视网膜色素上皮细胞的条状聚集体、用于制造其的装置和制造方法、以及含有该条状聚集体的治疗药物

技术领域

本发明涉及视网膜色素上皮细胞的条状聚集体、用于制造其的装置和制造方法、以及含有该条状聚集体的治疗药物。

背景技术

使用ES/iPSC来源的视网膜色素上皮细胞(RPE)用于针对眼部疾病的基于细胞的再生疗法，在过去10年里是眼科临床领域的一个大的关注点(非专利文献1)。根据这些临床研究，伴随着一些可能的有效性，这种治疗方法的安全性变得明确。迄今为止，在这些临床研究中，有使用细胞悬浮液的方法和使用RPE片的方法这两种方法，这两种方法都有优缺点。使用细胞悬浮液的移植可以从管中立即使用，或者可以利用通过短时间培养的细胞储备，可以通过小的外科侵袭进行移植，但是难以控制细胞在移植部位的配置，移植的细胞常常在玻璃体中形成视网膜前膜(ERM)(非专利文献1、2)。相比之下，RPE片可以通过目视确认移植片按照计划以正确的方式被配置，但是片的准备需要时间、成本和伴随大的巩膜和神经视网膜切开的侵袭性外科处理(非专利文献3)。因此，仍然没有解决提供能够以短时间、低成本准备并且移植的方法是非侵袭性的，同时在其移植部位可容易地控制的视网膜色素上皮细胞的移植材料的问题。

现有技术文献

非专利文献1：Sugita,S et al.,(2020)J.Clin.Med.9,2217.

非专利文献2：Schwartz,S.D.et al.,(2015)Lancet 385,509-516.

非专利文献3：Lyndon da Cruz et al.,Nature Biotechnology Advance OnlinePublication,published online 19March 2018.

发明内容

发明要解决的问题

本发明要解决的问题是提供能够以短时间、低成本准备并且移植的方法是非侵袭性的、同时在其移植部位可容易地控制的视网膜色素上皮细胞的移植材料，以及该移植材料的制造方法。

解决技术问题的手段

本发明的发明人假设，即使是能够容易地注入到视网膜下的条状聚集体的RPE细胞，也能够像小片移植一样扩展到覆盖一定面积。近年来，作为微小组织形态学的机理，报告了表面覆盖性、组织收缩性和粘附力的关系(Yamashita,T.et al.,(2016).ActaBiomater.45,85-97.)。发明人确认，粘附力和收缩力取得平衡的细胞在曲率小的凹面上自发地生成了球状组织，以该见解为基础，研究了凹面下端的曲率，发现曲率小的槽面使细胞生成带状组织。尽管小组织的制作基本上需要诸如光刻等的特殊技术，但是引入聚二甲基硅氧烷(PDMS)软光刻和简单的三维(3D)印刷相结合的制造技术，可使这种组织工程学方法广泛使用。在本发明中，制作了具有细槽的基于PDMS的培养装置，并研究了hiPSC-RPE细胞是否能够形成条状聚集体。而且，确认了hiPSC-RPE细胞是否能够从涂敷在培养皿上的条状聚集体扩展，扩展的hiPSC-RPE细胞是否能够呈现与条状聚集体形成前相同的RPE特性。另外，还验证了形成了条状聚集体的hiPSC-RPE是否能够实质上注入动物的眼睛。

即，本发明涉及以下内容。

[1]一种视网膜色素上皮细胞的条状聚集体。

[2]根据上述[1]所述的条状聚集体，其特征在于，全长/主干外径的比率为2～1000。

[3]根据上述[2]所述的条状聚集体，其特征在于，横截面形状为圆形或椭圆形。

[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的条状聚集体，视网膜色素上皮细胞是由多能干细胞分化诱导的细胞。

[5]一种用于制造上述[1]～[4]中任一项所述的条状聚集体的装置，上述装置具有基体部件，

该基体部件具有设置有1个以上槽的上表面，

该槽包括具有条状聚集体的长度和宽度的空腔部分，作为用于将被接种的视网膜色素上皮细胞培养成条状聚集体的模具。

[6]根据上述[5]所述的装置，上述槽具有空腔部分作为该槽的底部，并且具有位于该空腔部分之上的上部，该上部具有上述槽的开口。

[7]根据上述[5]或[6]所述的装置，上述槽的横截面形状为V字形，该V字形的最深部带有圆弧。

[8]一种视网膜色素上皮细胞的条状聚集体的制造方法，包括以下步骤：

(1)将悬浮于液体培养基中的视网膜色素上皮细胞接种在上述[5]～[7]中任一项所述的装置的槽内的步骤；

(2)在上述槽内培养视网膜色素上皮细胞，形成视网膜色素上皮细胞的条状聚集体的步骤。

[9]根据上述[8]所述的方法，培养基包含ROCK抑制剂。

[10]根据上述[9]所述的方法，ROCK抑制剂为Y-27632。

[11]根据上述[8]～[10]中任一项中所述的方法，在槽内培养的视网膜色素上皮细胞的密度为2.5x10

[12]根据上述[8]～[11]中任一项中所述的方法，视网膜色素上皮细胞的培养时间为1天～7天。

[13]一种药物组合物，其含有上述[1]～[4]中任一项所述的视网膜色素上皮细胞的条状聚集体。

[14]一种起因于视网膜色素上皮障碍的疾病的治疗药物，其含有上述[1]～[4]中任一项所述的视网膜色素上皮细胞的条状聚集体。

发明效果

根据本发明，可制造能够以短时间、低成本准备且移植的方法是非侵袭性的，同时在其移植部位可容易地控制的视网膜色素上皮细胞的移植材料。

附图说明

图1是说明本发明的装置的结构和使用其的条状聚集体的制造方法的立体图。在该图中，为了容易理解地说明槽，示出了在基体部件的上表面设置有1条槽的方式，另外，为了表示槽的横截面(将槽垂直于其长度方向切断时的截面)，仅示出槽的全长的一部分。图1的(a)示出了将视网膜色素上皮细胞与液体培养基(未示出)一起接种到槽内的状态。图1的(b)示出了被接种的视网膜色素上皮细胞在槽内生长为条状聚集体的状态。

图2是例示槽和空腔部分的形状的图。

图3是示出槽和空腔部分的优选方式的一例的图。

图4是用于说明条状聚集体的各部分的尺寸、本发明的装置的结构、该条状聚集体与装置的关系的示意图。图4的(a)是为了说明而将条状聚集体的整体形状简单化示出的图。图4的(b)是示出了在槽内形成的条状聚集体与槽的尺寸关系的一例的图。

图5是示出本发明的装置的优选方式例的图。图5的(a)是示出该装置整体的立体图，图5的(b)是沿着在槽的宽度方向延伸的切断线X1-X1，将图5的(a)所示的装置在该装置的厚度方向切断时的截面图。省略了切断面上的阴影。

图6是示出用于制造本发明的装置的成型模的一例的图，也是示出该成型模的制造方法的一例的图。图6的(b)是图6的(a)所示的模具部件的立体图。图6的(d)是图6的(c)所示的模具的立体图。

图7是示出本发明的装置的制造步骤的一例的截面图，示意性地示出了使用图6的(c)、6的(d)所示的成型模对该装置进行树脂成型的情况。

图8是示出在本发明的实施例中实际制作的成型模的照片图(图8的(a))和示出由该成型模实际成型的该装置的照片图(图8的(b))。

图9是示出本发明的条状聚集体的制造方法的示意图。图9的(a)示出了将视网膜色素上皮细胞接种到图5所示装置的槽中的状态(未示出液体培养基)，图9的(b)示意性地示出了从该槽取出在槽内形成的条状聚集体的情况。

图10示出了PDMS槽构造体的测量结果。A：具有5个长度为19.5mm，高度为1.6mm的凸片(fin)的PDMS涂层模具的照片。B：具有长度为19.5mm、宽度为1mm、深度为1.6mm的5条槽的槽构造测量用的基于PDMS的培养装置的照片。C：槽底的通过激光显微镜的测量图像。D：测量以PDMS为基础的培养装置的槽形状后的结果。各测量项目的平均值为底面曲率半径0.21mm、槽宽1.16mm、槽深1.60mm。

