核酸检测方法、试剂盒、核酸免疫层析试纸条及制备方法

技术领域

本申请涉及生物医药检测技术领域，特别是涉及一种核酸检测方法、试剂盒、核酸免疫层析试纸条及制备方法。

背景技术

由流感病毒引起的传染病是当今世界面临的一个重大公共卫生问题。流感病毒通常分为A、B、C和D四种类型，其中大多数流感爆发可归因于甲(A)型和乙(B)型流感病毒。因此，高效和有效地诊断流感病毒，特别是甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)和乙型流感病毒(Influenza B virus,IBV)，对于预防流感感染的传播是必要的。

基于核酸的检测和基于抗原的检测是最常用的病毒诊断方法。以核酸为基础的检测，是专为鉴定包含病毒遗传物质的核酸序列而设计的，具有较高的准确性。逆转录聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)是目前检测流感病毒核酸的标准方法的基础。尽管它是一种强大的检测技术，但它需要熟练的人员和先进的实验室设备，包括使用热循环器，这限制了它在快速现场诊断中的应用。因此，必须设计一种既灵敏又实用的即时检测(point-of-care test,POCT)来鉴定IAV核酸。

试纸条被认为是最有前途的POCT技术之一，因为它具有测试时间快、成本低、结果易读和可移植性强等优点。然而，传统的试纸条存在检测灵敏度有限和定量能力差等的局限性。为了解决这些问题，人们越来越关注SERS试纸条。这些试纸条使用拉曼报告标记的SERS纳米材料来取代胶体金。这样，SERS技术的高灵敏度和定量分析能力与试纸条的便捷性和快速性相结合，产生了SERS试纸条。

SERS试纸条已经被用于检测DNA的检测，其基础是将生物素化探针DNA预先固定在检测线上，再通过DNA固定的SERS纳米标签检测目标DNA。这种方法虽然可以识别目标DNA，但它仅限于检测短单链核酸片段。如果不与复杂的预处理技术，例如PCR相结合，这种方法不能直接用于长片段核酸分子的检测。因此，迫切需要开发一种新型的SERS试纸条，用于快速灵敏的IAV核酸检测。

发明内容

基于此，有必要针对上述技术问题，提供一种核酸检测方法、试剂盒、核酸免疫层析试纸条及制备方法。

一种核酸检测方法，方法包括：

从收集的疑似含有甲型流感病毒的标本中提取核糖核酸。

将核糖核酸逆转录为补脱氧核糖核酸。

采用基于酶促恒温扩增技术的核酸检测用试剂盒对甲型流感病毒基质蛋白基因进行检测。

采用SERS核酸免疫层析试纸条对试剂盒检测结果进行判断，得到核酸检测结果。

在其中一个实施例中，采用SERS核酸免疫层析试纸条对试剂盒检测结果进行判断，得到核酸检测结果，包括：

采用SERS核酸免疫层析试纸条对试剂盒检测结果进行判断，当样品中没有目的基因时，质控线有条带，而检测线处无条带，测得的拉曼信号弱；当样品中含有目的基因时，目的基因对应的检测线和质控线均有条带，同时在检测线上能测到较强的拉曼信号，可以通过测试检测线区域的拉曼信号强度做出强度-浓度拟合曲线实现目标核酸的定量化检测。

在其中一个实施例中，核酸检测用试剂盒的反应条件为：在37℃反应20min，在65℃反应2min使酶灭活。

一种用于核酸检测的试剂盒，试剂盒适用于上述任一核酸检测方法进行核酸检测，试剂盒包括：各个待测目的基因对应的正向引物、反向引物及探针，溶解剂，激活剂，ERA扩增试剂。

一种核酸免疫层析试纸条，核酸免疫层析试纸条适用于上述任一核酸检测方法进行核酸检测，核酸免疫层析试纸条包括：底衬、样品吸附垫、结合垫、层析摸和吸水垫。

样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫依次紧密相连、且附着在底衬上；其中结合垫上附着有硅核金壳纳米颗粒-链霉亲和素标记物作为SERS标签；层析膜上设置有一条检测线与一条质控线，检测线上标记有羧基荧光素抗体，质控线上标记有链霉亲和素抗体。

