用于植物多基因可诱导表达载体构建的质粒体系其应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学技术领域，具体涉及用于植物多基因可诱导表达载体构建的质粒体系及其应用。

背景技术

合成生物学通过理性设计改造开发高效的生物合成系统为日益增长的食品、药品、能源等资源的需求提供了新的解决方案。植物拥有丰富的活性天然产物合成基因、完备的内膜系统和细胞器、精细的代谢调控网络，因此，以植物为底盘的合成生物学已成为合成生物学研究的新热点，不仅在农业生产、生物制药、资源环境方面的发挥着重要作用，而且有助于加深人类对复杂生命运行规律的理解。

合成生物学的迅速发展离不开多基因表达载体构建技术的开发，目前用于微生物的多片段DNA组装技术发展迅速、相对成熟，但植物的多基因载体的构建相对困难,尤其对于重要的非模式生物，如重要的药用植物长春花，缺少适用的多基因表达载体构建系统。现有的多片段DNA组装方法有Infusion PCR技术、Gibson组装、Gateway重组技术、GoldenGate组装技术。Infusion PCR、Gibson组装方法需要在多个DNA片段两端设计同源臂，不适合构建重复片段。Gateway重组技术需要的载体和重组酶价格昂贵，而且难以在不同的重组系统切换。应用IIS型限制性内切酶的Golden Gate DNA组装法是植物表达载体常用的多片段无缝组装方法，而传统的植物表达载体如pBI系列、pIG系列等，主要通过酶切、连接的方法插入基因，可插入的基因个数有限，大部分只能构建单个基因表达载体。无法满足植物合成生物学的大片段、多基因同时组装的要求。传统的植物表达载体因为内部存在IIS型限制性内切酶识别位点、在多克隆区域又缺少IIS型酶切位点。因此无法通过Golden Gate法组装多基因表达框，且不能和Golden Gate模块化克隆(MoClo)和GoldenBraid2.0(GB2.0)兼容。此外，传统的植物表达载体通常使用CaMV 35S等组成型启动子来表达目的基因，这样得到的转基因植株、植物组织或细胞会一直表达转入基因，容易产生代谢负担，尤其当转入基因为次级代谢途径基因时，代谢产物的积累会影响植物或组织生长。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供用于植物多基因可诱导表达载体构建的质粒体系及其应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供用于植物多基因可诱导表达载体构建的质粒体系，包括pUCGALA质粒和pTC003质粒；

所述pUCGALA质粒是在基本载体pUC18的SbfI位点插入由糖皮质激素诱导启动子GAL4 UAS、多克隆位点和poly(A)rbcS-E9终止子序列组成的元件；

所述pTC003质粒通过以下步骤构建

将基本载体pCAMBIA2300中原有IIS型酶切位点BsmBI和BsaI突变得到pTC001质粒；

将内部BsmBI位点突变但编码的氨基酸不变的GVG转录因子表达盒与XbaI、KpnI双酶切的pTC001无缝连接，得到pTC002质粒；所述GVG转录因子表达盒包括SEQ ID NO.14～15所示两个DNA片段；

将含有两个BsaI、两个BsmBI位点的DNA片段插入pTC002质粒SbfI和SalI位点之间。

进一步的，所述多克隆位点包括AgeI、BmtI、XhoI、SpeI和BsrGI。

更进一步的，所述元件的序列如SEQ ID NO.1所示。

更进一步的，原有IIS型酶切位点BsaI和BsmBI突变后得到的序列如SEQ ID NO.2～5所示。

更进一步的，含有两个BsaI、两个BsmBI位点的DNA片段的序列如SEQ ID NO.20所示。

第二方面，本发明提供所述质粒体系的应用，所述质粒体系用于植物多个基因表达载体的构建，以及利用该基因表达载体进行基因转化获得转基因植物细胞或植物体。

进一步的，所述植物包括长春花。

第三方面，本发明提供利用所述质粒体系调控植物多基因表达的方法，包括以下步骤：

将目的基因与pUCGALA质粒用所述多克隆位点对应的内切酶酶切后连接，得到中间载体；

利用两端带有BsmBI或BsaI位点的引物扩增所述中间载体，得到目的基因的表达盒片段；

将所述表达盒片段通过Golden Gate连接到所述pTC003质粒上，得到多基因重组表达载体；

将所述多基因重组表达载体转入植物，糖皮质激素诱导目的基因表达。

进一步的，所述糖皮质激素包括地塞米松。

更进一步的，所述植物包括长春花。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过构建带有糖皮质激素可诱导启动子的中间表达载体pUCGALA，在多克隆位点区的上游和下游分别为糖皮质激素诱导启动子GAL4-UAS和poly(A)rbcS-E9终止子，通过酶切连接法，可以将单个基因编码序列方便的插入，得到含有完整基因表达盒的中间载体。再通过Golden Gate法一步连接到最终表达载体体pTC003，可以实现多基因在植物中的诱导表达，因此可以控制外源基因表达时间，如在植物生长到一定阶段再启动基因表达，可以大大缓解代谢负担给生长带来的负面影响。