图11示出了随着条状聚集体置换损伤的RPE缺损区域而恢复了一部分功能。A：体外疾病模型和移植的实验时间表。通过用MMC处理RPE细胞、制造伤口来模拟病理性RPE的变性/障碍情况，然后通过在缺损区域上涂敷hiPSC-RPE细胞悬浮液或条状聚集体(201B7modFucci株)来在体外模拟移植步骤。B：在201B7-Fucci hiPSC株的G0-G1细胞周期中，通过细胞的mCherry表达监测RPE缺损区域上涂敷的hiRPE细胞的扩展。用虚线表示最初受伤的区域和对照孔的缺损区域。B’：该部分示出了划线后的RPE缺损区域、和来自RPE细胞悬浮液或条状聚集体的RPE细胞扩展得到的再填充区域。C：从条状聚集体扩展的RPE细胞当沿着边界与mCherry的表达增加的常驻RPE接触时，扩展停止。D：通过mCherry的表达和RPE细胞的大小(箭头)合理地识别了现有MMC处理后的RPE与新涂敷的RPE之间的边界。MMC处理后的RPE通常大于从条状聚集体扩展的RPE。在常驻MMC处理后的群体和新涂敷/扩展的RPE细胞的各群体中的细胞间观察到ZO-1的表达，并且在边界部的细胞间也观察到ZO-1的表达。E和F：在开始时(-d3)、MMC后(-d2)、划线后(-d1)以及有无hiPSC-RPE细胞或条状聚集体(n＝3)的涂敷后，各孔中PEDF和VEGF的分泌。在MMC处理和划线后，VEGF和PEDF的分泌均降低。在没有补充RPE细胞的情况下，PEDF继续减少，但是在用悬浮液或条状聚集体的任一种补充RPE细胞时，更快地得到了PEDF。

图12示出了条状聚集体形成的优化。A:使用10μM Y-27632(片状培养基、混合培养基、维持培养基)的三种培养基，将hiPSC-RPE细胞涂敷在模具的槽中。B：模具内的条状聚集体的外观(混合培养基、维持培养基)。C：将hiPSC-RPE细胞以4.5×10

图13示出了开始细胞数和Y-27632浓度对条状聚集体形成的影响。A：将150000个或450000个RPE细胞形成的第4天的条状聚集体放置在培养皿中，第二天和第14天后拍摄的外观。RPE细胞从各条状聚集体扩展，由15000个细胞形成的条状聚集体在14天后失去形状，但由450000个细胞形成的条状聚集体维持了初期的形状。A’：在细胞扩展后，碎片化的条状聚集体几乎失去了初始的形状。B：接种RPE(2×10

图14示出了用于形成条状聚集体的Y-27632浓度的优化。A：在不同Y-27632浓度下的条状聚集体形成。B：将第2天的条状聚集体(M8株)涂敷在24孔板上，监测通过hiPSC-RPE细胞的覆盖区域的扩展。添加了2-2.5μM的Y-27632的条状聚集体对板的粘附性最高，在放置于孔中时有平坦地附着的倾向。C：hiPSC-RPE细胞(M8株)的扩展。在各孔中配置条状聚集体后的覆盖区域(相对于各Y-27632浓度，n＝6)。D：将第2天的条状聚集体(201B7modFucci株)放置在24孔板上，监测通过hiPSC-RPE细胞的覆盖区域的扩展。添加了2-2.5μM Y-27632的条状聚集体与板具有一致的粘附性，在配置于孔中时有平整地附着的倾向。E：hiPSC-RPE细胞(201B7modFucci株)的扩增。在各孔中配置条状聚集体后的覆盖区域(相对于各Y-27632浓度，n＝2)。

图15-1示出了使用不同hiPSC株(M8和201B7modFucci L)形成条状聚集体的重现性。A：使用另一种hiPSC株同样形成了条状聚集体，但需要对每种株进行Y-27632的优化。201B7modFucci株为了稳定地形成条状聚集体，需要5μM的Y-27632。B:由各M8和201B7modFucci株形成的条状聚集体附着在板上，充分扩展，呈现出RPE的特征性的石阶那样的外观和色素沉着。C:从条状聚集体扩展的RPE细胞表达紧密连接标记ZO-1和RPE标记MiTF。D：条状聚集体形成前的hiPSC-RPE细胞、条状聚集体的RPE细胞、以及从各hiPSC株来源的条状聚集体扩展后的细胞的RPE标记基因表达。E：RPE细胞从条状聚集体迁移并增殖为单层。

图15-2示出了使用不同hiPSC株(M8和201B7modFucci L)形成条状聚集体的重现性。F：条状聚集体的RPE细胞的细胞数和从条状聚集体扩展的RPE细胞的细胞数。G：从条状聚集体扩展的RPE细胞分泌VEGF和PEDF。比例尺，50μm(C，E)。

图16示出了在裸大鼠中的条状聚集体移植。A：条状聚集体移植后裸大鼠眼睛的眼底照片。B：条状聚集体移植后第93天裸大鼠眼睛的眼底照片。通过SLO-OCT在移植部位观察到较强的RPE样信号。C：移植后眼睛的苏木精伊红染色。D：人核抗原(HuNu)仅色素片状层为阳性。E：所移植的RPE显示孔定向，如作为极性标记的人特异性埃滋蛋白和IV型胶原所示。比例尺，50μm(B)20μm(E)。

图17示出了装填在24G静脉内套管中的条状聚集体。

图18示出了将条状聚集体移植到两个兔子眼睛。关于移植手术中的条状聚集体的实用处理，用2个兔子眼睛(A和B)进行了试验。上：条状聚集体的装填。中间：将条状聚集体缓慢注入视网膜出血部内侧。视网膜切开部位用白色箭头指示。下：注入的条状聚集体。

图19示出了COP槽构造体。

图20为示出用套管吸入漂浮在通过OptimEM稀释了4-7倍的粘弹性物质构成的介质中的条状聚集体的瞬间的照片。比例尺；1mm

图21示出了将条状聚集体移植到猴子的眼球。

具体实施方式

1.视网膜色素上皮细胞的条状聚集体

本发明提供了一种视网膜色素上皮细胞的条状聚集体(以下称为本发明的条状聚集体)。

在本发明中，视网膜色素上皮细胞(以下有时也记载为RPE细胞)是指构成视网膜色素上皮的上皮细胞及其前体细胞。视网膜色素上皮细胞例如可以通过细胞标记物(RPE65、CRALBP、MERTK、BEST1等)的表达、细胞的形态(细胞内的黑色素沉着、多边形扁平的上皮样的细胞形态、多边形的肌动蛋白束的形成等)等来确认。另外，视网膜色素上皮细胞的前体细胞是指被定向分化诱导为视网膜细胞的细胞，是否为该前体细胞可以通过细胞标记物(Mitf(色素上皮细胞、色素上皮前体细胞)、Pax6(色素上皮前体细胞)、Rx(视网膜前体细胞)、OTX2(视网膜前体细胞)、RPE65(色素上皮细胞)、BEST1(色素上皮细胞)的表达等来确认。另外，视网膜色素上皮细胞的功能评价例如可以以细胞因子(VEGF或PEDF等)的分泌能力或吞噬能力等为指标来确认。如果是本领域技术人员，则可以设定适当的条件来实施这些功能评价及确认操作。

RPE细胞可以从具有RPE细胞的任何动物(例如人)获得，也可以通过本身已知的方法从多能干细胞分化诱导来获得，但是从可提供足够量的或根据疾病的合适的细胞这点来看，更优选从多能干细胞分化诱导的细胞。作为多能干细胞，只要是具有可分化为生物体中存在的所有细胞的多能性且同时具有增殖能力的干细胞，就没有特别限定，例如，包括胚胎干细胞(ES细胞)、通过核移植得到的克隆胚胎来源的胚胎干细胞(ntES细胞)、精子干细胞(GS细胞)、胚胎生殖细胞(EG细胞)、人工多能干细胞(iPS细胞)、培养成纤维细胞和骨髓干细胞来源的多能干细胞(Muse细胞)等。优选的多能干细胞为iPS细胞。多能干细胞的来源没有特别限制，可以列举出例如下述任一种多能干细胞的建立被报告的任意动物，优选哺乳动物，更优选人、小鼠、大鼠等，最优选人。

iPS细胞可以通过将特定的初始化因子以DNA或蛋白质的形式导入体细胞来制作，为具有与ES细胞大致相同的特性(例如分化多能性和通过自我复制的增殖能力)的体细胞来源的人工干细胞(K.Takahashi and S.Yamanaka(2006),Cell,126:663-676；K.Takahashi et al.(2007),Cell,131:861-872；J.Yu etal.(2007),Science,318:1917-1920；Nakagawa,M.et al.,Nat.Biotechnol.26:101-106(2008)；国际公开WO2007/069666)。

本文中使用的术语体细胞是指除卵子、卵母细胞等生殖系细胞或分化全能细胞以外的任何动物细胞(优选包括人的哺乳动物的细胞)。体细胞非限定性地包括胎儿体细胞、新生儿体细胞和成熟的健康或疾病体细胞的任意一种，另外，还包括原代培养细胞、传代细胞和株化细胞的任意一种。具体而言，体细胞可以例示例如(1)神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、牙髓干细胞等组织干细胞(成体干细胞)，(2)组织前体细胞，(3)淋巴细胞、上皮细胞、内皮细胞、肌肉细胞、成纤维细胞(皮肤细胞等)，毛细胞、肝细胞、胃粘膜细胞、肠细胞、脾细胞、胰腺细胞(胰腺外分泌细胞等)、脑细胞、肺细胞、肾细胞以及脂肪细胞等分化的细胞等。

