一种云南木霉菌及其应用

技术领域

本发明属于农业微生物技术领域，涉及一种云南木霉菌及其在防治茶叶炭疽病中的应用。

背景技术

茶树Camellia sinensis(L.)O.Kuntze是一种喜阴喜湿常绿木本植物，多在我国南部地区广泛种植，茶叶中富含氨基酸、茶多酚等多种对人体有益物质，且其因丰富的口感和营养受到人们青睐。进入新世纪是中国茶业的世纪，在过去的20年中，中国茶产业的发展，引领了世界茶叶产量的增长，据统计，2019年全国18个主要产茶省(市、区)茶园面积310.21万hm

茶炭疽病害是影响茶产量和品质的主要真菌性病害之一。迄今，国内外已报道能侵染茶树的炭疽菌种类有Colletotrichum.camelliae、Colletotrichum carveri、Colletotrichum majus、Colletotrichum crassipes、Colletotrichum gloeosporioides、Colletotrichum fructicola、Csolletotrichum iamense、Colletotrichum acutatum、Colletotrichum henanense和Colletotrichumjiangxiense等。由于能够引起茶叶炭疽病害的炭疽菌种类繁多，且分类复杂，所以对其菌属分类鉴定主要是通过采样分离纯化，形态学鉴定、DNA测序与扩展、多基因位点系统发育树分析和致病性实验等方式进行。

目前为止，有关防治茶叶炭疽病的相关研究比较多，如现有专利(CN109749943A)使用棘孢木霉菌治疗茶树炭疽病病原菌Colletotrichum gloeosporioides，现有专利(CN112725193A)使用软毛木霉菌治疗茶树炭疽病菌，其茶树炭疽病菌为刺盘孢炭疽菌。尚未见有使用云南木霉菌防治茶叶炭疽病的相关报道。本发明能够有效、绿色的防治茶树炭疽菌，降低其影响，所以从土壤中分离筛选出对茶树炭疽菌具有抑制效果的生防菌，满足当下的绿色防控需求。

发明内容

本发明的目的在于如何提供一株木霉菌属新菌株，不仅能作为生防菌使用，还能提高茶叶产量和品质。

本发明的技术方案：一种云南木霉菌，所述的云南木霉菌命名为Trichodemayunnanense CBS121219，于2023年6月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No：M20231022。

前述的云南木霉菌Trichodema yunnanense在提高茶叶产量和品质上的应用。

前述的应用，所述品质为茶叶氨基酸、茶多酚、酚氨比。

前述的云南木霉菌Trichodemayunnanense在茶叶炭疽病防治上的应用。

前述的应用，其特征在于，所述的茶叶炭疽病为山茶刺盘孢菌Colletotrichumcamelliae。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明的云南木霉菌T.yunnanense对茶树炭疽病菌具有竞争作用和抗生作用，同时该菌还能促进茶树生长以及提高茶叶的品质，该菌株在茶炭疽病的防治方面有广阔的应用前景，可作为茶炭疽病的生防菌剂使用。

2.云南木霉菌T.yunnanense生境适应性强、生长速度快，对茶炭疽病菌山茶炭疽菌C.camelliae具有明显的生长抑制作用，平板对峙培养的抑制率为83.68％；发酵液对茶炭疽菌具有明显的抑制作用，发酵液浓度为1×10

3.云南木霉T.yunnanense发酵液喷施于茶园30d后，茶青产量增加了13.52％，同时还提高了茶叶中氨基酸的含量，增加率达61.01％。

附图说明

图1：云南木霉T.yunnanense与C.camelliae的平板对峙结果(注：A为对照组，B为实验组)；

图2：云南木霉发酵液对山茶炭疽病的抑制结果(注：A为对照组，B为实验组)；

图3：云南木霉Trichodemayunnanense的培养性状与形态特征(c-1为菌落形态,c-2为菌丝及分生孢子梗,c-3为分生孢子)；

图4：云南木霉菌的多基因系统进化树分析结果。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。

实施例1：

本实施例为云南木霉T.yunnanense的分离、鉴定和保藏：

样品采集地区是采集于贵州省龙里县湾滩河镇摆省社区，地处北纬160°49′，东经106°58′，平均海拔1240米属于亚热带季风性湿润气候，具有明显的高原性气候特点；采集地区2是采集于龙里县茶树种植园，地处东经106°45′18″～107°15′1″，北纬26°10′19″～26°49′33″之间，同属于亚热带季风性湿润气候。

所用培养基灭菌条件均为115℃，20min。

马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基；高氏合成一号固体培养基；牛肉膏蛋白胨(NA)培养基；马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)培养基；磷标准溶液；钼锑抗试剂；钼锑混合液；钼锑抗试剂；CAS检测液。

