一种与大白菜霜霉病抗性基因相连锁的InDel分子标记及其获得方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种与大白菜(Brassica rapaL.syn.B.campestris L.)霜霉病抗性基因相连锁的InDel分子标记及其获得方法。

背景技术

有研究发现，六个芸薹属物种构成的“U三角”模式解析了主要芸薹属作物的起源和演化关系，包括三个二倍体基本种：B.rapa(AA基因组)、B.nigra(BB基因组)和B.oleracea(CC基因组)；以及三个成对杂交产生的异源四倍体杂交种：B.napus(AACC基因组)、B.juncea(AABB基因组)和B.carinata(BBCC基因组)。大白菜是十字花科芸薹属植物，二年生或一年生草本亚种，种群多变。除芜菁(B.campestris ssp.rapifera Sinsk)因其肉质根膨大而被归类为根菜类蔬菜外，其余均为染色体数为2n＝2x＝20且染色体组为AA基因组的一大类蔬菜，包括有结球白菜(var.pekinensis(Rupr.)J.Cao et Sh.Cao)、不结球大白菜(var.communis Tsen et Lee,Pak Choi)、菜心(var.parachinensis(Bailey)Tsen etLee)、乌塌菜(var.rosularis Tsen et Lee)、紫菜薹(var.purpurea Mao)、薹菜(var.tai-tsai Sh.Cao ex J.Cao)、分蘖菜(var.multiceps Sh.Cao ex J.Cao)和日本水菜(ssp.nipposinica(Bailey)Olsson)。大白菜在我国各地广泛栽培，其中，结球白菜的主产区在长江以北，不结球大白菜的主产区在长江以南。近几百年来，随着人们交流的增多和地球村效应的产生，大白菜在东亚地区非常流行，逐渐成为世界蔬菜之一。大白菜是我国最重要的蔬菜作物之一，其生长面积和产量是迄今为止栽培蔬菜中最高的。据不完全统计，大白菜全年播种面积约占全国蔬菜总播种面积的约百分之十五，是我国北方冬贮数量最大的蔬菜。其在均衡市场供应、稳定蔬菜价格等方面举足轻重。

霜霉病是一种常见的真菌性病害，对十字花科作物造成严重危害。这种病害在湿冷环境下特别容易发生，霜霉病不仅导致叶片变黄、枯萎，还会造成叶片变形、萎缩，严重影响植株的生长发育。受感染的白菜植株会出现减产现象，甚至部分植株死亡。霜霉病是由真菌中霜霉菌引起的植物病害，引起白菜霜霉病的寄生霜霉为Peronospora parasitica，该菌为专性寄生菌。此病从幼苗到收获各阶段均可发生，以成株受害较重。主要危害叶片，由基部向上部叶发展。在我国，各十字花科蔬菜产区都有霜霉病的发生，但在黄河以北和长江流域地区的白菜受害较为严重。霜霉病通常在早春和湿度较高的秋季发生流行。在一般年份，霜霉病对大白菜的损失为15％～30％，而在发病严重的年份，损失可高达50％～60％。目前对霜霉病的防治手段主要有农业防治、农药防治和选用抗病品种。因此，为有效减少霜霉病造成的田间损失，需要在生产上培育具有霜霉病抗性的白菜品种，这就需要在理论上加强大白菜霜霉病抗性分子遗传机制的研究。

为解决我国十字花科作物大田生产中面临的霜霉病问题，育种家们正在积极挖掘新的抗霜霉病种质资源。虽然以往利用形态学标记和生化标记辅助育种已获得一些优良的霜霉病抗性自交系，但传统方法在筛选抗病植株时存在选育时间长、操作繁琐等问题。另外，霜霉病抗性易受环境条件影响，难以满足育种实践的需要。我国是大白菜的原产地和多样性中心，收集和保存了大量的地方品种和地方品系，并将其用于育种过程。近年来，随着测序技术、生物信息学和相关学科的发展，对植物起源、进化、亲缘关系、关键农艺性状的遗传基础和种质群体分层结构的研究取得了长足的进步。全基因组测序已成为现代种群遗传进化、关键基因图谱绘制、动植物分子育种和人类疾病研究中最有效的研究工具之一。随着分子生物学的发展，利用分子标记辅助技术在十字花科作物的霜霉病抗性育种中显示出巨大的潜力。这种基于DNA变异的分子标记技术能够免除传统育种中繁重的选择过程，跟踪和检测外源基因，并将多个抗病及抗逆基因聚合到同一优良品种中，从而使得这些品种获得持久、广泛的抗性。

