牙龈组织及其制备方法

发明领域

本发明总体上涉及组织工程领域。具体地，本发明教导了制备三维(3D)细胞组合物的方法及3D细胞组合物的用途。

背景技术

牙龈组织或通常称为“牙龈”，是覆盖牙齿的组织，具有多种功能，例如机械、化学和微生物试剂的屏障，从而保护下层组织。牙龈组织由称为固有层(lamina propria)的粘膜结缔组织和覆盖的上皮构成。固有层由细胞(主要是成纤维细胞)和嵌入胶原基质中的血管构成。牙龈上皮主要由角质形成细胞构成，角质形成细胞排列成具有最外层角质化或角化层的分层细胞层。牙龈上皮的分层包括基底层、棘层、颗粒层和角质层。牙龈上皮和固有层由一层基底膜粘合在一起。基底膜是一种主要由IV型胶原、层粘连蛋白、整合素和纤连蛋白组成的薄膜。

组织工程的进展，如三维器官型培养，为在实验室重建人体组织提供了机会。使用三维培养技术，可以在体外重建牙龈组织。牙龈组织等效物是实验室制备的组织，可以帮助替换受损的人牙龈，作为测试牙科和口腔护理产品的安全性、毒性和功效、药物筛选和宿主微生物组相互作用的实验模型也具有重要的应用。因此，此类应用需要开发和制备模拟天然人牙龈结构和生理学的人牙龈组织等效物。自从EU禁止使用动物模型测试化妆品(包括口腔护理产品)以来，许多公司已经开发出了重建的人牙龈上皮(RHGE)模型，例如EpiGingival

因此，通常希望克服或改善一个或多个上述困难。

发明内容

本文公开了一种制备三维细胞组合物的方法，该方法包括以下步骤：a)通过将纤维蛋白原、调节剂和口腔成纤维细胞与凝血酶混合，形成含有悬浮在支持基质内的口腔成纤维细胞的支持基质；b)将所述支持基质在细胞培养基中孵育足够的时间，以允许所述三维细胞组合物的第一层的发育；和c)在第一层的表面上接种口腔角质形成细胞，并培养口腔角质形成细胞以形成三维细胞组合物的第二层。

本文公开了根据本文定义的方法获得的三维细胞组合物。

本文公开了一种三维细胞组合物，其包括a)第一层，所述第一层包含PEG-纤维蛋白支持基质，所述PEG-纤维蛋白支持基质包含悬浮在所述支持基质内的口腔成纤维细胞，其中所述支持基质包含纤维蛋白、调节剂和口腔成纤维细胞；和b)第二层，所述第二层包含口腔角质形成细胞。

本文公开了本文定义的用作药物的三维细胞组合物。

本文公开了如本文定义的三维细胞组合物在制备用于治疗牙龈疾病或病症的药物中的用途。

本文公开了如本文定义的三维细胞组合物在制备用于再生疗法的药物中的用途。

本文公开了本文定义的用于体外测试的三维细胞组合物的用途。

附图说明

下文将参考附图通过非限制性示例的方式来描述本发明的实施方式，其中：

图1：6孔(左)和12孔(右)内插入物形式的牙龈组织等效物。虚线圆圈表明，使用基于纤维蛋白的基质制作的牙龈组织等效物(培养约3周)占据了插入物的整个区域，没有任何收缩。

图2.牙龈等效物(牙龈-FT)的苏木精-伊红染色显微照片显示，在牙龈成纤维细胞填充的固有层基质上，存在角化的分层鳞状上皮，其由基底层、棘层、颗粒层和角质层组成。

图3.牙龈等效物(牙龈-FT)的显微照片显示细胞角蛋白(CK-5和CK-10)的表达。

图4.牙龈等效物(牙龈-FT)的显微照片显示牙龈上皮分化标志物(兜甲蛋白(Loricrin)、丝聚合蛋白(Filaggrin)和CK-10)的表达。

图5.牙龈等效物(牙龈-FT)的显微照片显示固有层的胞外基质蛋白(1型胶原蛋白和纤连蛋白)的表达。

图6.牙龈等效物(牙龈-FT)的显微照片显示基底膜蛋白(IV型胶原蛋白和层粘连蛋白-5)的表达。

图7.使用不同浓度的纤维蛋白原(Fbrgn:5mg/ml,7.5mg/ml,10mg/ml)和凝血酶(Thr:12UN/ml,6UN/ml,3UN/ml,1.5UN/ml)制备的血管化固有层等效物中微血管网络的形成

图8.在8天的培养过程中，使用不同浓度的内皮细胞(1.5x 10

图9.血管化牙龈等效物(牙龈-FT-V)的苏木精-伊红染色显微照片。

图10.血管化牙龈等效物(牙龈-FT-V)的显微照片显示细胞角蛋白(CK-5和CK-10)的表达。

图11.血管化牙龈等效物(牙龈-FT-V)的显微照片显示牙龈上皮分化标志物(兜甲蛋白(Loricrin)、丝聚合蛋白(Filaggrin)和CK-10)的表达。

图12.血管化牙龈等效物(牙龈-FT-V)的显微照片显示固有层的胞外基质蛋白(1型胶原蛋白和纤连蛋白)的表达。

图13.血管化牙龈等效物(牙龈-FT-V)的显微照片显示基底膜蛋白(IV型胶原蛋白和层粘连蛋白-5)和内皮标志物(CD31和vWF)的表达。所有四个标志物也显示固有层中存在血管。