在其中一个实施例中，底衬的材质为聚氯乙烯。

样品吸收垫的材质为玻璃纤维。

结合垫的材质为聚酯膜或者玻璃纤维素膜。

层析膜的材质为硝酸纤维素膜。

吸水垫的材质为吸水纸。

在其中一个实施例中，硅核金壳纳米颗粒-链霉亲和素标记物的制备步骤包括：

采用改进的

采用聚乙烯亚胺介导的种子生长法制备硅核金壳纳米颗粒。

利用5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)对硅核金壳纳米颗粒进行修饰。

2-硝基苯甲酸通过其羧基与链霉亲和素的氨基端肽链偶联。

一种核酸免疫层析试纸条的制备方法，方法用于制备权上述核酸免疫层析试纸条，制备方法包括：

将硅核金壳纳米颗粒-链霉亲和素标记物分散在结合垫上。

将FAM抗体和链霉亲和素抗体分别呈直线型附着在层析膜上，形成检测线或者质控线。

在底衬上将样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫依次相互搭接，得到SERS核酸免疫层析试纸条。

在其中一个实施例中，将硅核金壳纳米颗粒-链霉亲和素标记物分散在结合垫上，包括：

用喷金划膜仪将硅核金壳纳米颗粒-链霉亲和素标记物喷到结合垫上。

在其中一个实施例中，将FAM抗体和链霉亲和素抗体分别呈直线型附着在层析膜上，形成检测线或者质控线，包括：

将FAM抗体和链霉亲和素抗体通过喷金划膜仪包裹到层析膜上。

上述核酸检测方法、试剂盒、核酸免疫层析试纸条及制备方法，所述方法包括：从收集的疑似含有甲型流感病毒的标本中提取核糖核酸；将核糖核酸逆转录为补补脱氧核糖核酸；采用基于酶促恒温扩增技术的核酸检测用试剂盒对甲型流感病毒基质蛋白基因进行检测；采用SERS核酸免疫层析试纸条对试剂盒检测结果进行判断，得到核酸检测结果。本方法结合酶促恒温扩增技术和表面增强拉曼散射核酸免疫层析试纸条的核酸检测方法能够在恒定的工作温度下工作(37℃)，不需要复杂的热循环器；检测灵敏度高，能够实现低至2.63×103copies/mL的甲型流感病毒基质蛋白基因DNA标准物质的检测。

附图说明

图1为一个实施例中核酸检测方法的流程示意图；

图2为一个实施例中甲型流感病毒基质蛋白基因的快速检测流程图，其中，(a)实为SiO2@Au SERS标签的制备过程，(b)为ERA扩增过程，(c)为SERS免疫层析试纸条；

图3为一个实施例中甲型流感病毒SERS试纸条的分析性能图，其中，(a)为甲型流感病毒SERS核酸免疫层析试纸条分别测试存在或不存在甲型流感病毒基质蛋白基因DNA标准物质时的照片，(b)和(d)分别为存在甲型流感病毒基质蛋白基因DNA标准物质时试纸条T线处的SEM图像和SERS信号，(c)和(e)分别为不存在甲型流感病毒基质蛋白基因DNA标准物质时试纸条T线处的SEM图像和SERS信号；

图4为一个实施例中甲型流感病毒SERS试纸条的灵敏度和定量分析性能图；其中(a)为不同浓度的甲型流感病毒基质蛋白基因DNA标准物质下测试的试纸条的照片，(b)为对应不同浓度甲型流感病毒基质蛋白基因DNA标准物质的SERS光谱，(c)为根据甲型流感病毒基质蛋白基因DNA标准物质的浓度和测试线1331cm-1处的SERS强度建立的校准曲线；

图5为一个实施例中甲型流感病毒SERS试纸条的特异性分析性能图，其中(a)为分别测定甲型流感病毒基质蛋白基因、IBV HA基因、SARS-CoV-2N基因以及阴性对照时试纸条的照片，(b)和(c)分别为对应甲型流感病毒基质蛋白基因、IBV HA基因、SARS-CoV-2N基因以及阴性对照的SERS光谱及直方图；