提高霜霉病抗性是大白菜乃至整个十字花科蔬菜共同的选育目标之一。在后续的大田栽培中，通过杂交与回交技术，可以将大白菜中鉴定获得的霜霉病抗性基因转移到同种的不结球白菜、芜菁、乌塌菜、水菜等变种中，从而为霜霉病抗性的白菜类蔬菜新品种选育提供丰富的基因资源。因此，寻找与白菜霜霉病抗性基因紧密连锁的相关分子标记，不仅可以加快白菜中霜霉病抗性基因的鉴定，提高霜霉病抗性植株的选育效率，还可以进一步克隆霜霉病抗性基因，为进一步研究其抗病机理与生物学功能奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中霜霉病抗性分子标记不足的问题，提供一种与大白菜霜霉病抗性基因相连锁的InDel分子标记及其获得方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：本发明提供了一种白菜霜霉病抗性分子标记，在感病群体中该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，在抗病群体中该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

另外，本发明还提供了一种与大白菜霜霉病抗性基因相连锁的InDel分子标记，上述的白菜霜霉病抗性分子标记的上游引物为SMB.4-F，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；下游引物为SMB.4-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

此外，本发明还提供了一种如上述的与大白菜霜霉病抗性基因相连锁的InDel分子标记的获得方法，包括以下步骤：

(1)将55份种质资源直播于哈尔滨市农业科学院作物研发中心的白菜试验地，依据考种标准进行试验，其中考种标准参考《植物品种特异性、一致性和稳定性测试指南-大白菜》中的附录A和附录B；采样时，每个样品取3-5株的嫩叶部分混合，采样后当天用泡沫箱和干冰邮寄至测序公司进行后续的DNA提取和基因组重测序；

(2)对采样得到的单株进行DNA提取和基因组重测序，获取基因组重测序数据；

(3)使用Tassel软件对考种过程中获得的白菜霜霉病抗/感表型以及基因组重测序数据进行全基因关联分析并绘制曼哈顿图，获得与霜霉病抗性相关的SNP位点和InDel位点；在上述SNP位点和InDel位点的上下游设计8对引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.5-18所示，用于检测在霜霉病抗病和感病群体的多态性；通过聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳检测，以筛选出与目标性状存在连锁关系且位于A04染色体的InDel分子标记SMB4；其中所述目标性状为霜霉病抗性。

进一步地，所述步骤(2)包括以下子步骤：

(2.1)使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen)从样本中提取基因组DNA，使用CTAB法从植物样本中提取基因组DNA；使用NanoDrop2000分光光度计测定总基因组DNA的浓度和质量；DNA文库构建通过使用NEBNext DNA文库预处理试剂盒(BioLabs，#E6000)完成；DNA文库构建完成后，在Illumina NovaSeq 6000平台(Illumina，CA，USA)上进行测序；

(2.2)为避免人为偏差，对测序得到的原始读数根据以下标准进行筛选：①未识别核苷酸含量超过10％；②与适配体对齐的读数中核苷酸含量大于10％，允许错配率小于10％；③平均碱基质量小于20(根据Phred-like评分确定)；最后获得高质量序列用于后续分析，具体为：利用BWA(Burrows-Wheeler Aligner)软件(v.0.7.8版本)的MEM算法，使用“men-t4-k32-M”命令将干净的成对末端读数映射到Ensemble_v54参考Oryza sativa基因组；通过使用SAMtools软件(v.1.3版本)以将映射结果转换为BAM文件并进行索引和排序；如果多个读数对的外部坐标相同，则只保留映射质量最高的读数对；潜在的PCR重复将使用Picard(v1.94版本)去除，以改善比对结果；