初始化因子可以由ES细胞中特异性表达的基因、其基因产物或非编码RNA或维持ES细胞未分化中起重要作用的基因、其基因产物或非编码RNA或低分子化合物构成。作为初始化因子中包含的基因，可以例示例如Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、β-连环蛋白、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3或Glis等。这些初始化因子可单独使用，也可以组合使用。作为初始化因子的组合，可以例示WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126 251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO2010/111409、WO2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D,et al.(2008),Nat.Biotechnol.,26:795-797、Shi Y,et al.(2008),Cell Stem Cell,2:525-528、EminliS,et al.(2008),Stem Cells.26:2467-2474、Huangfu D,et al.(2008),NatBiotechnol.26:1269-1275、Shi Y,et al.(2008),Cell Stem Cell,3,568-574、Zhao Y,etal.(2008),Cell Stem Cell,3:475-479、Marson A,(2008),Cell Stem Cell,3,132-135、Feng B,et al.(2009),Nat Cell Biol.11:197-203、R.L.Judson et al.,(2009),Nat.Biotech.,27:459-461、Lyssiotis CA,et al.(2009),Proc Natl Acad Sci U SA.106:8912-8917、Kim JB,et al.(2009),Nature.461:649-643、Ichida JK,et al.(2009),Cell Stem Cell.5:491-503、Heng JC,et al.(2010),Cell Stem Cell.6:167-74、Han J,et al.(2010),Nature.463:1096-100、Mali P,et al.(2010),Stem Cells.28:713-720、Maekawa M,et al.(2011),Nature.474:225-9.中记载的组合。

可以从iPS细胞分化诱导RPE细胞(例如，Neurosci.Lett.,458:126-131,2009；PLoS One,8:409-412,2011)。或者，也可以使用WO2015/053375、WO2015/053376、WO2015/125941、WO2017/043605等中记载的方法。

本发明的条状聚集体是通过RPE细胞彼此的粘附形成的。这种情况下，细胞彼此进行粘附是指在本发明的条状聚集体中RPE细胞和RPE细胞进行面粘附(plane attachment)。细胞和细胞进行面粘附是指细胞和细胞通过面进行粘附。更具体地，细胞与细胞进行面粘附是指在一个细胞的表面积中与另一个细胞的表面粘附的比例为例如1％以上，优选3％以上，更优选5％以上。细胞的表面可以通过对膜进行染色的试剂(例如DiI)进行染色、或通过细胞粘附因子(例如E-钙粘蛋白或N-钙粘蛋白)的免疫染色来观察。

2.视网膜色素上皮细胞的条状聚集体的制造用装置

本发明还提供了用于制造视网膜色素上皮细胞的条状聚集体的装置(以下称为本发明的装置或该装置)。

如图1所示，本发明的装置具有作为该装置的主体部分的基体部件110。在该基体部件110的上表面110a上设置有1个以上的槽120。在图1中，为了说明而描绘为仅设置有一个槽，但在优选的方式中，如后所述，多个槽相邻配置，而且以槽与槽之间不存在上表面(平面)的方式，将槽的横截面形状设为V字形。该槽120具有空腔部分，该空腔部分具有要形成的条状聚集体的长度和与该条状聚集体的外径对应的宽度。在图1的例子中，槽120的底部部分是空腔部分。该空腔部分是在该空腔部分内接种的视网膜色素上皮细胞能够生长为条状聚集体的凹状的模具。通过该结构，将适当量的视网膜色素上皮细胞a1与液体培养基(未图示)一起接种到如图1的(a)所示的该装置的槽120内进行培养时，得到具有与空腔部分的长度和宽度对应的形状的条状聚集体A1，如图1的(b)所示。通过该装置得到的条状聚集体具有沿空腔部分平滑地成型的主干面(图1的(b)的条状聚集体A1的下侧的面)和自由生长而隆起的面(图1的(b)的条状聚集体A1的上侧的面)。

(基体部件)

基体部件的整体形状和尺寸没有特别限定，可以利用具有能够形成1个以上可形成要制造的条状聚集体的空腔部分的上表面的形状和尺寸。从不占用多余的场所、制造容易、聚集体制造时的操作容易这点出发，可以例示板状为优选的形状。在图5的(a)的例子中，基体部件110的整体形状为圆板状。基体部件为板状时的外周形状并不限定于圆形(即圆板状)，也可以是正方形或长方形等。在可配置为在通常为圆形的市售的培养皿内不产生死角这点上，圆板状是优选的形状。另外，根据用途，包围外周的壁部、向侧方突出延伸的凸缘、用于操作的把手部、设置在背面侧的脚部、规定空腔的记号(文字、数字、QR码(注册商标)等)的印字、刻印(凹或凸)、标签的粘贴、用于知道培养的条状聚集体的长度的尺寸刻度的印字、刻印、标签的粘贴等各种的附加部分可通过一体成型或安装单独的零件来设置。

(槽和空腔部分)

如图2的(a)所示，槽120整体可以是空腔部分，如图2的(b)、(c)、(d)所示，也可以是槽120的底部是空腔部分121，空腔部分上具有上部122的结构。在图2的(a)所示的方式中，条状聚集体也可以从槽的开口向外突出而隆起。

如图2的(b)～(d)所示，在槽120的内部结构为具有作为底部的空腔部分121和位于其上的上部122的结构的情况下，空腔部分121和上部122也可以如这些图的例子那样相互一体地形成，如图2的(e)和图3所示，可以相互可分离成上下两个(将单独的部件的组合起来)。虽然图2的(e)的方式是对图2的(d)的方式的改变，但是也可以使图2的(b)、(c)等各种槽中的空腔部分和上部为可分离的。另外，分离的边界面没必要一定要与空腔部分和上部的边界面一致，也可以是空腔部分和上部一体形成、上部能够分离为上下两个的结构。如果是这样的可分离为上下两个的结构，则如图3的(b)所示，能够仅使空腔部分121露出，能够更容易地取出培养后的条状聚集体A1。另外，如果是这样的可分离为上下两个的结构，则还具有不需要形成深的槽、槽的轮廓的自由度变大的制造上的优点。

图3是示出了用于使空腔部分和上部可分离的装置的具体方式例的图。在该方式中，如图3的(a)所示为组装状态，基体部分110包括第一基体部分111和配置在其上的第二基体部分112。如图3的(b)所示为分离状态，第二基体部分112可从第一基体部分111拆下。在第一基体部分111上设置有槽120的空腔部分121，在第二基体部分112上设置有槽120的上部122。虽然在图中未示出，但对于第一基体部分111和第二基体部分112，为了它们相互以规定的位置关系(即，一个空腔部分121和一个上部122一致地形成一个槽120的位置关系)连接，优选地赋予定位结构。对这样的定位结构没有特别限定，例如可以适当采用定位用的凸部和容纳该凸部的定位用凹部、相互不偏移地嵌合的外周形状(圆柱和圆孔以外的形状)等以往公知的定位结构。

在基体部分110如上所述可分离为多个部件(例如，第一基体部分111和第二基体部分112)的情况下，各个部件的材料可相互不同。例如，在设有空腔的第一基体部分111，优选使用具有优选地能够培育条状聚集体的生物相容性(对应于GCP:良好的临床实践)，且细胞不易附着以能够容易地将条状聚集体从空腔剥离取出的材料(这种材料也可用于第二基体部分112)。另外，在第一基体部分111和第二基体部分112两者中，优选使用能够进行灭菌处理的材料(例如，具有能够进行高压釜加热的耐热性、能够进行伽马射线照射的耐放射线性、EOG灭菌适合性的材料)、廉价且加工容易的材料。

(条状聚集体的形状)

为了说明空腔部分的形状，在此说明条状聚集体的形状。

在本发明中，条状聚集体是RPE细胞以形成条状的方式随机细长地聚集而成的聚集体，也可以不像生物体内的视网膜色素上皮那样具有明确的顶端和基底的极性，只要是具有在移植时通过针或管状的移植用吸头等能够高效地将目标细胞数作为一块取出放入的程度的强度的聚集体，就没有特别限制。另外，在本发明中，条状聚集体的“条状”与公知的细胞块或细胞片中所见的形状相比，是具有明显长度方向的细长形状，即在某一个方向上较长地延伸的形状。该细长形状如图4的(a)中作为用于说明的模型所示，是如下形状，即在将该条状聚集体形成为直线状时的全长L1与主干的外径d1的比率(L1/d1)为2以上，更优选为5以上，进一步优选为10以上，进一步更优选为20以上，特别优选为50以上。如果是具有上述比率(L1/d1)、特别是上述的下限比率2的形状，则与单纯的细胞块相比，能够规定方向(即，作为条状聚集体的长度方向)。即，在重视取向性的组织中，通过预先适当地规定方向，具有能够得到更理想的组织的效果。

另外，如果是具有如上所述比率的条状聚集体，则能够作为一个细长的结构体，使该条状聚集体通过注射器针的内部进行输送，另外，能够更显著地得到通过一次操作能够大范围有效地输送、配置细胞这样的效果，而且由于能够通过公知的细胞片难以通过的狭小部(例如微小的贯通孔等)，因此能够更显著地得到能够抑制对生物体的侵袭性的效果。