(一)茶树根际土壤中木霉菌的分离：

将带回的茶树根际新鲜土样用电子天平称取10g添加到装有90ml无菌水的250ml三角瓶中，再加入经杀菌过后的玻璃珠，后手动摇晃5min左右后，放入摇床150r/min震荡摇匀半小时左右，然后从三角瓶中取1ml土壤悬浮液添加到装有9ml无菌水的试管中，利用移液枪吹吸混匀后，利用梯度稀释法制成10-1～10-7的土壤稀释液，先用1000μL的移液枪吸取500μL的土壤悬浮液置于三种不同的培养基中，后用玻璃涂布器分别在PDA培养基、高氏合成一号培养基、NA培养基上均匀涂布各浓度的稀释液。每个浓度设3个重复，28℃连续培养5～7d，用于分离土壤中的生防菌。

(二)云南木霉(T.yunnanense)的鉴定：

(1)形态特征：利用形态学方法，主要对木霉菌菌落特征、颜色、菌丝及孢子大小等进行观察。

在PDA培养基上，云南木霉T.yunnanense的菌丝生长速度最迅速，在培养至第三天时，菌落长到8.5cm，气生菌丝排列致密，呈蜘蛛网状，但无分身孢子产生，在第四天时菌落继续生长并完全铺满培养基，任无孢子产生，培养至第五天时开始产生白色孢子，第六天时孢子产量增多但颜色无变化，直到培养第七天白色孢子开始变为浅绿色。分生孢子椭圆形或长形，背面无色，结果见图3。

(2)木霉菌的DNA提取、PCR扩展及测序

使用TSINGKE植物DNA提取试剂盒(通用型)，具体步骤参照试剂盒说明书。将扩增好的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，获取鉴定胶图。后将获得产物送北京擎科生物科技有限公司成都分公司进行测序。将该序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行比对分析，结果见图4。

表1本实验所有应用引物序列

通过一代测序获得的序列：

F2的ITS序列：

CCGAGCTTAACTCCCAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGT

GCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGAACCAACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGC

GGACGTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTG

GTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCA

TCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAA

CCCTCGAACCCCTCCGGGGGATCGGCGTTGGGGATCGGGACCCCTCACACGGGTGCCGGCCCCGAAA

TACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGC

GCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTG

ACTTATATTTAAGAAAGGGG

F2的tef1-α序列：

ACCTTACTGCTTTTCATCATTCTTGGCACAATTATATGCCCGACAAATCTGTTCTCAGTTTTGTCTTTTTT

TTTTTCAGCATCACCCCGCTTTGCCAGCCTACCTACCCCTCCTTTGGCACAGCAAAAATTTTCTGGCTG

CCTTGTTTGGCTTTTAGTGGGGTGTCAATTTTTTTTGGCAGCAACCCCGCTATCGCCACTGCACCTCTT

CTATCACCCACATGCTATTTGCTCAATCGCATCGTCTATTGTCAATCTCTATTTTTGTTCATTATGCTGATC

ATGCTTCAATCAATAGGAAGCCGCCGAACTCGGCAAGGGTTCCTTCAAGTATGCGTGGGTTCTTGACA

AGCTCAAGGCCGAGCGTGAGCGTGGTATCACCATCGACATTGCCCTCTGGAAGTTCGAGACTCCCAAG

TACTATGTCACCGTCATTGGTATGTTTTAGGCTCTTCTCCAACCAGTCGACATCGCAAGTCCGCCATTCT

AACATGCTCTCCCCACAGACGCTCCCGGTCACCGTGATTTCATCAAGAACATGATCACTGGTACCTCCC

AGGCTGACTGCGCTATTCTGATTATCGCTGCCGGTACTGGTGAGTTCGAGGCTGGTATCTCCAAGGATG

GCCAGACCCGTGAGCACGCTCTGCTCGCCTACACCCTGGGTGTCAAGCAGCTCATCGTCGCCATCAAC

AAGATGGACACTGCCAACTGGGCTGAGGCTCGTTACCTTGAAATCATCAAGGAGACCTCCAACTTCAT

CAAGAAGGTCGGCTTCAACCCCAAGACCGTTGCCTTTGTCCCCATCTCCGGTTTCAACGGTGACAACA

TGCTGGCCCCCTCCACCAACTGCCCCTGGTACAAGGGCTGGGAGAAGGAGACCAAGGCTGGCAAGTC

CACCGGTAAGACCCTCCTCGAGGCCATTGACGCCATCGAGCCCCCCAAGCGTCCCACAGACAAGCCC

CTCCGTCTGCCCCTCCAGGACGCCTACAAAAACGGGGGTATCGGAACAGTCCCTGGCGGCCGGATCG

AGAATGGGATCTCCAAGCCCCGGATGGGCTT

(三)云南木霉菌T.yunnanense的保藏：

所述的云南木霉菌命名为T.yunnanense CBS121219，于2023年6月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No：M20231022。