(2.3)对齐后，使用GATK HaplotypeCaller v4.0.4(BSA替换为UnifiedGenotyperv3.8.1)调用每个序列的SNP和InDel；使用以下标准进一步筛选SNPs和InDels：SNPs过滤标准为“QD<2.0||FS>60.0||MQ<40.0||SOR>3.0||MQRankSum<-12.5||ReadPosRankSum<-8.0||QUAL<30.0”，InDels过滤标准为“QD<2.0||FS>200.0||QUAL<30.0||ReadPosRankSum<-8.0”；变异由SnpEff软件(v4.3版本)注释；Control-FREEC(v11.5版本)(Boeva et al.,2012)和Lumpy(v0.2.13版本)(Layer et al.,2014)分别用于调用种系CNV和SV；在CNV调用的配置文件中设置coefficientOfVariation＝0.05、minExpectedGC＝0.35和maxExpectedGC＝0.55的参数。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明通过使用55份大白菜的重测序数据，利用全基因组关联分析技术，鉴定到了与霜霉病抗性高度相关的SNP位点和InDel位点，基于以上成果开发了一对分子标记引物，可直接用于大白菜霜霉病抗性的分子标记辅助育种实践中；在实际生产中使用该分子标记引物，不仅可以加快白菜中霜霉病抗性基因的鉴定，提高霜霉病抗性植株的选育效率，还可以进一步克隆霜霉病抗性基因，为进一步研究其抗病机理与生物学功能奠定了基础；因此，本发明在白菜蔬菜育种实践及霜霉病抗性理论研究上均具有重要意义。

附图说明

图1为霜霉病抗病极端池；

图2为霜霉病感病极端池；

图3为SMB.4引物对霜霉病抗/感基因池的扩增结果；

图4为SMB.5引物和SMB.6引物对霜霉病抗/感基因池的扩增结果；

图5为SMB.4引物在霜霉病抗性和感病群体中的扩增产物比对图；

图6为SMB.4引物分别在霜霉病感病群体中的扩增产物的测序结果图；

图7为SMB.4引物分别在霜霉病抗病群体中的扩增产物的测序结果图。

具体实施方式

这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本申请相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本申请的一些方面相一致的装置和方法的例子。应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本申请。

在本申请使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。

应当理解，尽管在本申请可能采用术语第一、第二、第三等来描述各种信息，但这些信息不应限于这些术语。这些术语仅用来将同一类型的信息彼此区分开。例如，在不脱离本申请范围的情况下，第一信息也可以被称为第二信息，类似地，第二信息也可以被称为第一信息。取决于语境，如在此所使用的词语“如果”可以被解释成为“在……时”或“当……时”或“响应于确定”。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

下面结合附图，对本发明进行详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施方式中的特征可以相互组合。

实施例1：获得与大白菜霜霉病抗性基因相连锁的分子标记

1、将55份种质资源直播于哈尔滨市农业科学院作物研发中心的白菜试验地，每份种质资源重复种植3次，每次重复为5米长的2行区。每亩地施用3000kg腐熟有机肥和25kg复合肥，垄高25cm左右，垄距65cm左右。整个生育期未追肥。第一天进行播种，在第三天出苗，第十天第一次间苗，每穴留3-4株健康苗，再过十天第二次间苗并定苗，每穴留一株健壮无病苗。整个生产期进行三铲两趟，田间发现虫害及时喷施防虫药剂，生育期内未喷施病害防治药剂，具体依据考种标准进行。然后采样，每个样品取3-5株的嫩叶部分混合，采样后当天用泡沫箱和干冰邮寄至测序公司进行后续的DNA提取和基因组重测序。其中，考种标准参考《植物品种特异性、一致性和稳定性测试指南-大白菜》中的附录A、附录B。