当比率(L1/d1)低于上述下限2时，上述效果变得不显著。另外，比率(L1/d1)的上限没有特别限定，例如，即使全长L1比要移植该条状聚集体的对象部位的区域长，适当地切断即可。从避免该装置的槽过长这点、根据移植的细胞数计算出的聚集体的尺寸、输送上的限制(例如注射器针的长度)这点考虑，比率(L1/d1)的上限可例示为1000左右，更优选为200左右，特别优选为100左右。

上述比率(L1/d1)的下限和上限，例如，如比率(L1/d1)＝2～1000、5～1000、10～1000、20～1000、50～1000、10～200、20～200、50～200、2～100、5～100、10～100、20～100、或50～100那样，可以自由选择组合以确定该比率的范围。在通过本发明的实施例中制作的装置得到的条状聚集体中，比率(L1/d1)为2～100左右。该比率下限是聚集体为“条状”的形状所需的最低限度的值，该比率的上限没有特别限定，可以根据培养设备的空间上的限制、外径d1的范围、分割为适于细胞移植的长度的工夫等，适当地确定该比率的上限。

(条状聚集体的主干的外径d1)

在使用该装置制作条状聚集体的情况下，该条状聚集体的横截面形状(将该条状聚集体沿垂直于其长度方向切断时的截面形状)如图2的(a)～(d)所示，培养时的下侧部分为沿着空腔部分的形状，上侧部分为自由增殖的形状。因此，条状聚集体的主干的外径d1根据测定的方向而不定。这样的外径d1也可以采用在多个方向上测定的外径值的平均值，但如图4的(b)所示，在条状聚集体在空腔部分生长的状态下，和装置一起进行观察(即，从图4的(b)的上方观察槽内)，采用此时看到的主干的宽度尺寸作为条状聚集体的外径d1较为方便。另外，在这样的观察中，由于该条状聚集体沿着空腔部分呈直线状，因此能够容易地测定全长L1。

(条状聚集体的横截面形状)

条状聚集体的横截面形状没有特别限定，通常为不定形，但从营养成分、氧的供给、代谢物的排出的角度考虑，期望从组织表面到组织内部的距离为一定的，另外，从能够更顺畅地通过注射器针等狭小部这点、槽的空腔部分的横截面形状更平滑地弯曲的方式更有利于细胞的增殖和剥离这点等考虑，优选接近圆形或椭圆形的形状。

(适用于生物体时的条状聚集体的尺寸例)

如上所述，对条状聚集体的长度没有限制，在过长的情况下，应用于生物体时可以适当地切断。作为应用于生物体时的优选尺寸，例示为例如，全长L1为20μm～200mm左右，优选20μm～40mm左右，更优选1mm～40mm左右，进一步优选5mm～40mm左右。作为适合24G针的长度的长度的一例，可列举出10mm～20mm左右。这些全长L1的值并不是只存在一个最优选的范围或值，而是可以根据装置的规模、允许的槽的长度、所需的细胞数、用于移植的器具的管路(例如注射针)的长度等适当地选择优选的范围或值。

另外，关于外径d1，可列举为10μm左右(对应于1个细胞左右的外径)～300μm左右(与24G针的内径对应的外径)，优选为20μm～300μm左右，更优选100μm～250μm左右。这些外径d1的值也不是只存在一个最优选的范围或值，而是可以根据装置的规模、允许的槽的空腔的内径、所需的细胞数、用于移植的器具的管路(例如注射针)的内径等适当地选择优选的范围或值。

将注射针穿刺到眼球上，将该条状聚集体通过该注射针送入眼底区域等目标部位进行移植时，使用的注射针的优选内径为10～300μm左右。在这种情况下，优选地能够在注射针内移动的条状聚集体的外径d1例如为该注射针内径的80～95％，优选为90％左右。因此，在这种情况下，条状聚集体的外径d1例示为100μm～270μm左右作为优选的尺寸范围。而且，从对移植有效且适合于注射针的长度这点考虑，此时条状聚集体的优选长度L1例示为20μm～200mm左右，优选20μm～40mm左右，更优选1mm～40mm左右，进一步优选5mm～40mm左右。因此，通过注射针输送条状聚集体时的优选比率(L1/d1)例示为40～200，优选为80左右。另外，此时细胞数例示为1.5×10

如上所述，本发明的条状聚集体可以通过上述全长L1与主干的外径d1的比率(L1/d1)来表征。因此，本发明的条状聚集体可以具有全长L1与主干的外径d1的比率(L1/d1)为2～1000的特征。另外，L1/d1通常可以为2～1000，但也可以为5～1000、10～1000、20～1000、50～1000、10～200、20～200、50～200、2～100、5～100、10～100、20～100、或50～100。

本发明的条状聚集体可以通过横截面形状来进一步表征。如上所述，条状聚集体的横截面形状没有特别限定，通常为不定形，但优选为接近圆形或椭圆形的形状。因此，本发明的条状聚集体可以进一步具有横截面形状为圆形或椭圆形的特征。

(空腔部分的横截面形状)

该装置的槽内的空腔部分优选具有与上述条状聚集体的形状对应的横截面形状和长度。空腔部分的横截面形状是将该空腔部分沿垂直于槽的长度方向切断时的截面形状。该空腔部分的横截面形状还可以进一步考虑细胞培养性、脱模性等来适当确定，作为优选的横截面形状，可例示圆弧状、半圆状、上部敞开的矩形、U字形、V字形等。上述矩形或V字形中的弯折部分(角)，从使用镊子或注射器针等取出条状聚集体的操作容易这点、优选将条状聚集体的横截面形状设为接近圆形的形状这点等考虑，优选带有圆弧。该角的圆弧的曲率半径没有特别限定，但可列举出条状聚集体的外径d1的一半左右(例如半径5μm～150μm左右)作为优选的值。另外，优选地，图4的(b)所示的空腔部分的宽度W1与条状聚集体的外径d1相同。

(槽的优选方式)

在优选的方式中，如图2的(c)、(d)和图4的(b)所示，槽的底部是空腔部分121，在空腔部分上具有上部122，并且上部122的横截面形状是随着从底侧朝向开口侧去宽度逐渐扩大的形状。槽整体的横截面形状为V字状，其最深部作为上述的空腔部分，带有圆弧。通过这种V字状的横截面形状，以悬浮液的状态接种的细胞被引导到底部的空腔部分内，接种的操作也变得容易，另外，条状聚集体容易从槽内出来，取出操作变得容易。

槽整体的深度(图4的(b)所示的B1)没有特别限定，优选为5μm～5000μm左右(比一般的培养皿的深度短5mm左右的尺寸)，更优选为5μm～1600μm左右。

空腔部分的深度(图4的(b)所示的尺寸b1)作为与要形成的条状聚集体的外径d1对应的尺寸，优选为5μm～300μm左右，更优选为5μm～250μm左右。

槽的开口部的宽度(图4的(b)所示的W2)没有特别限定，优选为560μm(24G针的外径)～5000μm(1mL移液器吸头的前端直径)左右，更优选为1000μm～3000μm左右(装置的大致值)，更优选为1500μm～2500μm左右。

在槽整体的横截面形状为如上所述的V字状的情况下，其内壁的倾斜角度(图4的(b)所示的θ1)优选为1～90度左右，更优选为40～70度左右。槽整体的横截面形状可以根据培养等所需的细胞悬浮液的量、细胞的数量、收纳的容器的尺寸等适当地确定。

槽的长度优选与要形成的条状聚集体的长度相同，但也可以更长。

槽的横截面形状的上部可以是如图4的(b)所示的直线，也可以是如图5的(b)所示，以随着从底侧向开口侧去宽度逐渐变大的方式弯曲的曲线。这样的弯曲也可以理解为在图4的(b)所示的直线的V字状的开口部分的边缘上带有圆弧。

(槽的配置模式)

在优选的方式中，如图5所示，在基体部件110的上表面110a上以形成平行条纹状的方式配置有多个(在图的例子中为5个)槽120。由此，通过一次培养可以得到多个条状聚集体，因此提高了生产效率。槽的数量没有特别限定，根据从实验用途到商业用的生产规模，可以与基体部件的尺寸一起适当地确定。在图5的(a)、(b)所示的例子中，槽120的横截面形状的上部是以随着从底侧向开口侧去宽度逐渐变大的方式弯曲的曲线，与基体部件的上表面或相邻的开口平滑地连接。在图5的(b)中，为了容易理解用单点划线表示相邻的槽彼此的边界线、槽与基体部件110的上表面110a的边界线130。