图14.使用完整的牙龈-FT组织构建体来研究漱口剂的粘膜刺激和屏障破坏潜力。

图15.使用表现溃烂口腔粘膜的固有层等效物，研究漱口剂对口腔溃疡的粘膜刺激潜力。

图16.使用牙龈-FT组织构建体来研究漱口剂暴露3和60分钟后的粘膜腐蚀潜力。

图17.使用牙龈-FT组织构建体来研究通过完整和SLS处理的组织构建体的牙科麻醉渗透。

图18.使用牙龈-FT组织构建体来研究牙科复合材料的生物相容性(急性毒性)。

图19.使用生物制备方法制备年轻和衰老的口腔粘膜表型及其在口腔粘膜衰老研究中的应用。

图20.使用牙龈-FT组织构建体以制备年轻和衰老的牙龈组织表型及其在牙龈衰老研究中的应用。

具体实施方式

本发明教导了制备三维细胞组合物的方法。该方法可包括a)形成含有悬浮在支持基质内的口腔成纤维细胞的支持基质。该方法还可包括b)将所述支持基质在细胞培养基中孵育足够的时间，以允许所述三维细胞组合物的第一层发育。该方法还可包括c)在所述第一层的表面上接种口腔角质形成细胞，并培养所述口腔角质形成细胞以形成所述三维细胞组合物的第二层。例如，支持基质可以是基于纤维蛋白的基质。

本文公开了一种制备三维细胞组合物的方法，该方法包括以下步骤：a)通过将纤维蛋白原、调节剂和口腔成纤维细胞与凝血酶混合，形成含有悬浮在支持基质内的口腔成纤维细胞的支持基质；b)将所述支持基质在细胞培养基中孵育足够的时间，以允许所述三维细胞组合物的第一层的发育；和c)在第一层的表面上接种口腔角质形成细胞，并培养口腔角质形成细胞以形成三维细胞组合物的第二层。

三维细胞组合物可以是三维细胞培养物。在一个实施方式中，三维细胞组合物是三维组织等效物。三维细胞组合物可包括两层，即第一层和第二层。

三维组织等效物也可以称为全厚度牙龈等效物，其包括作为第一层的固有层等效层和作为第二层的牙龈上皮等效层。在一个实施方式中，第一层是固有层等效层。在一个实施方式中，第二层是牙龈上皮等效层。不希望囿于理论，正是口腔成纤维细胞和口腔角质形成细胞之间的复杂相互作用最终能够产生全厚度的牙龈组织等效物。

在一个实施方式中，三维细胞组合物是人造牙龈组织。

在一个实施方式中，三维细胞组合物是人造血管化牙龈组织。

三维等效物也可称为全厚度口腔粘膜等效物。在一个实施方式中，三维细胞组合物是人造口腔粘膜组织。不希望囿于理论，正是口腔成纤维细胞和口腔角质形成细胞之间的复杂相互作用最终能够产生全厚度的口腔粘膜等效物。

在一个实施方式中，口腔成纤维细胞是来自牙龈、牙周韧带、颊粘膜、腭粘膜、唇粘膜、舌粘膜或其他口腔粘膜表面。

如本文所使用的术语“支持基质”是指由任何材料制成的任何三维结构，其具有允许细胞在三维结构内以大于一层生长的任何形状和内部结构。

支持基质可以由任何合适的材料或材料的组合形成。用于形成支持基质的合适材料的实例包括纤维蛋白、胶原蛋白、明胶、透明质酸、硫酸软骨素、藻酸盐、硝化纤维素、羧甲基纤维素、聚乙醇酸(PGA)、聚乙二醇(PEG)聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚L-赖氨酸、

在一个实施方式中，细胞均匀地悬浮在支持基质中。

在一个实施方式中，通过将纤维蛋白原、调节剂、口腔成纤维细胞与凝血酶混合形成支持基质。

在一个实施方式中，纤维蛋白原在凝血酶存在下交联。在一个实施方式中，纤维蛋白原和调节剂的混合物在凝血酶存在下交联。交联可形成基于调节剂/纤维蛋白的支持基质。基于纤维蛋白的支持基质可以具有多孔三维结构，以使口腔成纤维细胞和其他细胞与该结构一起生长。

在一个实施方式中，成纤维细胞的浓度为1x10

支持基质可以被血管化。在一个实施方式中，支持基质还包括内皮细胞。内皮细胞的浓度可为1x10

在一个实施方式中，提供了一种制备三维细胞组合物的方法，该方法包括以下步骤：a)通过将纤维蛋白原、调节剂、口腔成纤维细胞和内皮细胞与凝血酶混合，形成含有悬浮在支持基质内的口腔成纤维细胞和内皮细胞的支持基质；b)将所述支持基质在细胞培养基中孵育足够的时间，以允许所述三维细胞组合物的第一层的发育；和c)在第一层的表面上接种口腔角质形成细胞，并培养口腔角质形成细胞以形成三维细胞组合物的第二层。

在一个实施方式中，纤维蛋白原是人纤维蛋白原。

在一个实施方式中，纤维蛋白原的浓度为1.25至20mg/ml。例如，纤维蛋白原的浓度可以为1.25、1.5、1.75、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5或20mg/ml。

在一个实施方式中，调节剂为0.3至2.5mg/ml。例如，调节剂的浓度可以为0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5mg/ml。有利地，调节剂可以增加所得凝胶的交联密度，这可以提高机械强度、孔隙率并减缓基质中纤维蛋白的降解。

在一个实施方式中，纤维蛋白原的浓度为1.25至10mg/ml，调节剂的浓度为0.3至2.5mg/ml。

纤维蛋白原与调节剂的重量比可以是约2:1、约3:1、约4:1、约5:1或约6:1。在一个实施方式中，纤维蛋白原与调节剂的重量比为约4:1。此纤维蛋白原与调节剂的比率可以提高机械性质、孔隙率和减缓基质降解，而不会显著影响细胞生长。

调节剂可以交联不同的纤维蛋白原分子。在一个实施方式中，调节剂是2-臂、4-臂或8-臂聚乙二醇(PEG)。在一个实施方式中，调节剂是4-臂PEG。每个4-臂PEG可以交联至多4个纤维蛋白原分子。4-臂PEG可以是4-臂琥珀酰亚胺基戊二酸酯封端的聚(环氧乙烷)。

