唯赞，南京，中国） 进行连接，之后经菌检后挑选正确的单克隆送生工进行测序；PCR反应程序为：在PCR仪中先95℃预变性5 min；然后30个循环：95℃变性30 sec，56℃退火30 sec，72℃下延伸30sec，72 °C延伸5 min，之后4℃保存。

以ND_F和ND_Z的cDNA为模板用高保真酶Phanta® Uc Super-Fidelity DNAPolymerase for Library Amplification（P507-01，诺唯赞，南京，中国）以AhPSC1-1F/R引物对进行PCR产物进行1%琼脂糖胶电泳，回收后连接到5 x TA/Blunt-Zero Cloning Kit（C601-01，诺唯赞，南京，中国） 进行连接，之后经菌检后挑选正确的单克隆送生工测序，PCR 反应体系和参数同上述方法。

测序结果表明，以花生ND_Z的DNA为模板进行PCR扩增得到的DNA片段为

以花生ND_F和ND_Z的cDNA为模板PCR扩增

实施例2：SNP分子标记引物开发与群体验证。

根据两个材料间

AhPSC1-SNPF: 5’- CTTAAGTTGGGTTTTAGACTTTA-3’；（SEQ ID NO.7）

AhPSC1-SNPR: 5’- ATCGTCCAGAGCATATTTGATGCAG-3’ （SEQID NO.8）

之后我们选取30个RIL群体的极端个体和60个自然品种进行验证结果表明AhPSC1启动子的SNP变异与花生种皮的颜色有很强的关联性，如图2中的c所示。

实施例3：

对ND_F和ND_Z的不同组织的材料的组织进行荧光定量分析； 总 RNA 的提取及cDNA 的反转录同实施例 1。

针对

AhPSC1-qF：5’-TATGATCCACAGCAGCAGCC-3’；

AhPSC1-qR：5’-GTGCTTTGCCATTGGGGGAAG-3’；

内参基因选用Ahactin 7（XM_025826875），引物序列如下：

Ahactin7-F：5’-GATTGGAATGGAAGCTGCTG；

Ahactin7-R：5’-CGGTCAGCAATACCAGGGAA；

使用PerfectStart®Green qPCR SuperMix试剂盒（AQ101-01，TransGenBiotech，中国，北京）和Bio-Rad CFX96 Touch实时PCR系统（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）进行。

20 μl的反应体系，cDNA 1 μl，上下游引物各0.5 μl，2 x PerfectStart® GreenqPCR SuperMix 10 μl，nuclease-free water 8 μl。

PCR程序：95℃ for 3 min，95℃ for 5 s，55℃ for 30 s，72℃ for 30 s，40个循环数。

取5 μl PCR反应产物用2.0 %琼脂糖凝胶电泳，同时送生工测序，判断目标片段是否吻合。采用2-

实施例4：

（1）植物过表达载体的构建

过表达载体构建：以测序正确的连接

pCAMBIA1300-PSC1-GFP_F：5’-AGAGAACACGGGGGACGAGCTCATGGCTGACGATGAGGAT-3’；

pCAMBIA1300-PSC1-GFP_R：5’-AGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATTCTTAGAAGTGCTCCTCCG-3’；

过表达载体pCAMBIA1300-GFP用限制性内切酶KpnI-HF（星选酶）和SacI-HF（星选酶），37℃ 酶切反应30 min，65℃热失活20min进行双酶切，之后对PCR产物和酶切产物跑1%的琼脂糖，之后回收产物。按照同源重组试剂盒（C112，诺唯赞，南京，中国）插入片段4 μl，线性载体3 μl，5 × CE II Buffe 2 μl，Exnase I 1 μl金属浴37℃反应30 min，进行连接。连接好的载体采用按照2.2.6转入DH5α中，涂布在含有50 mg/L的卡那霉素（Kanamycin，Kan）的培养皿上。之后用1300_GFP-F/R引物菌检，将正确的单克隆菌液送至上海生工生物公司测序。

1300_GFP-F: 5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCT-3’；

1300_GFP-R: 5’-ACCGATGATACGAACGAAAG-3’；

最终构建pCAMBIA1300-AhPSC1-GFP载体，转入上海唯地GV3101根癌农杆菌中，涂布在含有50 mg/L Kan和25 mg/L 利福平（Rifampin，Rif）抗性的YEP固体培养基上，28℃培养2 ~ 3 d，挑取单克隆菌检。

（2）

将pCAMBIA1300-AhPSC1-GFP用农杆菌浸染法转化到拟南芥中。

（3）转基因花生的PCR鉴定

利用潮酶素标签（Hyg）在30 mg/L 潮霉素（Hygrovetine，hyg）筛选培养基上进行筛选，同时以Hyg-1F/R引物对T1代转基因植株进行阳性鉴定，引物序列如下：

Hyg-F：5’-CGAGTACTTCTACACAGCCATC-3’；

Hyg-R：5’-TCCACTATCGGCGAGTACTTCT -3’；

共获得9个阳性转基因植株，经过加代，获得T3代纯合转基因株系分别为：OE-52-4-4，OE-52-4-6和OE-52-10-6。如图4所示，过表达植株OE-52-4-4，OE-52-4-6和OE-52-10-6的种皮颜色均较野生型（WT）加深。

综上，本发明的花生果实种皮颜色调控相关基因

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。