在以形成平行条纹状的方式配置多个槽的情况下，在优选的方式中，如图5所示，将相互相邻的槽彼此隔开的壁部在该基体部件的上表面不具有平面部分，相互相邻的槽的开口彼此相互接触。在槽整体的横截面形状为V字状的情况下，优选实现这样的结构。通过这样的结构，能够更紧密地配置槽。使用该装置进行培养的情况下，可以仅向槽内注入培养液和细胞进行培养，也可以将该装置整体浸渍于培养液中，接种细胞进行培养。在将该装置整体浸渍于培养液中，然后接种细胞进行培养的情况下，不易发生被接种的细胞堆积在槽彼此之间的平面上，更多的细胞落入槽内，因此是优选的。

(基体部件的材料)

基体部件材料(即，该装置的材料)没有特别限定，优选金属或聚合物等适合细胞培养的材料且便宜、容易制造的材料，以往作为细胞培养用容器的材料使用玻璃或各种聚合物材料(例如聚苯乙烯、聚碳酸酯、丙烯酸、有机硅、环烯烃聚合物(COP等)是优选的。其中，作为有机硅的一种的聚二甲基硅氧烷(PDMS)由于具有容易使用模具成型、能够利用高压釜进行加热、具有柔软性、耐药品性高、可适用于微细加工工艺的优点，因此作为更优选的材料被例示。

(该装置的制造方法)

该装置的制造方法可以根据材料适当地确定，可以利用通过压制的塑性变形、使用模具的树脂成型、切削、3D打印、针对基体部件的上表面的减材槽形成、针对基体部件的上表面的加材槽加工、激光加工等各种方法。

在基体部件的材料为PDMS的情况下，优选使用具有与槽的形状对应的凸状模的成型模，将固化前具有流动性的PDMS流入该成型模(或与凸状模接触)，在此状态下使PDMS固化而得到成型品(该装置)的制造方法。PDMS通过例如80℃、3小时左右的加热而固化，成为PDMS。

(成型模的优选制造方法)

示出了成型模的优选制造方法的一个例子。图6是示出了成型模的优选制造方法的一个例子的图。

在该制造方法的例子中，首先，如图6的(a)、(b)所示，在模基板210的一个面210a上，根据槽的中心间节距形成与槽的形状对应的成为凸状模的芯的突起体220。

接着，如图6的(c)、(d)所示，以覆盖上述突起体220的方式，涂布具有流动性的固化前的聚合物原料(例如PDMS)，使其固化，得到V字状的凸状模240。这里，在涂布聚合物原料时，利用该聚合物原料的流动性、粘性、表面张力等，如图6的(c)所示，使该涂层230的横截面形状成为与要成型的槽的形状对应的V字状的凸状模的形状。由此，从简单形状的芯容易地得到V字状的凸状模。

作为将液状聚合物原料控制为图6的(c)所示的V字状的条件，可以例示如下条件：以覆盖上述突起体的方式，用25度下粘度3.5(Pa·s)左右的固化前的PDMS涂布，在室温(23℃～27℃左右)下在真空干燥器内脱泡的同时静置30分钟后，在80℃固化3小时。

在本发明的实施例中，通过3D打印机制作了图6的(a)、(b)所示的部件(具有突起体220的模基板210)(材料为聚乳酸(PLA树脂))，也可以通过3D打印机制作如图6的(c)所示的具有V字状的凸状模240的成型模200，也可以进一步加工表面。

图7是例示使用上述成型模来形成该装置的情况的截面图。如图7的(a)所示，通过在成型用容器(未图示)内的底面配置成型模200，或者用壁部件包围成型模200的周围来形成成型用容器，将固化前具有流动性的聚合物原料流入其中，在此状态下使聚合物原料固化来得到成型品(该装置)100。接着，如图7的(b)所示，从成型模200剥离成型品，得到该装置100。图8的(a)是示出在本发明的实施例中制作的成型模的基板面的照片图，在模基板210的一个主面上设有突起体220。另外，图8的(b)是示出在使用图8的(a)的成型模成型的本发明的实施例中制作的成型模的基板面的照片图，在模基板210的一个主面上设有突起体220。

3.视网膜色素上皮细胞的条状聚集体的制造方法

本发明还提供了一种聚集为条状的视网膜色素上皮细胞的制造方法(以下称为本发明的制造方法)。本发明的制造方法包括以下步骤：

(1)如图9的(a)所例示，将悬浮在液体培养基中的视网膜色素上皮细胞a1接种到本发明的装置100的槽120中的步骤；

(2)如图9的(a)所例示，培养视网膜色素上皮细胞a1，形成视网膜色素上皮细胞的条状聚集体A1的步骤(图中示出了从槽中取出一个条状聚集体的情况)。

在步骤(1)中，将悬浮在培养基中的视网膜色素上皮细胞接种到本发明装置的槽中。

在步骤(1)中，悬浮视网膜色素上皮细胞的液体培养基可以将通常用于动物细胞培养的培养基作为基础培养基来配制。作为基础培养基，能够列举出，例如BME培养基、BGJb培养基、CMRL 1066培养基、Glasgow MEM(GMEM)培养基、Improved MEM Zinc Option培养基、IMDM培养基、Medium 199培养基、Eagle MEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、F-12培养基、DMEM/F12培养基、IMDM/F12培养基、Ham培养基、RPMI 1640培养基、Fischer’s培养基或它们的混合培养基等能够用于动物细胞培养的培养基。培养中使用的培养基可以是含血清培养基，也可以是不含血清培养基。

本文中的含血清培养基是指含有未调整或未纯化的血清的培养基。对于含血清培养基的血清浓度，可列举出通常含有5％以下、优选3％以下的未调整或未纯化的血清的培养基。该培养基可以含有脂肪酸或脂质、氨基酸(例如非必需氨基酸)、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化剂、2-巯基乙醇、1-单硫代甘油、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类等。

本文中的不含血清培养基是指不含未调整或未纯化的血清的培养基。在本发明中，混入纯化的血液来源成分或动物组织来源成分(例如生长因子)的培养基只要不含有未调整或未纯化的血清，也包含在不含血清培养基中，。

不含血清培养基可以含有血清替代物。作为血清替代物，可以列举出例如适当含有白蛋白、转铁蛋白、脂肪酸、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇、3’硫醇甘油等或它们的等同物等的血清替代物。这些血清替代物可以例如通过WO98/30679中记载的方法制备。作为血清替代物，也可以利用市售品。作为这种市售的血清替代物，可以列举出例如，Knockout

培养中使用的不含血清培养基可以适当含有脂肪酸或脂质、氨基酸(例如非必需氨基酸)、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化剂、2-巯基乙醇、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类等。

在步骤(1)中悬浮视网膜色素上皮细胞的培养基可以进一步包含ROCK抑制剂。

在本发明中，ROCK抑制剂只要是能抑制Rho激酶(ROCK)作用的物质就不受限制。Rho激酶(ROCK)被发现是位于低分子量G蛋白Rho下游的丝氨酸/苏氨酸激酶。Rho/ROCK信号转导途径涉及多种细胞功能，如肌动蛋白细胞骨架和细胞粘附等。在iPS细胞的传代培养中，需要使细胞分散，但已知如果这些干细胞在被分散的状态下培养，会由于细胞凋亡而引起细胞死亡。据报道，Rho/ROCK信号转导途径与分散引起的细胞凋亡有关，通过添加ROCK抑制剂来抑制细胞凋亡(凋亡抑制作用)。此外，有报道称，如果在冷冻保存细胞时添加ROCK抑制剂，可提高解冻后的细胞存活率(细胞存活率改善作用)。根据这些报道，在iPS细胞的增殖培养时添加ROCK抑制剂。另外一方面，再生医疗用产品中通常使用平衡盐类溶液或DMEM/F12培养基等基本培养基，不包含外源性成分，但本发明人发现等除了上述作用之外，如后述的实施例那样，使用适当浓度的ROCK抑制剂进行条状聚集体的制作时，具有条状聚集体更稳定，进一步促进RPE细胞的条状聚集体在移植部位的植入和细胞生长的新作用。

在本发明中，ROCK抑制剂可以是任何分子，只要其具有与新发现的上述作用(条状聚集体形成促进作用)同质或实质上同质的作用。“实质上同质”表示这些作用在定性(例如生理学或药理学)上相同。因此，上述作用优选相同，但这些作用的程度(例如约0.1～约10倍，优选约0.5～约2倍)也可以不同。上述作用的测定可以按照本身公知的方法进行。作为这种ROCK抑制剂，可列举出例如Y-27632二盐酸盐(dihydrochloride)、Y-27632、盐酸法舒地尔(Fasudil Hydrochloride)、Chroman 1、SLx-2119、HSD1590、GSK269962A盐酸盐(hydrochloride)、胞外酶(Exoenzyme)C3,肉毒梭状芽孢杆菌(clostridium botulinum)、利帕舒地尔(Ripasudil)、Afuresertib、Thiazovivin、GSK269962A、RKI-1447、Y-33075、GSK429286A、AT13148、H-1152二盐酸盐、Y-33075二盐酸盐、LX7101、SAR407899、ROCK-IN-2、Afuresertib hydrochloride、羟基法舒地尔(Hydroxyfasudil)、GSK180736A、BDP5290、SR-3677、CCG-222740、CMPD101、Rho-激酶-IN-1、SAR407899盐酸盐、ROCK抑制剂-2、ZINC00881524、H-1152、羟基法舒地尔盐酸盐、法舒地尔、ROCK2-IN-2、维罗舒地尔(Verosudil)、SB-772077B二盐酸盐、GSK-25、CRT0066854盐酸盐、无碱利帕舒地尔(Ripasudil free base)、ROCK-IN-1等，优选地，可列举出Y-27632二盐酸盐、Y-27632。