凝血酶可以以1IU/ml至15IU/ml的浓度提供。凝血酶可以以3.125IU/ml至12.5IU/ml的浓度提供。例如，凝血酶可以以1、1.25、1.5、1.75、2、2.25、2.5、2.75、3、3.125、3.25、3.5、3.75、4、4.25、4.5、4.75、5、5.25、5.5、5.75、6、6.25、6.5、6.75、7、7.25、7.5、7.75、8、8.25、8.5、8.75、9、9.25、9.5、9.75、10、10.25、10.5、10.75、11、11.25、11.5、11.75、12、12.25、12.5、12.75、13、13.25、13.5、13.75或14IU/ml的浓度提供。

在一个实施方式中，凝血酶是人凝血酶。

在一个实施方式中，形成支持基质的步骤包括在模具中形成支持基质。

在一个实施方式中，步骤c)包括在补充有胎牛血清(例如0.5％)、L-抗坏血酸(例如10-100ug/ml)、氢化可的松(例如50-500ng/ml)、碱性成纤维细胞生长因子(例如1-20ng/ml)、硒(例如1-10ng/ml)、乙醇胺(例如1-10ug/ml)、胰岛素(例如1-20ug/ml)、转铁蛋白(例如1-10ug/ml)和抑肽酶(例如10-100KIU/ml)的培养基(参见，例如，培养基-GE1)中孵育支持基质。所述培养基可进一步包含VEGF(例如5-50ng/ml)和EGF(例如1-10ng/ml)。

在一个实施方式中，步骤c)包括在补充有人血清(例如0.5-5％)、人血浆裂解物(0.5-5％)，人血清白蛋白(0.5-5％)、L-抗坏血酸(例如10-100ug/ml)、氢化可的松(例如50-500ng/ml)、碱性成纤维细胞生长因子(例如1-20ng/ml)、硒(例如1-10ng/ml)、乙醇胺(例如1-10ug/ml)、胰岛素(例如1-20ug/ml)、转铁蛋白(例如1-10ug/ml)和抑肽酶(例如10-100KIU/ml)的培养基(参见，例如，培养基-GE1)中孵育支持基质。所述培养基可进一步包含VEGF(例如5-50ng/ml)和EGF(例如1-10ng/ml)(参见，例如，培养基-VGE1)。

在一个实施方式中，该方法包括孵育支持基质2至6天以形成三维细胞组合物的第一层。支持基质中的口腔成纤维细胞可分泌多种ECM蛋白，最终产生固有层等效物。

在一个实施方式中，该方法还包括将口腔角质形成细胞接种到第一层的表面上(即，在第一层的顶部)，并培养口腔角质形成细胞以形成第二层。

在一个实施方式中，口腔角质形成细胞的接种密度为1x 10

在一个实施方式中，口腔角质形成细胞可以是来自牙龈、牙周韧带、颊粘膜、腭粘膜、唇粘膜、舌粘膜或其他口腔粘膜表面。角质形成细胞可能来源于人。

口腔角质形成细胞可以在包括内皮无血清培养基(ESFM)和角质形成细胞无血清培养基(KSFM)的1:1混合物的培养基中培养。培养基可以补充有0.5％胎牛血清(FBS)、L-抗坏血酸(例如10-100ug/ml)、氢化可的松(例如50-500ng/ml)、EGF(例如1-10ng/ml)、硒(例如1-10ng/ml)、乙醇胺(例如1-10ug/ml)、胰岛素(例如1-20ug/ml)、转铁蛋白(例如1-10ug/ml)和抑肽酶(例如10-100KIU/ml)。培养基可进一步包含VEGF(例如5-50ng/ml)。

口腔角质形成细胞可以在包括内皮无血清培养基(ESFM)和角质形成细胞无血清培养基(KSFM)的1:1混合物的培养基中培养。培养基可以补充有人血清(0.5–5％)、人血浆裂解物(0.5-5％)、人血清白蛋白(0.5-5％)、L-抗坏血酸(例如10-100ug/ml)、氢化可的松(例如50-500ng/ml)、EGF(例如1-10ng/ml)、硒(例如1-10ng/ml)、乙醇胺(例如1-10ug/ml)、胰岛素(例如1-20ug/ml)、转铁蛋白(例如1-10ug/ml)和抑肽酶(例如10-100KIU/ml)(参见，例如，培养基-GE2)。培养基可进一步包含VEGF(例如5-50ng/ml)(参见，例如培养基-VGE2)。

在一个实施方式中，第二层包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多层口腔角质形成细胞。

在一个实施方式中，该方法还包括在气液界面培养三维细胞组合物。所述培养可以在深孔板中进行1-35天(例如3-8天或10-21天)，用于角质形成细胞分层、分化和成熟。培养基可以包括补充有0.5％胎牛血清(FBS)、L-抗坏血酸(例如10-100ug/ml)、氢化可的松(例如50-500ng/ml)、硒(例如1-10ng/ml)、乙醇胺(例如1-10ug/ml)、胰岛素(例如1-20ug/ml)、转铁蛋白(例如1-10ug/ml)和抑肽酶(例如10-100KIU/ml)的ESFM和KSFM的1:1混合物。培养基可进一步包含VEGF(例如5-50ng/ml)。