图6为一个实施例中甲型流感病毒SERS试纸条的临床应用潜能分析性能图，其中(a)为甲型流感病毒SERS核酸免疫层析试纸条测定假病毒时的检测示意图；(b)为分别测定含有甲型流感病毒基质蛋白基因、IBV HA基因、SARS-CoV-2N基因的假病毒以及阴性对照时试纸条的照片(c)和(d)分别为对应含有甲型流感病毒基质蛋白基因、IBV HA基因、SARS-CoV-2N基因的假病毒以及阴性对照的SERS光谱及直方图。

具体实施方式

为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

在一个实施例中，如图1所示，提供了一种核酸检测方法，该方法包括以下步骤：

步骤100：从收集的疑似含有甲型流感病毒的标本中提取核糖核酸。

步骤102：将核糖核酸逆转录为补脱氧核糖核酸。

步骤104：采用基于酶促恒温扩增技术的核酸检测用试剂盒对甲型流感病毒基质蛋白基因进行检测。

步骤106：采用SERS核酸免疫层析试纸条对试剂盒检测结果进行判断，得到核酸检测结果。

上述核酸检测方法中，所述方法包括：从收集的疑似含有甲型流感病毒的标本中提取核糖核酸；将核糖核酸逆转录为补补脱氧核糖核酸；采用基于酶促恒温扩增技术的核酸检测用试剂盒对甲型流感病毒基质蛋白基因进行检测；采用SERS核酸免疫层析试纸条对试剂盒检测结果进行判断，得到核酸检测结果。本方法结合酶促恒温扩增技术和表面增强拉曼散射核酸免疫层析试纸条的核酸检测方法能够在恒定的工作温度下工作(37℃)，不需要复杂的热循环器；检测灵敏度高，能够实现低至2.63×103copies/mL的甲型流感病毒基质蛋白基因DNA标准物质的检测。

在其中一个实施例中，步骤106包括：采用SERS核酸免疫层析试纸条对试剂盒检测结果进行判断，当样品中没有目的基因时，质控线有条带，而检测线处无条带，测得的拉曼信号弱；当样品中含有目的基因时，目的基因对应的检测线和质控线均有条带，同时在检测线上能测到较强的拉曼信号，可以通过测试检测线区域的拉曼信号强度做出强度-浓度拟合曲线实现目标核酸的定量化检测。

在其中一个实施例中，步骤104中核酸检测用试剂盒的反应条件为：在37℃反应20min，在65℃反应2min使酶灭活。

在一个具体的实施例中，提供了用于甲型流感病毒基质蛋白基因的快速检测方法，整体的流程示意图如图2所示，其中，(a)实为SiO2@Au SERS标签的制备过程，(b)为ERA扩增过程，(c)为SERS免疫层析试纸条；包括以下步骤：

(1)硅核金壳纳米颗粒的制备：

SiO2纳米微球的制备：向200mL广口瓶中依次加入100mL无水乙醇、2.5mL去离子水以及4mL 28％的氨水溶液，加入干净的搅拌子，置于搅拌器上，室温搅拌20min，使其混合均匀后，再快速一次性加入3mL TEOS溶液，室温条件下持续搅拌6h。离心，用无水乙醇洗涤三遍后，重悬于20mL无水乙醇中。

SiO2@PEI微球的制备：取步骤(1)制备的二氧化硅微球溶液0.5mL分散于100mL去离子水中，封口膜封口后置于超声中，常温条件下超声10min，使二氧化硅微球充分分散在去离子水中。再加入5mg/mL的PEI溶液10mL，继续超声40min后，离心去离子水洗涤3遍后重悬于5mL水中保存备用，得到SiO2@PEI微球。

SiO2@PEI-Au seed微球的制备：向500mL广口瓶中依次加入400mL去离子水、3.4mL10mg/mL的氯金酸溶液和2.97mL 10mg/mL的柠檬酸钠溶液，剧烈搅拌条件下一次性加入12mL 0.1M的硼氢化钠水溶液，搅拌持续4小时，获得稳定的3nm胶体金。向200mL广口瓶中依次加入5mL SiO2@PEI微球和100mL 3nm胶体金，混合，超声30min，离心，去离子水洗涤3遍，得到SiO2@PEI-Au seed微球。