实施例2：

本实施例为云南木霉菌(T.yunnanense)M20231022的抑菌效果测定：

(1)对峙培养初筛：用打孔器取山茶炭疽菌Colletotrichum camelliae以及云南木霉菌M20231022的菌饼，直径为5mm，分别将病原菌和木霉菌菌饼接于同一PDA平板上，相距5.5cm，每组5个重复，以单接病原菌山茶炭疽菌C.camelliae为对照，密封，置于28℃黑暗培养，7天后测量病原菌朝向木霉菌的菌落半径，计算木霉菌对病原菌的抑制率。

结果如图1所示，云南木霉菌M20231022对山茶炭疽菌C.camelliae具有生长抑制作用，对山茶炭疽菌C.camelliae的抑菌率为83.68％。

(2)抑菌圈法复筛：无菌条件下取6个直径为5mm的云南木霉菌M20231022的菌饼接入120mL PDB培养液中，28℃、200rpm振荡培养4天，7830rpm、常温离心10min，取上清液通过0.22μm滤膜。按V木霉菌发酵液：VPDA＝1：9将木霉菌发酵液加入到PDA培养基中，混匀倒平板，取病原菌菌饼接种于平板中央。25℃培养5天，十字交叉法测量病原菌菌落半径，计算其抑菌效果。

PDB液体培养基原料为：土豆200g、葡萄糖20g、蒸馏水1000mL。

结果如图2所示，菌株云南木霉菌M20231022的发酵液对山茶炭疽菌C.camelliae的抑制率为76.71％。

实施例3

本实施例为实施例1的云南木霉菌(T.yunnanense)M20231022的应用，用于提高茶树对茶炭疽病的防治效果，以及茶青产量和茶叶的品质；

试验于贵州省龙里县湾滩河镇茶园实施，每处理设3个重复，小区面积约15m

结果如表2所示，发酵液处理组的茶青产量增加了13.52％。干样内含物依托贵州省茶叶研究所按照国家标准进行检测，干样制取方法为：发酵液喷施30d后，取试验区内的芽下二三叶，先用微波炉进行杀青处理，中火，90sec；再置于80℃烘箱中进行烘干获得干样。结果如表3所示，与对照组相比，发酵液处理组的氨基酸增加了46.33％，茶多酚含量提升了6.63％，酚氨比下降了27.20％，表明云南木霉菌发酵液处理对茶叶品质有显著提升。另外，咖啡碱含量经云南木霉菌发酵液处理得到显著提升，儿茶素含量提升了19.51％，而咖啡碱和儿茶素对茶树病虫害抗性提升具有促进作用，因而云南木霉发酵液处理茶树后的茶炭疽病防治能力得到显著提升，与咖啡碱和儿茶素含量的提升紧密相关。

表2云南木霉菌(T.yunnanense)M20231022发酵液对茶树的影响

表3云南木霉菌(T.yunnanense)M20231022发酵液对茶树叶片内含物的影响

本发明的云南木霉菌(T.yunnanense)M20231022对茶树炭疽病菌具有竞争作用和抗生作用，同时该菌还能促进茶树生长以及提高茶叶的品质，该菌株在茶炭疽病的防治方面有广阔的应用前景，可作为茶炭疽病的生防菌剂使用。

讨论

木霉的生防途径可大致分为四类，分别为竞争、重寄生、诱抗和促生作用。在本次木霉菌与炭疽菌的对峙实验中，木霉菌生长速度远远高于炭疽菌，因此无论是在营养的吸取上还是在空间占领上，木霉均处于优势地方，所以能够最大限度的挤压炭疽菌的生存，以及在对峙中期，木霉菌菌丝生长包围覆盖到炭疽菌菌落上从炭疽菌菌落上吸取营养，到后期时炭疽菌菌落被木霉菌杀灭分解。

本发明从发生炭疽病害的两处茶园分离得到了引发茶叶炭疽病害的两种炭疽菌，分别为柯氏炭疽菌C.cobbittiense和山茶刺盘孢菌C.camelliae，并且运用从茶树根际分离得到三种木霉菌与两种茶树炭疽菌做拮抗实验，做三次重复，并做一组空白对照，实验结果表明，分离得到的这四株菌株均对两种炭疽菌具有不同程度的抑制、杀灭作用，以及有大量前人做的实验数据证明，木霉菌可以用来防止茶树炭疽病害。