在一个实施方式中，该方法还包括在气液界面培养三维细胞组合物。所述培养可以在深孔板中进行1-35天(例如3-8天或10-21天)，用于角质形成细胞分层、分化和成熟。培养基可以包括补充有人血清(0.5–5％)、人血浆裂解物(0.5-5％)、人血清白蛋白(0.5-5％)、L-抗坏血酸(例如10-100ug/ml)、氢化可的松(例如50-500ng/ml)、硒(例如1-10ng/ml)、乙醇胺(例如1-10ug/ml)、胰岛素(例如1-20ug/ml)、转铁蛋白(例如1-10ug/ml)和抑肽酶(例如10-100KIU/ml)的ESFM和KSFM的1:1混合物(参见，例如，培养基-GE3)。培养基可进一步包含VEGF(例如5-50ng/ml)(参见，例如培养基VGE3)。

术语气液界面(ALI)指细胞的培养使其基膜与液体接触或浸没在液体中，而其顶膜与空气接触。有利地，口腔角质形成细胞因此在其分化中表现出顶端-基底极性，导致体内可见的功能性角化表面的发育。ALI培养期可为1天至35天。ALI培养期可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35天。在一个实施方式中，ALI培养期约为10-21天。在另一个实施方式中，ALI培养期约为3-8天。有趣的是，ALI培养期可能会影响所产生的组织类型。例如，发现10-21天的ALI培养期导致牙龈上皮等效层的形成，而发现3-8天的ALI培养期导致口腔粘膜上皮等效层形成。

在一个实施方式中，三维细胞组合物的第二层(即牙龈上皮等效层)包括由浅表角质层覆盖的至少三层口腔角质形成细胞。

在一个实施方式中，三维细胞组合物的第二层(即口腔粘膜上皮等效层)包括无浅表角质层覆盖的至少三层口腔角质形成细胞。

本文公开了根据本文定义的方法获得的三维细胞组合物。

本文公开了一种三维细胞组合物，其包括a)第一层，所述第一层包含PEG-纤维蛋白支持基质，所述PEG-纤维蛋白支持基质包含悬浮在所述支持基质内的口腔成纤维细胞，其中所述支持基质包含纤维蛋白、调节剂和口腔成纤维细胞；和b)第二层，所述第二层包含口腔角质形成细胞。第二层可以设置在第一层的表面上。

本文所定义的三维细胞组合物可用于组织工程或组织再生应用，包括但不限于牙龈、牙周、口腔粘膜、皮肤、食管、阴道和尿道再生应用。细胞组合物可以植入、移植或注射到动物或人体内，用于组织再生或替换有缺陷的组织。

本文提供了一种包括本文所定义的三维细胞组合物的组织移植物。

本文公开了本文定义的用作药物的三维细胞组合物。

本文公开了一种治疗牙龈疾病或病症的方法，该方法包括给予对象本文定义的三维细胞组合物。

本文公开了本文定义的用于治疗牙龈疾病或病症的三维细胞组合物。

本文公开了如本文定义的三维细胞组合物在制备用于治疗牙龈疾病或病症的药物中的用途。

术语“治疗”、“处理”等在本文中可互换地用于表示缓解、减轻、减缓、改善或以其他方式抑制该病症，包括该病症的一种或多种症状。

三维细胞组合物可用于治疗对象。本文中可互换使用的术语“患者”、“对象”、“宿主”或“个体”是指需要治疗或预防的任何对象，特别是脊椎动物对象、甚至更特别是哺乳动物对象。落在本发明范围内的合适的脊椎动物包括但不限于脊索动物门的任何成员，包括灵长类动物(例如，人、猴子和猿)，并且包括猕猴属的猴种(例如，食蟹猴，如食蟹猕猴(Macaca fascicularis)，和/或恒河猴(Macaca mulatta)和狒狒(Papio ursinus)，以及狨猴(marmoset)(狨(Callithrix)属的种)、松鼠猴(松鼠属(Saimiri)的种)和绢毛猴(tamarin)(柽柳猴属(Saguinus)的种)，以及猿类的种，如黑猩猩(Pan troglodyte))、啮齿类动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠)、兔类(例如兔子、野兔)、牛类(例如牛)、绵羊类(例如绵羊)、山羊类(例如山羊)、猪类(例如猪)，马类(例如马)、犬科动物(例如狗)、猫科动物(例如猫)、海洋哺乳动物(例如海豚、鲸鱼)、爬行动物类(蛇、青蛙、蜥蜴等)和鱼类。在一个实施方式中，所述对象是人。

本文公开了本文定义的用于体外测试的三维细胞组合物的用途。三维细胞组合物可用于化合物的体外测试。三维细胞组合物还可以例如用于体外药物测试、消费者护理产品测试，经粘膜渗透、药物递送、衰老、宿主微生物组相互作用、宿主生物材料相互作用、寄主植入物相互作用或药物功效的研究，以及安全性、毒性或生物相容性的测定。

例如，三维细胞组合物可用于测试消费者护理产品的活性物和制剂的粘膜刺激、粘膜腐蚀和屏障破坏潜力，所述消费者护理产品包括但不限于漱口剂、牙膏、漂白剂、口腔清新剂、口腔冲洗器、指示片剂或溶液、口腔凝胶、口腔喷雾剂、牙科粘固粉、牙科粘合剂、蚀刻剂和义齿固定剂。三维细胞组合物可用于研究牙科治疗剂和生物材料的生物相容性(急性毒性)，包括但不限于牙科粘固粉、牙科复合材料、牙科粘合剂、义齿粘合剂、蚀刻剂、漂白剂。

在一个实施方式中，三维细胞组合物用于经粘膜递送牙科麻醉剂(例如盐酸利多卡因或盐酸阿替卡因)。

在一个实施方式中，三维细胞组合物用于衰老研究。

除非特别说明或从上下文清楚表明，如本文所使用的术语“约”应理解为本领域正常容许的范围，例如平均的标准差在2以内。约可理解为在所示值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％，或0.01％之内。除非本文另有明确表示，本文提供的所有数值均可用术语约修饰。