硅核金壳纳米颗粒的制备：向200mL广口瓶中依次加入100mL去离子水、上述制备的SiO2@PEI-Au seed微球1mL、200mg PVP、1mL10 mg/mL的盐酸羟胺溶液，室温条件下超声10min后使微球完全分散，在超声条件下加入130μL 10mg/mL的氯金酸溶液，边滴加边震荡，超声继续反应5min后，离心，去离子水洗涤3次，重悬于20mL无水乙醇中保存备用，得到SiO2@Au微球。

(2)拉曼分子(DTNB)的标记：

向上述方法制备的10mL浓度为5mg/mL硅核金壳纳米材料乙醇溶液中加入100μL10mM DTNB溶液，混合均匀后，常温下超声1h。离心，去上清，无水乙醇洗涤一遍以去除溶液中过量的DTNB分子，重悬于10mL无水乙醇中保存备用。

(3)链霉亲和素的标记：

取1mL上一步得到的DTNB修饰的硅核金壳纳米材料离心去上清，去离子水清洗一遍，重悬于1mL MES(100mM,pH6.0)溶液中，依次加入100μL 10mM的EDC和100μL 10mM的NHS溶液，常温下超声15min活化。取出离心去上清，沉淀重悬于1mL 0.05％ PBST溶液中，加入链霉亲和素至终浓度为20μg/mL。常温下，置于摇床上，震荡2h。直接往溶液中加入10％ BSA溶液100μL，用枪吹打均匀后，置于摇床上常温震荡2h。

将完成封闭的抗体标记溶液离心去上清，再用0.05％ PBST洗涤一遍，离心去上清，洗去过量的封闭液保留沉淀待用。

(4)SERS核酸免疫层析试纸条的制备：

金标结合垫的制备：按下述体系配制金标稀释液：5％蔗糖，3％ D-海藻糖，1％BSA,0.5％ PEG6000,0.3％ PVP,0.5％ Trition-X100,0.02％ NaN3溶于PBS溶液中混合均匀。将上述步骤中所得沉淀重悬于300μL金标稀释液中，用移液枪吹打混合均匀，短暂超声10s后，取出低转速离心(700rpm,2min)去除团聚大颗粒，上清混合均匀后铺在己准备好的金标结合垫上，置于37℃烘箱烘干4h，得到标记链霉亲和素的SERS Tag金标垫，置于带有干燥剂的自封袋中真空密封4℃保存备用。

硝酸纤维素膜的致敏：将所需点样的FAM抗体稀释至1.2mg/mL，1μL/cm分别作为检测线包被在NC膜上，将所需点样的链霉亲和素抗体稀释至1.2mg/mL，1μL/cm作为质控线包被在NC膜上，室温，低湿度进行干燥。

(5)ERA扩增：

按照下述反应体系制备每份样品的预混液：总体积48μL，包括一份冻干的ERA酶/RT-ERA酶、2μL待测对象、2.1μL 1μM上游引物、2.1μL 1μM下游引物、0.6μL 1μM探针、20μL溶解剂以及21.2μL无酶无菌水。

对于每份样品，将48μL预混液转移至每管RT-试纸扩增试剂中。振荡混匀直至扩增试剂重悬，并短暂离心；在反应管盖上加上2μl激活剂，小心盖紧管盖，通过短暂离心使激活剂进入预混液中。短暂振荡混匀并再次快速离心；将反应管放入金属浴中(37℃)中孵育20分钟。

(6)SERS核酸免疫层析试纸条检测：

取2μL ERA扩增产物，以同时含有10％ FBS和1％ BSA的0.5％PBST溶液作为缓冲液进行稀释。将80μL上述稀释好的溶液滴加到试纸条的样品垫上。液体通过毛细作用沿着NC膜迁移到吸收垫。试纸条干燥后，用便携式拉曼光谱仪，激光功率为8mW，积分时间为30s记录SERS信号强度。