本发明构建了一个可以通过Golden Gate法同时连接多个基因表达盒的通用植物表达载体pTC003，并且和Golden Gate模块化克隆(MoClo)和GoldenBraid2.0(GB2.0)兼容，实现灵活高效的多基因表达载体组装。

附图说明

图1为pUCGALA质粒图谱。

图2为pTC003质粒图谱。

图3为三基因表达载体pTC003-CrT16H-Cr16OMT-CrT3O的构建示意图。

图4为三基因表达载体pTC003-CrT16H-Cr16OMT-CrT3O的PCR验证，M：Maker，1：GVG+T16H 2：16OMT+T3O。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：多基因可诱导表达载体构建的质粒体系的构建

1.pUCGALA质粒构建：

以pUC18质粒为基础，构建带有GAL4 UAS、多克隆位点、poly(A)rbcS-E9终止子的pUCGALA质粒，具体操作步骤如下：

化学合成含有可诱导启动子GAL4 UAS(上游激活序列)、多克隆位点(AgeI、BmtI、XhoI、SpeI、BsrGI)、poly(A)rbcS-E9终止子序列的875bp DNA片段，序列如SEQ ID NO.1所示。对该片段和pUC18质粒分别进行SbfI酶切，将酶切好的两个片段通过T4 DNA连接酶连接，然后用热激法转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB培养基上培养，挑取单菌落进行PCR鉴定，筛选含有重组质粒的阳性菌落，扩增培养，提取质粒，测序鉴定，得到带有GAL4 UAS、多克隆位点、poly(A)rbcS-E9终止子的pUCGALA质粒(图1)，用于构建中间载体。

2.pTC003质粒构建：

(1)以pCAMBIA2300质粒为基础，通过PCR突变质粒原有IIS型酶切位点BsaI、BsmBI。具体步骤如下：

以pCAMBIA2300质粒为基础，在BsaI(1个)、BsmBI(2个)IIS型酶切位点处设计突变引物(表1)，通过PCR得到HindIII-BsmBI1*、BsmBI1*-BsaI*、BsaI*-BsmBI2*、BsmBI2*-NsiI四个DNA片段，序列依次如SEQ ID NO.2～5所示，PCR纯化试剂盒进行纯化，用HindIII和NsiI对pCAMBIA2300质粒进行酶切处理，在1％琼脂糖凝胶中进行DNA电泳分离，切胶回收3.5kb片段，将切胶回收的片段和PCR得到的四个DNA片段通过ClonExpress MultiS OneStep Cloning Kit试剂盒进行无缝连接。然后用热激法转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有卡那霉素的LB培养基上培养，挑取单菌落进行PCR鉴定，筛选含有重组质粒的阳性菌落，扩增培养，提取质粒，测序鉴定，得到BsaI、BsmBI IIS型酶切位点突变的质粒骨架pTC001。

表1突变IIS型酶切位点所用引物引物

(2)将CaMV 35S-GVG-poly(A)rbcS-E9终止子构建到pCAMBIA2300上，以表达糖皮质激素可诱导表达系统中的转录因子。具体操作步骤如下：

设计两对引物(表2)从pTA7002质粒中PCR得到内部BsmBI位点突变的GVG转录因子表达盒(expression cassette)的两个片段：CaMV 35S-GVG-BsmBI*和BsmBI*-GVG-poly(A)rbcS-E9，序列依次如SEQ ID NO.14～15所示，通过XbaI、KpnI双酶切pTC001得到线性化载体骨架，ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit试剂盒进行无缝连接。用热激法转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有卡那霉素的LB培养基上培养，挑取单菌落进行PCR鉴定，筛选含有重组质粒的阳性菌落，扩增培养，提取质粒，测序鉴定，得到含GVG转录因子表达盒的质粒骨架pTC002。

表2GVG表达盒引物

(3)合成含有两个IIS型酶BsaI位点的短序列，构建到多克隆位点区，得到所述pTC003质粒。具体操作步骤如下：

合成含有两个BsaI、两个BsmBI位点的短序列，序列如SEQ ID NO.20所示：

SEQ ID NO.20：acgcgtcgaccggagcgaga cgggagcgtcgagaccttcgcttataacttggtctcg tggccatcgtctcaccatgcctgcacctgcaggctgca。