在整篇说明书及其后的说明中，除非上下文需要另外说明，词语“包括”或其变化形式如“包含”和“含有”应理解为暗示包括所述整数或步骤或者整数或步骤组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤组。

本说明书中对任何先前出版物(或从中获得的信息)或任何已知事项的引用，并且不被或不应被视为承认或任何形式的暗示，即该先前出版物(或从中获得的信息)或已知事项构成本说明书所涉及领域的共同常识的一部分。

本领域技术人员知道，在具体描述的情形以外对本文所述发明进行改变和调整是容易的。应理解，本发明包括所有这些落入本发明的精神和范围的变化和修改。本发明还包括说明书中以单独或组合方式提到或指示的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中任意两种或更多种的任意组合和全部组合。

现将参考以下示例描述本发明的某些实施方式，其仅用于说明的目的，而不旨在限制上述一般性的范围。

实施例

实施例1

方法

1.粘膜基质(固有层等效物)的制备：

为了制备固有层等效物，将牙龈或口腔成纤维细胞嵌入基于纤维蛋白的基质中。基于纤维蛋白的基质由三种组分组成：

-溶液-A:(5份)

о人血浆纤维蛋白原(10-80mg/ml):4份

о4-臂琥珀酰亚胺基戊二酸酯封端的聚(环氧乙烷)(10mg/ml):1份

-溶液-B:(16份)

о人凝血酶(100-400UN/ml):1份

о氯化钙(40mM):8份

о蒸馏水:7份

-溶液-C:(11份)

о成纤维细胞悬浮液(1-20x10

оOpti-MEM:10份

每种组分的总体积取决于待制备的组织等效物的数量和基于纤维蛋白的基质的总体积。

首先，将溶液-A的组分混合在一起，并在37℃下孵育30分钟。其次，将溶液-B的组分混合在一起并置于冰上。第三，从培养瓶中分离牙龈或口腔成纤维细胞，并将其重悬至所需的最终浓度。使用成纤维细胞细胞悬液，制备溶液-C。孵育30分钟后，将溶液-A和溶液-C混合在一起。然后将溶液-B添加到溶液-A+C混合物中，并立即用移液管注入细胞培养插入物中。凝胶化15-30分钟后，将培养基(培养基-GE1)添加到每个插入物，并将平板置于培养箱中。

培养基-GE1由补充有人血清(0.5–5％)、人血浆裂解物(0.5-5％)、人血清白蛋白(0.5-5％)、L-抗坏血酸(10-100ug/ml)、氢化可的松(50-500ng/ml)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,1-20ng/ml)、硒(1-10ng/ml)、乙醇胺(1-10ug/ml)、胰岛素(1-20ug/ml)、转铁蛋白(1-10ug/ml)和抑肽酶(10-100KIU/ml)的内皮无血清培养基(ESFM,GIBCO)构成。

2.全厚度牙龈等效物(牙龈-FT)的制备：

在固有层等效物培养2-6天后，将牙龈或口腔角质形成细胞接种在基质的顶部，并使用培养基-GE2培养1-3天。然后，将3D培养物转移到深孔板，并使用培养基-GE3在气液界面培养10-21天，用于角质形成细胞分层、分化和成熟。

培养基-GE2由补充有人血清(0.5–5％)、人血浆裂解物(0.5-5％)、人血清白蛋白(0.5-5％)、L-抗坏血酸(10-100ug/ml)、氢化可的松(50-500ng/ml)、EGF(1-10ng/ml)、硒(1-10ng/ml)、乙醇胺(1-10ug/ml)、胰岛素(1-20ug/ml)、转铁蛋白(1-10ug/ml)和抑肽酶(10-100KIU/ml)的角质形成细胞无血清培养基(KSFM,GIBCO)和ESFM的1:1混合物构成。

培养基-GE3由补充有人血清(0.5–5％)、人血浆裂解物(0.5-5％)、人血清白蛋白(0.5-5％)、L-抗坏血酸(10-100ug/ml)、氢化可的松(50-500ng/ml)、硒(1-10ng/ml)、乙醇胺(1-10ug/ml)、胰岛素(1-20ug/ml)、转铁蛋白(1-10ug/ml)和抑肽酶(10-100KIU/ml)的KSFM和ESFM的1:1混合物构成。

3.血管化粘膜基质(血管化固有层等效物)的制备：

为了制备血管化固有层等效物，将牙龈或口腔成纤维细胞和内皮细胞嵌入基于纤维蛋白的基质中。基于纤维蛋白的基质由三种组分组成：

-溶液-A:(5份)

о人血浆纤维蛋白原(10-80mg/ml):4份

о4-臂琥珀酰亚胺基戊二酸酯封端的聚(环氧乙烷)(10mg/ml):1份

-溶液-B:(16份)

о人凝血酶(100-400UN/ml):1份

о氯化钙(40mM):8份

о蒸馏水:7份

-溶液-C:(11份)

о成纤维细胞细胞悬浮液(1-20x10

о内皮细胞悬浮液(1-20x10

оESFM:5份

每种组分的总体积取决于待制备的组织等效物的数量和基于纤维蛋白的基质的总体积。

首先，将溶液-A的组分混合在一起，并在37℃下孵育30分钟。其次，将溶液-B的组分混合在一起并置于冰上。第三，从培养瓶中分离牙龈或口腔成纤维细胞和内皮细胞，并将其重悬至所需的最终浓度。使用获得的细胞悬液，制备溶液-C。孵育30分钟后，将溶液-A和溶液-C混合在一起。然后将溶液-B添加到溶液-A+C混合物中，并立即用移液管注入细胞培养插入物中。凝胶化15-30分钟后，将培养基(培养基-VGE1)添加到每个插入物，并将平板置于培养箱中。