应该理解的是，虽然图1的流程图中的各个步骤按照箭头的指示依次显示，但是这些步骤并不是必然按照箭头指示的顺序依次执行。除非本文中有明确的说明，这些步骤的执行并没有严格的顺序限制，这些步骤可以以其它的顺序执行。而且，图1中的至少一部分步骤可以包括多个子步骤或者多个阶段，这些子步骤或者阶段并不必然是在同一时刻执行完成，而是可以在不同的时刻执行，这些子步骤或者阶段的执行顺序也不必然是依次进行，而是可以与其它步骤或者其它步骤的子步骤或者阶段的至少一部分轮流或者交替地执行。

在一个实施例中，提供了一种用于核酸检测的试剂盒，试剂盒适用于上述任一核酸检测方法进行核酸检测，试剂盒包括：各个待测目的基因对应的正向引物、反向引物及探针，溶解剂，激活剂，ERA扩增试剂。

具体的，用于检测检测甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)基质蛋白(matrix,M)基因的ERA检测引物组合，包括以下2条引物和1条探针：

上述上游引物、下游引物以及探针核酸序列均由生工@生物(上海)有限公司合成。

扩增产物为5’端FAM标记，3’端为生物素标记的双标记扩增子。

在一个实施例中，提供了一种核酸免疫层析试纸条，核酸免疫层析试纸条适用于上述任一核酸检测方法进行核酸检测，核酸免疫层析试纸条包括：底衬、样品吸附垫、结合垫、层析摸和吸水垫。

样品吸附垫、结合垫、层析膜和吸水垫依次紧密相连、且附着在底衬上；其中结合垫上附着有硅核金壳纳米颗粒-链霉亲和素标记物作为SERS标签；层析膜上设置有一条检测线与一条质控线，检测线上标记有羧基荧光素抗体，质控线上标记有链霉亲和素抗体。

具体的，结合垫上附着的SERS标签可以通过链霉亲和素与扩增产物3’端的生物素标记结合，检测线上的FAM抗体能与扩增产物5’端的FAM标记结合；在检测ERA扩增产物时，对于阳性样品，SERS标签与扩增产物3’端的生物素标记结合，再通过扩增产物5’端的FAM标记与对应的检测线上的抗体相结合，SERS标签被固定在对应的检测线区域而显示出纳米材料的黑色条带，同时由于纳米材料表面具有DTNB拉曼分子，从而可通过检测对应检测线区域拉曼分子的拉曼信号实现可视化与定量化的检测；对于阴性样品，硅核金壳纳米颗粒-链霉亲和素标记物与检测线上的抗体不结合，从而不显示条带。过量的未被捕获的SERS tag继续移动，在质控线区域被链霉亲和素抗体捕获而显黑色条带，质控线是否显色是检测试纸条是否有效的关键因素。

在其中一个实施例中，底衬的材质为聚氯乙烯；样品吸附垫的材质为玻璃纤维；结合垫的材质为聚酯膜或者玻璃纤维素膜；层析膜的材质为硝酸纤维素膜；吸水垫的材质为吸水纸。

在其中一个实施例中，硅核金壳纳米颗粒-链霉亲和素标记物的制备步骤包括：采用改进的

具体的，将5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)和硅核金壳纳米颗粒混合并超声，含有巯基DTNB分子通过化学键(Au-S)与硅核金壳纳米微球的表面结合；通过活化剂EDC和NHS活化DTNB的羧基，并与链霉亲和素的氨基端肽链偶联。