通过SbfI、SalI限制性内切酶对该片段和pTC002分别进行双酶切，T4DNA连接酶连接两者，用热激法转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有卡那霉素的LB培养基上培养，挑取单菌落进行PCR鉴定，筛选含有重组质粒的阳性菌落，扩增培养，提取质粒，测序鉴定，得到最终重组质粒pTC003(图2)。

实施例2：用于长春花多基因可诱导表达载体构建的质粒体系的应用

长春花文多灵代谢途径的三个基因CrT16H、Cr16OMT、CrT3O表达载体的构建：

1、长春花幼苗总RNA的提取与cDNA的合成

以长春花小亮眼品种的3周龄幼苗为实验材料，用Trizol法提取RNA。ThermoScientific的DNaseI去除基因组DNA，使用TaKaRa的PrimeScript

2、CrT16H、Cr16OMT、CrT3O的CDS全长扩增和产物提纯

从NCBI获取长春花文多灵合成通路的三个基因的编码序列CrT16H(Gene ID:FJ647194.1)、Cr16OMT(Gene ID:EF444544.1)、CrT3O(Gene ID:KP122967.1)，根据基因序列设计两端分别带有XhoI、SpeI位点的特异性引物(表3)，以上述得到的cDNA为模板，用NEBQ5 High-Fidelity 2×Master Mix试剂盒PCR扩增得到三个DNA片段，使用NEB MonarchPCR&DNA纯化试剂盒得到纯化产物。具体操作步骤按照试剂盒说明进行。

表3目的基因PCR引物

3、CrT16H、Cr16OMT、CrT3O分别构建到中间载体pUCGALA

用限制性内切酶XhoI、SpeI分别双酶切CrT16H、Cr16OMT、CrT3O的PCR产物和载体骨架pUCGALA，T4 DNA连接酶分别连接三个基因和中间载体，分别用热激法转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB培养基上培养，挑取单菌落进行PCR鉴定，筛选含有重组质粒的阳性菌落，扩增培养，提取质粒，测序鉴定，得到重组质粒pUCGALA-CrT16H，pUCGALA-Cr16OMT，pUCGALA-CrT3O(图3)。

4、三个目的基因的表达载体构建

根据三个中间载体，设计基因表达盒两端带有BsmBI位点的Golden Gate引物(表4)，分别以pUCGALA-CrT16H，pUCGALA-Cr16OMT，pUCGALA-CrT3O质粒为模板，使用NEB Q5High-Fidelity 2X Master Mix试剂盒PCR扩增得到三个基因的表达盒片段，然后使用NEBridge Golden Gate Assembly Kit(BsmBI-vs)试剂盒，将三个基因表达盒片段和pTC003载体进行组装，三基因片段和载体所用摩尔比例为5：5：5：1，循环参数为：(42℃，5min→42℃，5min)×60→60℃，5min。用电法转入大肠杆菌10β感受态细胞，在含有卡那霉素的LB培养基上培养，挑取单菌落进行PCR鉴定，筛选含有重组质粒的阳性菌落，扩增培养，提取质粒，测序鉴定，得到三基因表达载体pTC003-CrT16H-Cr16OMT-CrT3O(图3)，该表达载体PCR验证结果如图4所示，第一个PCR验证片段为GVG+T16H，所用引物如图3中P1所示；第二个PCR验证片段为16OMT+T3O，所用引物如图3中P2所示。

表4Golden Gate连接所用引物

5、农杆菌转化长春花

上述得到的表达载体pTC003-CrT16H-Cr16OMT-CrT3O通过电转化法转入农杆菌ATCC15834感受态细胞，在含有卡那霉素的YEB培养基中筛选含有重组子的农杆菌细胞，在YEB培养基中25℃、225rpm培养2天，收集农杆菌，侵染幼苗期无菌长春花的下胚轴。2-3周后，在农杆菌侵染处长出毛状根，剪下毛状根，在含有卡那霉素的培养基中筛选转基因毛状根，将在选择性培养基中生长的毛状根转移到液体培养基中传代培养。

6、诱导目的基因表达与q-PCR检测

将6瓶培养了3周的毛状根平均分为两组，一组加入50μL乙醇作为对照组，一组加入50μL 0.2mM糖皮质激素地塞米松，诱导三天后用Trizol法提取毛状根RNA，ThermoScientific的DNaseI去除基因组DNA，使用TaKaRa的PrimeScript

表5q-PCR检测用引物

需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。