培养基-VGE1由补充有人血清(0.5–5％)、人血浆裂解物(0.5-5％)、人血清白蛋白(0.5-5％)、L-抗坏血酸(10-100ug/ml)、氢化可的松(50-500ng/ml)、血管内皮生长因子(VEGF,5-50ng/ml)、表皮生长因子(EGF,1-10ng/ml)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,1-20ng/ml)、硒(1-10ng/ml)、乙醇胺(1-10ug/ml)、胰岛素(1-20ug/ml)、转铁蛋白(1-10ug/ml)和抑肽酶(10-100KIU/ml)的ESFM构成。

4.全厚度血管化牙龈等效物(牙龈-FT-V)的制备：

在血管化固有层等效物培养2-8天后，将牙龈或口腔角质形成细胞接种在基质的顶部，并使用培养基-VGE2培养1-3天。然后，将3D培养物转移到深孔板，并使用培养基-VGE3在气液界面培养10-21天，用于角质形成细胞分层、分化和成熟。

培养基-VGE2由补充有人血清(0.5–5％)、人血浆裂解物(0.5-5％)、人血清白蛋白(0.5-5％)、L-抗坏血酸(10-100ug/ml)、氢化可的松(50-500ng/ml)、VEGF(5-50ng/ml)、EGF(1-10ng/ml)、硒(1-10ng/ml)、乙醇胺(1-10ug/ml)、胰岛素(1-20ug/ml)、转铁蛋白(1-10ug/ml)和抑肽酶(10-100KIU/ml)的角质形成细胞无血清培养基(KSFM,GIBCO)和ESFM的1:1混合物构成。

培养基-VGE3由补充有人血清(0.5–5％)、人血浆裂解物(0.5-5％)、人血清白蛋白(0.5-5％)、L-抗坏血酸(10-100ug/ml)、氢化可的松(50-500ng/ml)、VEGF(5-50ng/ml)、硒(1-10ng/ml)、乙醇胺(1-10ug/ml)、胰岛素(1-20ug/ml)、转铁蛋白(1-10ug/ml)和抑肽酶(10-100KIU/ml)的KSFM和ESFM的1:1混合物构成。

5.全厚度口腔粘膜等效物(口腔粘膜-FT)的制备：

在固有层等效物培养2-6天后，将口腔角质形成细胞接种在基质的顶部，并使用培养基-OME2培养1-3天。然后，将3D培养物转移到深孔板，并使用培养基-OME3在气液界面培养3-8天，用于角质形成细胞分层、分化和成熟。

培养基-OME2由补充有人血清(0.5–5％)、人血浆裂解物(0.5-5％)、人血清白蛋白(0.5-5％)、L-抗坏血酸(10-100ug/ml)、氢化可的松(50-500ng/ml)、EGF(1-10ng/ml)、硒(1-10ng/ml)、乙醇胺(1-10ug/ml)、胰岛素(1-20ug/ml)、转铁蛋白(1-10ug/ml)和抑肽酶(10-100KIU/ml)的角质形成细胞无血清培养基(KSFM,GIBCO)和ESFM的1:1混合物构成。

培养基-OME3由补充有人血清(0.5–5％)、人血浆裂解物(0.5-5％)、人血清白蛋白(0.5-5％)、L-抗坏血酸(10-100ug/ml)、氢化可的松(50-500ng/ml)、硒(1-10ng/ml)、乙醇胺(1-10ug/ml)、胰岛素(1-20ug/ml)、转铁蛋白(1-10ug/ml)和抑肽酶(10-100KIU/ml)的KSFM和ESFM的1:1混合物构成。

6.全厚度血管化口腔粘膜等效物(口腔粘膜-FT-V)的制备：

在血管化固有层等效物培养2-8天后，将口腔角质形成细胞接种在基质的顶部，并使用培养基-VOME2培养1-3天。然后，将3D培养物转移到深孔板，并使用培养基-VOME3在气液界面培养3-8天，用于角质形成细胞分层、分化和成熟。

培养基-VOME2由补充有人血清(0.5–5％)、人血浆裂解物(0.5-5％)、人血清白蛋白(0.5-5％)、L-抗坏血酸(10-100ug/ml)、氢化可的松(50-500ng/ml)、VEGF(5-50ng/ml)、EGF(1-10ng/ml)、硒(1-10ng/ml)、乙醇胺(1-10ug/ml)、胰岛素(1-20ug/ml)、转铁蛋白(1-10ug/ml)和抑肽酶(10-100KIU/ml)的角质形成细胞无血清培养基(KSFM,GIBCO)和ESFM的1:1混合物构成。

培养基-VOME3由补充有人血清(0.5–5％)、人血浆裂解物(0.5-5％)、人血清白蛋白(0.5-5％)、L-抗坏血酸(10-100ug/ml)、氢化可的松(50-500ng/ml)、VEGF(5-50ng/ml)、硒(1-10ng/ml)、乙醇胺(1-10ug/ml)、胰岛素(1-20ug/ml)、转铁蛋白(1-10ug/ml)和抑肽酶(10-100KIU/ml)的KSFM和ESFM的1:1混合物构成。

结果

1.大致外观

基于纤维蛋白的基质能够制备无收缩的牙龈组织等效物。图1显示了6孔和12孔内插入物形式制备的牙龈组织等效物。6孔插入物形式提供直径为22mm、面积为3.8cm

2.牙龈-FT的表征：

全厚度牙龈组织等效物(牙龈-FT)在形态和功能特征方面与天然牙龈相似。苏木精-伊红染色图片显示，在牙龈成纤维细胞填充的固有层基质上，存在角化的分层鳞状上皮，其由基底层、棘层、颗粒层和角质层组成，与天然人牙龈组织相似(图2)。此外，牙龈-FT组织的分层显示细胞角蛋白-5(CK-5)在基底层和基底上层的表达，以及CK-10在基底上层(棘层、颗粒层和角质层)的表达(图3)。通过上皮分化标志物的表达证明牙龈FT的成熟：CK-10在基底上层表达，而兜甲蛋白和丝聚合蛋白在颗粒-角质层中强烈表达(图4)。此外，胞外基质蛋白如1型胶原蛋白和纤连蛋白在固有层基质中强烈表达(图5)。基底膜蛋白(IV型胶原和层粘连蛋白-5)的表达证明了牙龈上皮和下层固有层之间的接合(图6)。总的来说，这些组织学特征证实了与天然人牙龈组织相似的体外全厚度牙龈组织的形成。