所述的硅核金壳纳米颗粒制备的步骤具体包括：

(1)SiO2纳米微球的制备：

取无水乙醇、去离子水、28％的氨水溶液于广口瓶中，加入干净的搅拌子，置于搅拌器上，室温搅拌20min，使其混合均匀；

快速一次性加入4mL TEOS溶液，室温条件下持续搅拌6h。产物SiO2纳米微球的粒径随着搅拌时间增加而逐渐增大；

反应结束，溶液呈白色乳浊液状态，离心浓缩得到SiO2白色沉淀物，无水乙醇洗涤3次后，放入60℃烘箱烘干即得到SiO2固体粉末。

(2)硅核金壳纳米颗粒制备的步骤具体包括：

取SiO2纳米微球加入去离子水中，超声处理10min；

加入PEI溶液，超声处理40min；

离心，去离子水冲洗掉多余的PEI，重复3次，得到SiO2@PEI纳米颗粒；

将SiO2@PEI纳米颗粒加入到3-5nm胶体金溶液中，超声处理30min；

离心，去离子水洗去多余的3-5nm金纳米颗粒；

所得产物加入到去离子水中，加入聚乙烯吡咯烷酮，盐酸羟胺，超声10min使颗粒充分分散开，加入1％氯金酸溶液，继续超声5min，制备SiO2@Au纳米颗粒；

离心，去离子水冲洗多余的聚乙烯吡咯烷酮，重复冲洗3次，所得SiO2@Au保存于无水乙醇中备用。

硅核金壳纳米颗粒-链霉亲和素标记物通过如下方法制备得到，具体包括如下步骤：

取DTNB溶液加入到上述方法制备的硅核金壳纳米颗粒乙醇溶液中，混合均匀后，常温下超声；

离心，去上清，无水乙醇洗涤一遍，去除溶液中过量的DTNB分子；

将DTNB修饰的硅核金壳纳米颗粒离心去上清，去离子水洗涤一遍后，重悬于MES溶液中，依次加入EDC和NHS溶液，常温下超声活化；

取出离心去上清，沉淀重悬于0.05％ PBST溶液中，加入链霉亲和素，常温下，置于振荡器上震荡；

加入10％ BSA溶液，用枪吹打均匀后，常温震荡；

离心去上清，重悬于0.05％ PBST溶液中，得到SERS标签。

在一个实施例中，提供了一种核酸免疫层析试纸条的制备方法，方法用于制备上述核酸免疫层析试纸条，制备方法包括：

步骤200：将硅核金壳纳米颗粒-链霉亲和素标记物分散在结合垫上。

步骤202：将FAM抗体和链霉亲和素抗体分别呈直线型附着在层析膜上，形成检测线或者质控线。

步骤204：在底衬上将样品吸附垫、结合垫、层析膜和吸水垫依次相互搭接，得到SERS核酸免疫层析试纸条。

在其中一个实施例中，步骤200包括：用喷金划膜仪将硅核金壳纳米颗粒-链霉亲和素标记物喷到结合垫上。

在其中一个实施例中，步骤204包括：将FAM抗体和链霉亲和素抗体通过喷金划膜仪包裹到层析膜上。

在一个具体实施例中，SERS核酸免疫层析试纸条的制备方法，具体包括如下步骤：

(1)金标结合垫的制备：按下述体系配制金标稀释液：5％蔗糖，3％ D-海藻糖，1％BSA,0.5％ PEG6000,0.3％ PVP,0.5％ Trition-X100,0.02％ NaN3溶于PBS溶液中混合均匀。将上述步骤中所得沉淀重悬于300μL金标稀释液中，用移液枪吹打混合均匀，短暂超声10s后，取出低转速离心(700rpm,2min)去除团聚大颗粒，上清混合均匀后铺在己准备好的金标结合垫上，置于37℃烘箱烘干4h，得到标记链霉亲和素的SERS Tag金标垫，置于带有干燥剂的自封袋中真空密封4℃保存备用。

(2)硝酸纤维素膜的致敏：将所需点样的FAM抗体稀释至1.2mg/mL，1μL/cm分别作为检测线包被在NC膜上，将所需点样的链霉亲和素抗体稀释至12.mg/mL，1μL/cm作为质控线包被在NC膜上，室温，低湿度进行干燥。

(3)ERA扩增：

按照下述反应体系制备每份样品的预混液：总体积48μL，包括一份冻干的ERA酶/RT-ERA酶、2μL待测对象、2.1μL 1μM上游引物、2.1μL 1μM下游引物、0.6μL 1μM探针、20μL溶解剂以及21.2μL无酶无菌水。

对于每份样品，将48μL预混液转移至每管RT-试纸扩增试剂中。振荡混匀直至扩增试剂重悬，并短暂离心；在反应管盖上加上2μl激活剂，小心盖紧管盖，通过短暂离心使激活剂进入预混液中。短暂振荡混匀并再次快速离心；将反应管放入金属浴中(37℃)中孵育20分钟。