在分离得到的三株木霉菌中因抑菌率效果的高低不同又对抑菌效果最好的云南木霉和效果较差的钩状木霉进行了生理生化方面的测定，其中主要测定了两种木霉的pH值、几丁质酶活性、嗜铁素含量以及多酚氧化酶活性等理化性质，因为理化性质是影响木霉菌抑制效果好坏的重要因素，所以能够以此来分析导致二者之间抑菌效果差距较大的原因。以下就两株木霉的嗜铁素含量、纤维素酶活性、苯丙氨酸解氨酶活性、几丁质酶活性进行分析讨论。

在云南木霉和钩状木霉嗜铁素含量的测定中，云南木霉的含量为38±0.029％而钩状木霉的嗜铁素含量为20±0.025％，根据测定数据结果我们能够直观的看到云南木霉的含量远高于钩状木霉，因此能够表明嗜铁素含量越高抑菌效果就越好。所以能够证明嗜铁素含量与木霉菌的抑菌效果存在密切联系。

云南木霉和钩状木霉的蛋白质含量的测定中，云南木霉的蛋白质含量为0.486±0.010mg/mL，而钩状木霉的蛋白质含量为1.168±0.010mg/mL，从测定数据上来看蛋白质含量与木霉菌对峙两种茶树炭疽菌的抑菌效果呈负相关，因为云南木霉的蛋白质含量低于钩状木霉，所以需要进一步研究木霉抑菌效果与蛋白质含量是否存在必然联系，并揭示二者之间存在的关系。

纤维素酶具有降解植物病原卵菌细胞壁的作用，且木霉菌中含有纤维素酶。因此，希望通过测定抑菌效果高的云南木霉和抑菌效果低的钩状木霉的纤维素含量，以此来分析造成两株木霉抑菌效果差异大的原因。从测定的两株木霉的纤维素酶的活性来看，云南木霉的纤维素酶活性较高为255.717±4.451μg/min/mgprot而钩状木霉的纤维素酶活性仅为112.024±3.116μg/min/mgprot。联系纤维素酶对植物病原卵菌细胞壁的作用和所测得抑菌效果数据来看，纤维素酶活性的高低与木霉菌对炭疽菌的抑菌效果呈现一个正相关的关系。

在云南木霉与钩状木霉的多酚氧化酶活性测定中，云南木霉的活性为6.287±0.273U/mg prot而钩状木霉的多酚氧化酶活性为4.104±0.089U/mg prot,从数据可以看出云南木霉的多酚氧化酶活性约为钩状木霉该酶活性的两倍，再把二者的酶活性与抑菌效果联系起来，可以得出在本次实验中多酚氧化酶活性的高低与木霉菌的抑菌效果呈正相关关系。

苯丙氨酸解氨酶在植物抗病虫害方面具有调控作用，因此同样能够根据测定两株木霉其活性来分析两株木霉抑菌效果不同的原因，根据所测数据得云南木霉苯丙氨酸解氨酶活性为1.722±0.022U/mgprot，钩状为0.655±0.021U/mgpro，联系其活性与抑菌效果可知木霉菌的苯丙氨酸解氨酶活性与抑菌效果是呈正相关关系。

吲哚乙酸为木霉代谢多种植物生长激素产物之一，具备调控植株的很多代谢过程功能。所以能够根据所测定的两株木霉的吲哚乙酸含量的高低来分析两株木霉抑菌效果相差较大的原因，在本实验测定中云南木霉的吲哚乙酸含量为5.555±0.2897ng/g钩状木霉含量为1.925±0.0612ng/g。联系两种木霉吲哚乙酸含量数据以及抑菌率来看，云南木霉抑菌效果更好是因为吲哚乙酸含量比钩状木霉的吲哚乙酸含量高，因此可以得出结论吲哚乙酸含量与木霉的抑菌效果呈正相关关系。

几丁质酶能够水解病原菌的细胞壁，所以能够根据所测定的两株木霉的的几丁质酶活性的高低分析两株木霉的抑菌效果相差较大的原因，其中云南木霉的几丁质酶活性为4.911±0.040mg/h mg prot而钩状木霉的为2.031±0.003mg/h mg prot。根据所测得到数据结果联系两种木霉对茶树炭疽菌的抑菌率来看，可以得出几丁质酶活性与木霉菌的抑菌效果呈现出正相关关系。

综上，云南木霉对茶炭疽病具有显著簇促生和抑菌效果的原因在于具有较高的嗜铁素含量、吲哚乙酸含量、纤维素酶活性、几丁质酶活性、苯丙氨酸解氨酶活性和多酚氧化酶活性。