3.牙龈-FT-V的表征：

为了制备全厚度血管化牙龈组织等效物(牙龈-FT-V)，首先优化了微血管网络的组装条件，以构建血管化固有层等效物。图7、8显示了使用不同浓度的纤维蛋白原、凝血酶和细胞参数(每单位体积基质的内皮细胞数量和内皮细胞与成纤维细胞的比率)制备的血管化固有层等效物中微血管网络的形成。此外，图8显示了8天培养期内微血管网络形成的动力学。微血管网络早在第3天就形成，并且在长期培养过程中是稳定的。

全厚度血管化牙龈组织等效物(牙龈-FT-V)在血管存在和形态特征方面与天然牙龈相似。苏木精-伊红染色图片显示，在血管化的固有层基质上，存在角化的分层鳞状上皮，其由基底层、棘层、颗粒层和角质层组成，与天然人牙龈组织相似(图9)。牙龈-FT-V组织的分层显示细胞角蛋白-5(CK-5)在基底层和基底上层的表达，以及CK-10在基底上层(棘层、颗粒层和角质层)的表达(图10)。通过上皮分化标志物的表达证明牙龈FT-V的成熟：CK-10在基底上层表达，而兜甲蛋白和丝聚合蛋白在颗粒-角质层中强烈表达(图11)。此外，胞外基质蛋白如1型胶原蛋白和纤连蛋白在固有层基质中表达(图12)。基底膜蛋白(IV型胶原和层粘连蛋白-5)的表达证明了牙龈上皮和下层固有层之间的接合(图13)。重要的是，CD31、vWF、IV型胶原和层粘连蛋白-5的表达证明固有层内存在管腔化(lumenized)血管(图13)。这些标志物标记血管，其可以被视为具有管腔的圆形到细长结构。总的来说，这些组织学特征证实了与天然人牙龈组织相似的体外全厚度血管化牙龈组织的形成。

实施例2

牙龈组织构建体的下游应用验证

口腔护理和牙科护理产品通常日常用于个人护理和治疗原因。在这些产品进入市场之前，对其安全性、毒性和生物相容性进行测试，如粘膜刺激和腐蚀研究。同样，在产品开发阶段，必须鉴定新型活性物、赋形剂和药物/产品制剂的粘膜毒性、生物相容性和功效。本发明的3D培养牙龈组织等效物可广泛用作口腔和牙科护理产品的毒性和功效研究、药物渗透研究、研究牙龈组织和口腔细菌之间相互作用的宿主微生物组研究中的动物实验的替代品，以及作为用于牙周或口腔粘膜再生相关应用的组织工程移植物。以下提供了多种下游应用的一些验证研究作为案例研究示例。

这些全厚牙龈组织等效物已用于生物相容性测试、药物渗透研究、毒性测试、宿主微生物组研究和牙周再生相关的应用。

A.粘膜刺激、腐蚀和屏障完整性研究

粘膜刺激是指施用测试物质后对粘膜组织造成的可逆损伤。另一方面，粘膜腐蚀是指施用测试物质后不可逆的组织损伤。化学诱导的刺激和腐蚀的潜力是口腔护理、牙科护理和人用的药物产品安全评估的重要考虑因素。因此，了解口腔和牙科护理产品、活性物和赋形剂对粘膜刺激和腐蚀的潜在作用，对于鉴定危害和降低潜在风险至关重要。

1)牙龈-FT用于研究漱口剂对完整粘膜组织上粘膜刺激的潜力的用途

为了评估本发明的3D培养的牙龈组织等效物对粘膜刺激的用途，我们研究了2种市售漱口剂的影响。为了模拟实际使用情况，将牙龈组织等效物(表面积0.78cm

2)固有层等效物用于研究漱口剂对溃烂粘膜组织上粘膜刺激的潜力的用途

口腔溃疡是口腔最常见的疾病之一。由于口腔溃疡没有覆盖的上皮，上皮提供的屏障功能丧失。因此，口腔溃疡可能对外用剂敏感。为了评估3D培养的固有层等效物作为口腔溃疡的模型的用途，我们研究了2种市售漱口剂对粘膜刺激的影响。为了模拟实际使用情况，将牙龈组织等效物(表面积0.78cm

3)牙龈-FT用于调查漱口剂对粘膜腐蚀的潜力的用途

用于加入活性物和配制口腔/牙科护理产品和药物的一些赋形剂可能会导致粘膜腐蚀，类似于酸和碱等腐蚀性物质。为了评估本发明的3D培养的牙龈组织等效物对粘膜腐蚀的用途，我们采用OECD TG431指南来研究2种市售漱口剂的粘膜腐蚀潜力。根据OECDTG431指南，将牙龈组织等效物(表面积0.78cm

B.药物渗透和药物递送应用

研究人员和制药公司越来越多地研究通过口腔组织的药物递送，因为与全身递送相比，口腔组织具有多种优势。例如，与肠道或皮肤组织相比，通过口腔组织吸收药物更快；其不受肠道内消化酶的影响；可以直接到达血流；因此需要的有效剂量低。