(4)SERS核酸免疫层析试纸条检测：

取2μL ERA扩增产物，以同时含有10％ FBS和1％ BSA的0.5％PBST溶液作为缓冲液进行稀释。将80μL上述稀释好的溶液滴加到试纸条的样品垫上。液体通过毛细作用沿着NC膜迁移到吸收垫。试纸条干燥后，用便携式拉曼光谱仪，激光功率为8mW，积分时间为30s记录SERS信号强度。

在另一个实施例中，图3为甲型流感病毒SERS核酸免疫层析试纸条的分析性能图，图3中(a)为甲型流感病毒SERS核酸免疫层析试纸条分别测试存在或不存在甲型流感病毒基质蛋白基因DNA标准物质时的照片，当甲型流感病毒基质蛋白基因DNA标准物质存在时，在试纸条的T线上观察到了暗带，反之则没有；图3中(b)和(d)分别为存在甲型流感病毒基质蛋白基因DNA标准物质时试纸条T线处的SEM图像和SERS信号。可以观察到T线处纳米粒子的聚集以及强烈的SERS信号；图3中(c)和(e)分别为不存在甲型流感病毒基质蛋白基因DNA标准物质时试纸条T线处的SEM图像和SERS信号。可以观察到T线处几乎没有纳米粒子的聚集，同时也几乎观察不到SERS信号。可见本发明的甲型流感病毒-SERS核酸免疫层析试纸条具备了测定甲型流感病毒基质蛋白基因的能力。

在另一个实施例中，图4为甲型流感病毒SERS核酸免疫层析试纸条的灵敏度和定量分析性能图，图4中(a)为不同浓度的甲型流感病毒基质蛋白基因DNA标准物质(103copies/mL-109copies/mL)下测试的试纸条的照片。在T线上观察到了暗带。颜色随甲型流感病毒基质蛋白基因DNA标准物质浓度的降低而逐渐减弱。肉眼观察的灵敏度为105copies/mL，图4中(b)为对应不同浓度甲型流感病毒基质蛋白基因DNA标准物质的SERS光谱。来自DTNB的SERS信号随着甲型流感病毒基质蛋白基因DNA标准物质浓度的降低而逐渐减弱。拉曼检测灵敏度可达104copies/mL，图4中(c)为根据甲型流感病毒基质蛋白基因DNA标准物质的浓度和测试线1331cm-1处的SERS强度，建立了校准曲线。误差线为测量三次所得。根据校准曲线计算得到的检测线为2.63×103copies/mL。

可见本申请的甲型流感病毒SERS核酸免疫层析试纸条具有极高的分析灵敏度及极强的定量分析能力。

在另一个实施例中，图5为甲型流感病毒SERS核酸免疫层析试纸条的特异性分析性能图，其中图5中(a)为分别测定甲型流感病毒基质蛋白基因、IBV HA基因、SARS-CoV-2N基因以及阴性对照时试纸条的照片。仅在测试甲型流感病毒基质蛋白基因时，在T线上观察到了暗带，图5中(b)和(c)分别为对应甲型流感病毒基质蛋白基因、IBV HA基因、SARS-CoV-2N基因以及阴性对照的SERS光谱及直方图。仅在测试甲型流感病毒基质蛋白基因时，测定到了来自DTNB的SERS信号。

可见本申请提出的甲型流感病毒SERS核酸免疫层析试纸条具有极高的特异性分析能力。

在另一个实施例中，图6为甲型流感病毒SERS核酸免疫层析试纸条的临床应用潜能分析性能图，其中，图6中(a)为甲型流感病毒SERS核酸免疫层析试纸条测定假病毒时的检测示意图；图6中(b)为分别测定含有甲型流感病毒基质蛋白基因、IBV HA基因、SARS-CoV-2N基因的假病毒以及阴性对照时试纸条的照片。仅在测试含有甲型流感病毒基质蛋白基因的假病毒时，在T线上观察到了暗带。

图6中的(c)和(d)分别为对应含有甲型流感病毒基质蛋白基因、IBV HA基因、SARS-CoV-2N基因的假病毒以及阴性对照的SERS光谱及直方图。仅在测试含有甲型流感病毒基质蛋白基因的假病毒时，测定到了来自DTNB的SERS信号。

可见本申请提出的甲型流感病毒SERS核酸免疫层析试纸条具有极好的临床应用潜能。

以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请的保护范围应以所附权利要求为准。