ROCK抑制剂可以通过自身公知的方法制造。另外，ROCK抑制剂也可以购买市售品来使用。例如，Y-27632可以从富士胶片和光纯药株式会社等处购买。另外，Ripasudil以Glanatec(注册商标)(Kowa)、盐酸法舒地尔(Fasudil Hydrochloride)以Eril(注册商标)(旭化成制药)等商品名市售。

培养基中含有的ROCK抑制剂的浓度，只要在本发明的装置的槽中使RPE细胞形成条状聚集体，就没有特别限制，通常为0μM～20μM，优选2μM～10μM。当ROCK抑制剂的浓度过高时，本发明的聚集体可能聚集得过硬，从而影响移植后细胞的扩散。

在步骤(2)中，培养在步骤(1)中接种的视网膜色素上皮细胞。

在步骤(2)中，只要视网膜色素上皮细胞在本发明的装置的槽中形成条状聚集体，在槽内培养的视网膜色素上皮细胞的密度就没有特别限制，通常为2.5x10

只要通过步骤(2)可以得到视网膜色素上皮细胞的条状聚集体，步骤(2)中的视网膜色素上皮细胞的培养时间就没有特别限定，通常为1天～30天，优选为2天～7天。无论培养期更长或是更短，本发明的聚集体在更换培养基时都有可能从本发明的装置脱模。

步骤(2)中的培养温度、CO

4.起因于视网膜组织障碍的疾病的治疗药物

如上所述得到的本发明的视网膜色素上皮细胞的条状聚集体，对于起因于视网膜组织障碍的疾病，例如起因于视网膜色素上皮障碍的疾病的移植医疗是有用的。因此，本发明提供一种起因于视网膜色素上皮障碍的疾病的治疗药物(本发明的治疗药物)，该治疗药物包含视网膜色素上皮细胞的条状聚集体。

本发明的治疗药物包含有效量的视网膜色素上皮细胞的条状聚集体和医药上可接受的载体。本发明的治疗药物中包含的视网膜色素上皮细胞的条状聚集体，可列举出通过本发明的制造方法制造的条状聚集体。

作为医药上可接受的载体，可以使用生理性的水性溶剂(生理盐水、缓冲液、无血清培养基等)。根据需要，在移植医疗中，也可以在含有移植的组织或细胞的药物中，配合通常使用的防腐剂、稳定剂、还原剂、等渗剂等。

本发明的治疗药物可以通过使视网膜色素上皮细胞的条状聚集体漂浮在适当的生理性水性溶剂中而制造为漂浮液。如果需要，可以添加冷冻保存剂冷冻保存，使用时解冻，用缓冲液清洗，用于移植医疗。

作为起因于视网膜色素上皮障碍的疾病的治疗药物，或者，为了在视网膜色素上皮萎缩或损伤状态下补充该萎缩/损伤部位，可以使用本发明的视网膜色素上皮细胞的条状聚集体。对于需要移植的、起因于视网膜色素上皮障碍的疾病或视网膜色素上皮萎缩或损伤状态的患者，通过移植本发明的视网膜色素上皮细胞的条状聚集体来补充视网膜色素上皮，可以治疗起因于视网膜色素上皮障碍的疾病或视网膜色素上皮萎缩或损伤状态。作为起因于视网膜色素上皮障碍的疾病或伴随视网膜色素上皮萎缩或损伤状态的疾病，例如可列举出为眼科疾病的增龄性黄斑变性症、视网膜色素变性症、视网膜色素上皮裂孔等。

只要是注入到疾病部位、即黄斑变性症或视网膜色素变性症中视网膜色素上皮缺损部位的漂浮液(例如50～500μL，优选100～300μL)中包含含有治疗上有效量的RPE细胞的视网膜色素上皮细胞的条状聚集体，本发明的治疗药物中的视网膜色素上皮细胞的条状聚集体的含量就没有特别限制，例如可以以RPE细胞为100～20000细胞/μL，优选1000～10000细胞/μL的方式，注入视网膜色素上皮细胞的条状聚集体的漂浮液。本发明的治疗药物不伴随着难以控制如RPE细胞的悬浮液这样的在移植部位中的细胞，并且移植的细胞也不会在玻璃体中形成视网膜前膜(ERM)。另外，本发明的治疗药物不用像RPE片那样在片的准备上花费时间、成本，也不需要伴随大切口的侵袭性外科处理。

本发明的治疗药物可以通过使用含有适当注射器和针的移植用装置(例如MedOne0(注册商标)Poly Tip(注册商标)套管25g/31g等)，注入到具有例如黄斑变性症(例如，增龄性黄斑变性症、视网膜色素变性症等)、视网膜色素变性症等视网膜疾病的哺乳动物(例如，人、小鼠、大鼠等，优选人)的视网膜下，来进行移植。作为在移植本发明的治疗药物时使用的介质，可以使用通过OptimEM将粘弹性物质(Shellgan、VISCOAT等)稀释了4-8倍的介质。通过利用移植用介质，能够顺利地实施本发明的视网膜色素上皮细胞的条状聚集体的吸入及排出。

以下列举实施例来对本发明进行详细说明，但本发明并不限定于这些。

实施例

实验步骤

所有动物实验协议均获得理化学研究所生物系统动力学研究(BDR)中心动物护理委员会的批准，并根据当地的指导方针和关于在眼睛和视觉研究中使用动物的ARVO声明实施。hiPS细胞是得到理化学研究所生物系统动力学研究(BDR)中心伦理委员会的批准，从志愿者那里得到了手术同意书而制作的。

实施例1

用于hiPSC-RPE的条状聚集体制作的基于PDMS的培养装置的制作

制作具有长度19.5mm、宽度1mm、深度1.6mm的槽的基于PDMS的培养装置。对该装置的制作工艺进行了总结。首先，通过使用聚乳酸(PLA)长丝的3D打印，制作本装置用的模具。切削3D打印的模具，为了调整槽的形状而涂布PDMS后，在模具上涂布脱模剂(Novec1720、住友3M公司制)。将PDMS和PDMS用固化剂(SYLGARD(サイポット)184W/C)(道康宁东丽公司制造)以10:1的比例混合，注入到3D打印的模具上，脱气约1小时。然后将3D打印的模具和PDMS的混合物在80℃的烘箱中放置3小时。将固化的PDMS从3D打印的模具中回收并进行整修。用共聚焦扫描型激光显微镜(KEYENCE、VK-8710)测量槽底的曲率半径，结果为R 0.2mm(图10)。

源自人IPSC(hiPSC)和hiPSC的RPE细胞(hiPSC-RPE)的制备

通过在健康志愿者的外周血单核细胞(PBMCs)中导入6个重编程因子(OCT3/4、SOX2、KLF4、L-MYC、LIN28和p53羧基末端显性负性片段)，在本发明的发明人的研究室中建立M8人iPSC株。简单地说，将游离型载体(从Addgene购买的pCE-hOCT3/4、pCE-hSK、pCE-hUL、pCE-mp53DD、pCXB-EBNA1)电穿孔到PBMC中，然后如以前所记载地挑出iPSC样集落(Okita等人，2011)。在多次传代后，本发明的发明人使用从iPSC样细胞中提取的DNA进行PCR分析，确认到通过质粒特异性引物未检测出游离型载体的残留。

从理研生物资源中心获得了201B7株和253G1 hiPSC株(Nakagawa等,2008年；Takahashi等,2007年)。为了使细胞周期的G1期和细胞体整体可视化，在发明人的研究室中制备了改型Fucci 201B7株(201B7modFucci)。简而言之，从tFucci(CA)2/pCSII-EF载体(A.Miyawaki老师的赠与；https://cfm.brc.riken.jp/lentiviral-vectors/plasmid-list/)切出mCherry-hCdt1(30/120)-P2A-mVenus区域，与从Addgene(Plasmid#80489)获得的pAAVS1-Nst-CAG-DEST载体连接。使用DNA-in CRISPR递送培养基(MTI-GlobalStem,Gaithersburg,MD)将201B7与改型Fucci构建体(其编码设计为靶向AAVS1基因座的gRNA)和Cas9载体(Addgene Plasmid#62988)共转染(Oceguera-Yanez等，2016)。转染后，解离mVenus阳性201B7集落，传代，挑出来自单一克隆的集落。