1)牙龈-FT在经粘膜药物渗透/递送应用中的用途

为了验证牙龈FT和牙龈-FT-V组织在经粘膜药物递送应用中的用途，评估了模型药物(如牙科麻醉剂)的渗透性。牙科麻醉剂盐酸利多卡因和盐酸阿替卡因用作模型药物。将代表无限剂量的150μl盐酸利多卡因(1.66mg/ml)或盐酸阿替卡因(3.32mg/ml)的液体悬浮液加载到组织的上皮表面，并评估随时间推移通过组织的渗透动力学。为了模拟具有屏障破坏的病变组织和/或具有渗透促进剂的制剂，用1％十二烷基硫酸钠处理一些组织构建体60分钟，并在加载牙科麻醉剂之前温和地洗涤。5小时内药物渗透分析显示利多卡因和阿替卡因通过完整组织和SLS处理组织的渗透动力学(图17)。利多卡因和阿替卡因都渗透通过完整组织和SLS处理组织。然而，通过渗透参数(如累积渗透量、稳态通量和渗透系数)显示，与完整组织相比，通过SLS处理的组织的利多卡因和阿替卡因的渗透显著更高(图17)。这些结果证明了调节牙龈组织构建体的渗透动力学的潜力及其在药物渗透和药物递送应用中的用途。

C.与牙科材料的生物相容性评估相关的应用

牙科材料，如牙科粘固粉、义齿，会与口腔组织中-长期接触。因此，牙科材料在不对口腔组织造成不良反应的情况下发挥作用的能力是重要的。

1)牙科复合材料的生物相容性(急性毒性)

为了验证牙龈-FT和牙龈-FT-V组织在牙科材料生物相容性测试中的用途，将牙科复合材料盘(Filtek Z350 XT,C1体色,3M ESPE)放置在牙龈构建体的顶部并培养48小时。使用1mm厚的聚乙烯塑料盘作为阴性对照。根据制造商的建议，理想的固化深度为2mm，以避免复合填料较深部分的树脂未固化。因此，使用厚度为2mm和4mm的复合盘(在类似的光照条件下固化10秒)来评估未固化树脂的急性毒性潜力(图18A)。所用组织构建体的直径为10mm，而复合盘的直径为5mm。这独特地允许评估复合树脂对直接接触组织和周围未暴露组织的影响(图18B)。组织切片显示复合样品暴露区域的角质层破裂(图18C)。使用MTT测定对组织活力的评估显示细胞活性降低，但这种降低没有统计学显著性(图18D)。类似地，IL-1α(一种在粘膜刺激研究中用作替代标志物的细胞因子释放)也没有差异(图18E)。然而，与阴性对照相比，代表急性毒性的另一替代标志物IL-1β在两种暴露于复合材料的组织中显著增加(图18F)。这些结果证明了牙龈和口腔粘膜组织构建体在牙科材料和其他生物材料的生物相容性评估中的潜在用途。

D.衰老研究

口腔粘膜衰老与牙龈和牙周组织的上皮萎缩和伤口愈合受损有关。牙龈成纤维细胞在牙周手术后的上皮形态发生、无瘢痕愈合和愈合中起着核心作用。然而，口腔成纤维细胞的细胞衰老对牙龈上皮形态发生的作用尚不清楚。大多数研究依赖于体外单层培养和动物模型的使用，这些模型不能很好地反映人体生理。牙龈-FT和牙龈-FT-V组织构建体的人体相似性，为研究口腔粘膜和牙龈衰老提供了机会。

1).组织构建体在口腔粘膜衰老研究中的用途

为了研究细胞衰老对口腔粘膜的影响，从用于牙龈-FT制备的方案改进为用于生物制备全厚度口腔粘膜等效物(OME)的培养方案。全厚度OME的制备如下：首先，使用嵌入培养基-GE1中纤维蛋白基质(如前所述)内的口腔粘膜成纤维细胞制备固有层等效物。在固有层等效物培养2-6天后，将口腔角质形成细胞接种在基质的顶部，并使用培养基-OME2培养1-3天。然后，将3D培养物转移到深孔板，并使用培养基-OME3在气液界面培养3-8天，用于角质形成细胞分层、分化和成熟，这类似于衬垫口腔粘膜组织(如颊粘膜)的非角化分层鳞状上皮。为了制备年轻和衰老OME的OME组织构建体，分别使用早期世代(第3-8代)和晚期世代(第15-25代)的口腔成纤维细胞。

组织学评估和上皮厚度分析显示，年轻和衰老口腔粘膜表型之间的口腔粘膜上皮形态和厚度没有显著差异(图19A,B)。这与许多临床研究相似，其表明年老者的颊粘膜组织中没有任何可观察到的差异。然而，细胞因子释放谱的评估显示IL-6和IL-8(参与先天免疫反应和伤口愈合的关键细胞因子)的产生显著降低(图19C)。这些结果表明，衰老口腔粘膜组织的免疫反应和伤口愈合可能受损。这些研究显示了调节生物制备方法以产生代表不同表型的组织(包括年轻和衰老口腔粘膜)的潜力。

2)牙龈FT组织构建体在牙龈衰老研究中的应用

为了研究细胞衰老对牙龈的影响，分别使用早期世代(第3-8代)和晚期世代(第15-25代)牙龈成纤维细胞生物制备牙龈-FT的培养方案，进行年轻和衰老牙龈构建体的生物制备。组织学评估和上皮厚度分析显示衰老牙龈组织上皮萎缩。衰老牙龈组织中上皮厚度测量值显著降低进一步支持了这一点(图20A,B)。此外，细胞因子释放谱的评估显示IL-6和IL-8(参与先天免疫反应和伤口愈合的关键细胞因子)的产生显著降低(图20C)。这些结果表明，衰老牙龈组织的屏障功能、免疫反应和伤口愈合可能受损。这些研究显示了调节生物制备方法以产生代表不同表型的组织(包括年轻和衰老牙龈)的潜力，以及它们在理解和干预牙龈衰老中的用途。