用SFEBq法(Kuwahara et al.，2015、2019；Nakano et al.，2012)使hiPSC-RPE细胞分化。简单地说，在分化诱导的前一天将5μM SB431542(Sigma-Aldrich)和300nM SAG(Enzo Life Sciences，Inc)添加到iPS细胞中。在第0天，将iPS细胞悬浮在IMDM:F12(1:1，Life Technologies)、10％Knockout血清替代物(Knockout Seum Replacement,KSR)、1％Chemically Defined Lipid Concentrate(Life Technologies)、30w/v％BSA(无脂肪酸)、450μM单硫代甘油、30nM SAG、20μM Y-27632(富士胶片和光纯药株式会社)和青霉素-链霉素的无生长因子的化学限定培养基(gfCDM)中，并在PrimeSurface96V(住友电木株式会社)中培养。在第6天，加入1.5nM BMP4，每3天更换一半gfCDM。在第18天，使用含有1％ N2补充剂(Life Technologies)、3μM CHIR99021(Stemgent，Cambridge)和5μM SU5402的DMEM/F12-Glutamax培养基，将细胞转移到超低培养皿(Ultra Low Culture Dish，康宁公司(Corning Incorporated))中。在第22天以后，细胞在含有1％N2补充剂、10％胎牛血清(Biosera)、0.5μM维甲酸(sigma)、0.1mM牛磺酸(sigma)和1x抗生素抗真菌药物(gibco)的DMEM/F12-Glutamax培养基(Life Technologies)中培养。

在第30天至第60天期间，挑选色素性集落，在“RPE粘附培养基”和“RPE维持培养基”的1:1混合培养基(下文称为“混合培养基”)中，涂敷到用iMatrx511包被的12孔板上。“RPE粘附培养基”包括DMEM/F-12(Sigma-Aldrich)、10％胎牛血清(SAFC BiosciencesInc.)、庆大霉素溶液(Sigma-Aldrich)，“RPE维持培养基”包括DMEM-低葡萄糖(Sigma-Aldrich)、30％ F-12(Sigma-Aldrich)、2％ L-谷氨酰胺溶液(Sigma-Adrich)、2％ B-27

在每个实验中，将储存的细胞解冻并接种到混合培养基中，然后将培养基更换为补充有10ng/mL bFGF和0.5μM SB431542的RPE维持培养基，每隔几天更换培养基，直到使用细胞。如Kitahata et al.，2019中所记载的那样，制备从253G1株分化的RPE细胞。

条状聚集体的制作

解冻后，将hiPSC-RPE细胞培养2周，收集细胞，使用包含最佳浓度的Y-27632的15μl RPE维持培养基(在每个实验中所示的浓度)，以每个实验中描述的细胞数接种到基于PDMS的培养装置的每个槽中。

来自涂敷的条状聚集体的RPE的扩展面积的分析

将条状聚集体从装置的槽中脱模，将条状聚集体接种到加入了混合培养基的非包被24孔板(康宁公司)，在条状聚集体粘附后(2-3天后)更换成RPE维持培养基(包括bFGF和SB431542)。使用IncuCyte Zoom系统(Essen BioScience)拍摄培养中的培养皿。根据得到的图像数据，手动使用Fiji来标记扩展的细胞，测定扩展的面积。

免疫组织化学

将培养的条状聚集体或细胞在室温下用4％多聚甲醛固定15分钟。将移植的眼睛用4℃的4％多聚甲醛固定1小时，固定后除去角膜。冷冻切片用样品在30％蔗糖中浸渍1天以上，用OCT复合物(Sakura Finetek Japan Co.，Ltd.)冷冻，制作厚度为10μm的低温切片。样品用在磷酸缓冲盐水中的0.2％Triton X-100渗透30分钟，用Blocking One(NacalaiTesque)在室温下封闭1小时，用抗体稀释液(Dako)稀释的一抗在4℃下孵育一晚。使用的抗体记载在表1中。将二抗在室温下处理1小时，使用共聚焦显微镜(LSM700；Carl Zeiss)和荧光显微镜(BZ-X810；KEYENCE)获得图像。

[表1]

RPE标记基因的PCR

使用微量RNA提取试剂盒(RNeasy Micro Kit)(Qiagen)从细胞中提取总RNA，使用SuperScript III逆转录酶试剂盒(Invitrogen)合成cDNA。RPE标记(BEST1、RPE65、CRALBP)以及持家基因(GAPDH)的引物序列如表2所示。使用Blend Taq-Plus-(TOYOBO Co.，Ltd.)进行PCR反应。热循环条件如下。在94℃进行1个循环180秒，进行94℃、30秒变性、58℃、30秒退火、72℃、60秒延伸的32个循环，之后在72℃进行60秒的1个循环。

[表2]

体外RPE伤害模型

用6μg/mL的丝裂霉素C(kyowa hakko KIRIN)对24孔板中汇合培养的RPE细胞进行处理，第二天用约6mm宽的细胞刮板刮除RPE细胞的一部分。将细胞悬浮液(2x10

VEGF和PEDF的ELISA

VEGF和PEDF的ELISA分别根据VEGF人ELISA试剂盒(Life Technologies)和人PEDFELISA试剂盒(Biovendor)的制造商操作说明进行。

向大鼠的眼睛的移植

从CLEA Japan获得免疫缺陷F344/NJc1-rnu/rnu雌性裸大鼠(6周龄)。用微型拉针仪(Sutter，P-97/IVF Puller)拉出一次性微量移液管(Drummond，1000-0500)，使用微型磨针仪(Narishige，EG-400)切断前端并研磨。然后，将微量移液管安装在电极手柄6.3mm(WPI、2505)上的电极保持器(WPI、MPH 310)上，使用延长管使其与10μl微型注射器(Hamilton，1701LT)结合。通过吸入5％异氟烷来麻醉动物，用0.4％托吡卡胺散开瞳孔。将条状聚集体装入微量移液管中，将条状聚集体移植到视网膜下。

向兔子的眼睛的移植

kbl:JW兔(9周龄)从东方酵母工业株式会社(东京)获得。动物通过肌肉注射60mg/kg的氯胺酮和10mg/kg的赛拉嗪来麻醉。在伴随后部玻璃体剥离的常规玻璃体手术后，将条状聚集体装入以特别定制的平切25G钝针为内芯的24G的留置针套管(TOP、SS-6)中。在通过25g/38g PolyTip套管(MedOne，25g/38g)制作局部视网膜剥离后，使用50μl微型注射器(Hamilton，1705LT)将移植片缓慢地注入剥离视网膜滤泡中。然后将全氟碳液体(Alcon，806590011)注入到剥离的视网膜上以压迫视网膜，使其附着，然后进行流体-气体交换。

结果

条状聚集态hiPSC-RPE的制备

我们总结了使用基于PDMS的培养装置的条状聚集体制备的方案。首先，将人IPSC-RPE细胞(253G1株)悬浮在“RPE维持培养基”、“RPE细胞片培养基(含有10％胎牛血清的F10培养基)”、或含有10μM Y-27632的“混合培养基”中，并接种到各个槽中。在片培养基中，条状聚集体看起来容易走样，但在维持培养基和混合培养基中，条状聚集体结构被很好地保持(图12A和图12B)。然后接种不同数量的细胞(4.5×10

针对条状聚集体的Y-27632浓度的优化

然后，将由4.5×10

在发明人的预备实验(图14A)中，Y-27632的浓度被认为在较高浓度下在条状聚集体收得较紧的方向上影响条状聚集体的质感。发明人对条状聚集体形成中Y-27632的浓度0、1、2、2.5及10μM进行了试验。hiPSC-RPEs(M8株)在2μM以上的浓度下能够形成条状聚集体的形态，但是在0和1μM的Y-27632下，条状聚集体不能很好地形成。由10μM的Y-27632形成的条状聚集体在放置于非包被孔后容易剥离，与由2-2.5μM的Y-27632形成的条状聚集体相比，更需要耗时来附着在24孔板上，扩展较慢(图14B和14C)。

接着，发明人直接比较了由Y-27632为2.5μM或10μM中任一个制备的条状聚集体(图13B-13G)。由2.5μM的Y-27632形成的条状聚集体看起来平坦而松散。另一方面，由10μM的Y-27632形成的条状聚集体看起来更紧密(图13B)。

用缝隙连接标记Z0-1、极性标记埃滋蛋白(顶端)、层粘连蛋白和胶原型IV(基底)对条状聚集体切片进行染色(图13C)。在这两种条件下，缝隙连接标记ZO1在细胞间表达，作为基底标记的层粘连蛋白分布在整个细胞表面上，并且作为顶端标记的埃滋蛋白看起来局限于在碎片化的细胞块的表面上。作为另一种基底标记的胶原IV没有明确表达，在这些条状聚集体中没有明确地确定细胞的极性。

接着，使用第2天(图13D和13E)和第3天(图13F和G)的条状聚集体，在由2.5μM和10μM Y-27632形成的条状聚集体之间，比较涂敷到非包被孔后细胞的扩展。由2.5μM的Y-27632形成的条状聚集体有在设置后从早期附着在板上，开始扩展的倾向。另一方面，由10μM的Y-27632形成的条状聚集体容易成为线圈状，在消退化、开始扩展之前的几天内到处移动。

使用其他hiPSC-RPE株的条状聚集体形成的再现性

本发明的发明人测试了其他hiPSC菌株是否能够同样地形成条状聚集体。本发明的发明人使用201B7modFucci株诱导RPE的分化，并与hiPSC(M8)-RPE进行比较。hiPSC(201B7modFucci)-RPE也与hhiPSC(M8)-RPE同样地形成了条状聚集体，但201B7modFucci株为了稳定地形成条状聚集体，需要Y-27632的浓度为5μM以上(图15-1A)。对hiPSC(201B7modFucci)-条状聚集体，粘附/扩展试验中最优的Y-27632浓度也是5μM，根据使用的细胞株，以粘附/扩展效果为目的的最优Y-27632浓度不同，需要优化。(图14D和14E)。从两个hiPSC株的条状聚集体扩展的细胞显示RPE细胞的特征性色素沉着和鹅卵石样外观，表达ZO-1和MITF(图15-1的B和C)。在条状聚集体形成前、条状聚集体形成中以及从条状聚集体扩展后的hiPSC-RPE的各阶段，通过聚合酶链反应(PCR)也确认了RPE特异性标记基因(BEST1、RPE65、RLBP1)的表达(图15-1D)。观察到RPE细胞在板上以单层状从条状聚集体扩展(图15-1E)。为了观察从条状聚集体的扩展是否伴随RPE的增殖，将条状聚集体放置在板上14天后的细胞总数与使用2×10

与原本用于形成条状聚集体的细胞相比，扩展的hiPSC-RPE分泌相同程度的VEGF和PEDF。(hiPSC(M8)-RPE n＝6和hiPSC(201B7modFucci)-RPE n＝6；两株条状聚集体形成前RPE细胞作为对照。n＝4)(图15-2G)。

通过利用细胞悬浮液或条状聚集体向体外RPE损伤模型的模拟hiPSC-RPE移植的RPE置换

为了研究条状聚集体或细胞移植如何能够补偿损伤的REE，发明人设计了在RPE损伤的环境中的hiPSC-RPE移植的体外模型，如图11A所示。简而言之，用MMC处理未包被的24孔板中的hiPSC-RPE(M8株)培养物，抑制细胞增殖，第二天在孔的中央部进行划线。第二天，将条状聚集体或悬浮细胞(201B7modFucci株)分别放置或接种在划线部分上，并使用Incucyte监测“移植”的RPE细胞的填充或置换(图11B)。

在对照孔(非供给孔)中，MMC处理过的已有的RPE逐渐扩展、迁移，使缺损区域缓慢减少。悬浮液中移植的RPE细胞迅速占据缺损区域。在使用条状聚集体的情况下，RPE从条状聚集体扩展直到与已有的RPE接触，由于接触阻碍，细胞从条状聚集体的扩展停止。在图11B’(条状聚集体和悬浮液；n＝5，对照；n＝3)中，在体外移植后第1天、第7天和第28天，测量缺损区域和被移植的RPE占据的区域的平均值并定量地示出。在条状聚集体中，通过移植的201B7modFucci细胞的mCherry表达和RPE细胞的大小来合理地鉴定已有RPE与移植的RPE之间的分界线；经MMC处理的非分裂RPE通常大于从移植的RPE扩展的RPE(图11C)。有趣的是，在已有和移植的RPE两个群组的整体上观察到缝隙连接标记ZO-1，其横跨而不干扰两个群组的分界线(图11D)。

此外，也监测VEGF(图11E)和PEDF(图11F)的分泌，作为用于估计每个孔中RPE整体功能的参数。VEGF的分泌在划线后显著减少，并且在28天后全部组的VEGF分泌增加。通过细胞悬浮液移植，VEGF分泌与MMC治疗前基本相同。移植组在划线后PEDF分泌减少。

条状聚集体移植时，一旦划线后PEDF分泌减少，但28天后与MMC处理前没有差异，在细胞移植时，在划线后PEDF分泌显著增加，但在没有细胞置换时，PEDF分泌持续减少(对照n＝4，条状聚集体n＝8，RPE细胞n＝7)。

条状聚集体向裸大鼠的移植

接着，本发明的发明人将在2.5μM或10μM的Y-27632下由2x10

根据光学相干断层扫描法(Envisu R220VHR，Bioptigen，Inc.)的剖面图在移植物表面呈现出明确的RPE样反射(图16B)。在同一眼的组织学分析中，条状聚集体的色素细胞层上呈现出人标记Ku80/XRCC5阳性(图16的C和D)。这些细胞明显表达了顶端(埃兹蛋白)和基底(胶原型IV)标记，并且在移植后显示出正确的极性(图16E)。

[表3]

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条状聚集体向兔子眼睛的注射

最后，使用兔子双眼确认了条状聚集体移植的手术技术在临床实践中的实用性。将条状聚集体装填入24G的静脉内套管中(图17)。在常规的玻璃体手术后，进行视网膜剥离，在良好的视觉控制下，成功向视网膜出血部注入条状聚集体(图18)。

实施例2

用于hiPSC-RPE的条状聚集体制作的基于COP的培养装置的制作

对环烯烃聚合物(COP)板(日本Zeon(株式会社)制)进行切削加工，制作具有长度20mm、宽度1mm、深度2mm的槽的基于COP的培养装置(槽底的R为0.5mm)(图19)。

hiPSC来源的RPE细胞(hiPSC-RPE)的制备

M8 hiPSC株(理研)通过SFEBq法进行分化诱导，QHJI01s04 hiPSC株(京大)通过NEngl J Med 2017；376:1038-46中记载的方法进行分化诱导，制备hiPSC来源的RPE细胞(hiPSC-RPE)，并通过与实施例1相同的方法在-150℃下储存细胞。

条状聚集体的制作

将解冻后培养2周的hiPSC-RPE细胞(M8株、QHJI01s04株)回收后，与包含5μM的Y-27632的10μl维持培养基一起以2x10

利用刚解冻后的细胞的条状聚集体的制作

将刚解冻后的hiPSC-RPE细胞接种到基于COP的培养装置的各槽中，2天后可形成条状聚集体。因此，可以将从细胞解冻到形成条状聚集体的时间缩短到2天。

条状聚集体的冷冻保存

将含有制作后的条状聚集体的培养基置换为STEMSELLBANKER，放入低温管中在-80℃暂时保存后，在-150℃进行冷冻保存。4个月后，将条状聚集体解冻，使其漂浮在混合培养基上，并将其涂敷在培养皿上。经确认，涂敷后的条状聚集体附着在培养皿上并扩展。

向兔子或猴子的眼睛的移植

确认了条状聚集体可以通过5g/31g、25g/33g、25g/38g的PolyTip套管(MedOne公司)吸入、排出。当使用通过OptimEM稀释了4-7倍的粘弹性材料(例如，Shellgan、VISCOAT等)作为介质时，能够顺滑地吸入或排出条状聚集体(图20)。确认了使用这些，实际上使用38g MedOne套管在兔子及猴子的视网膜下制作剥离后，可以通过25g/31g及25g/33g套管插入条状聚集体。另外，同样地，在猴子的眼球制作剥离后，通过约2μl的介质吸入长度20mm的hiPSC-RPE细胞的条状聚集体，插入到视网膜剥离部位，通过观察眼底，确认术后的眼底中也植入了条状聚集体(图21)。

产业上的可利用性

根据本发明，可制备能够以短时间、低成本准备并且移植的方法是非侵袭性的，同时在其移植部位可容易地控制的视网膜色素上皮细胞的移植材料。本申请以在日本申请的特愿2021-078154(申请日：2021年4月30日)为基础，其内容全部包含在本说明书中。

符号说明

100：装置

110：基体部件

110a：基体部件的上表面

111：第一基体部分

112：第二基体部分

120：槽

121：槽的空腔部分

122：槽的上部

130：槽与基体部件的上表面的边界线

200：成型模

210：模基板

210a：模基板的一个面

220：突起体

230：涂层

240:V字状的凸状模

a1：视网膜色素上皮细胞

A1：条状聚集体

b1：空腔部分的深度

B1：槽整体的深度

d1：条状聚集体的主干的外径

L1：条状聚集体的全长

W1：空腔部分的宽度

W2：槽的开口部的宽度

X1：沿槽宽方向延伸的切断线

θ1：槽的内壁的倾斜角度

序列表

<110>国立研究开发法人理化学研究所

<120>视网膜色素上皮细胞的条状聚集体、用于制造其的装置和制造方法、以及含有该条状聚集体的治疗药物

<130>PG03421A

<150>JP 2021-078154

<151>2021-04-30

<160>10

<170>PatentIn 3.5版

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>1

tagaaccatc agcgccgtc 19

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

tgagtgtagt gtgtatgttg g21

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

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<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

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<210>5

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<212>DNA

<213> 人工序列

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<212>DNA

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<212>DNA

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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