2、对采样得到的单株进行DNA提取和基因组重测序。

2.1、使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen)从样本中提取基因组DNA，使用CTAB法从植物样本中提取基因组DNA；使用NanoDrop2000分光光度计测定总基因组DNA的浓度和质量；DNA文库构建通过使用NEBNext DNA文库预处理试剂盒(BioLabs，#E6000)完成；DNA文库构建完成后，在Illumina NovaSeq 6000平台(Illumina，CA，USA)上进行测序；

2.2、为避免人为偏差，对测序得到的原始读数根据以下标准进行筛选：①未识别核苷酸含量超过10％；②与适配体对齐的读数中核苷酸含量大于10％，允许错配率小于10％；③平均碱基质量小于20(根据Phred-like评分确定)；最后获得高质量序列用于后续分析，具体为：利用BWA(Burrows-Wheeler Aligner)软件(v.0.7.8版本)的MEM算法，使用“men-t4-k32-M”命令将干净的成对末端读数映射到Ensemble_v54参考Oryza sativa基因组；通过使用SAMtools软件(v.1.3版本)以将映射结果转换为BAM文件并进行索引和排序；如果多个读数对的外部坐标相同，则只保留映射质量最高的读数对；潜在的PCR重复将使用Picard(v1.94版本)去除，以改善比对结果；

2.3、对齐后，使用GATK HaplotypeCaller v4.0.4(BSA替换为UnifiedGenotyperv3.8.1)调用每个序列的SNP和InDel；使用以下标准进一步筛选SNPs和InDels：SNPs过滤标准为“QD<2.0||FS>60.0||MQ<40.0||SOR>3.0||MQRankSum<-12.5||ReadPosRankSum<-8.0||QUAL<30.0”，InDels过滤标准为“QD<2.0||FS>200.0||QUAL<30.0||ReadPosRankSum<-8.0”；变异由SnpEff软件(v4.3版本)注释；Control-FREEC(v11.5版本)(Boeva et al.,2012)和Lumpy(v0.2.13版本)(Layer et al.,2014)分别用于调用种系CNV和SV；在CNV调用的配置文件中设置coefficientOfVariation＝0.05、minExpectedGC＝0.35和maxExpectedGC＝0.55的参数。

3、使用Tassel对软件上述获得的植物表型(即考种过程中获得的白菜霜霉病抗/感表型)和基因组重测序数据进行全基因关联分析并绘制曼哈顿图，获得与霜霉病抗性相关的SNP位点和InDel位点。在上述SNP位点和InDel位点的上下游设计8对引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.5-18所示，具体如表1所示，用于检测在霜霉病抗病和感病群体的多态性。

表1：SMB.4位点上下游设计的8对引物序列

需要说明的是，后续步骤中，使用表1中的8对引物在大白菜霜霉病抗病感病群体中进行PCR扩增，将PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，检测其差异性，从而最终筛选出与目标性状存在连锁关系且位于A04染色体的InDel分子标记SMB4。

4、在如图1所示的大白菜霜霉病抗病极端池和如图2所示的大白菜霜霉病感病极端池中使用上述8对引物进行PCR扩增，PCR体系为12.5μL 2×T5 Super PCR Mix(PAGE)(TSINGKE)，9.5μL去离子水，10μM上游引物，10μM下游引物，1μg DNA模板。PCR检测的扩增程序：98℃预变性2min，进入37个循环，每个循环为：98℃变性10s，57℃退火10s，72℃延伸5s；最后再72℃延伸2min。PCR反应过程在BIO-RAD S1000

示例性地，SMB.4引物对霜霉病抗/感基因池的扩增结果如图3所示，其中，1-5代表霜霉病感病基因池，6-15代表霜霉病抗性基因池，M为100bp DNAmarker。SMB.5引物和SMB.6引物对霜霉病抗/感基因池的扩增结果如图4所示，其中，1-5代表霜霉病感病基因池，6-15代表霜霉病抗性基因池，M为100bp DNA marker。

5、对于上述步骤得到的PCR扩增产物，使用12％质量百分数的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳检测其差异性，以筛选出与目标性状(霜霉病抗性)存在连锁关系且位于A04染色体的InDel分子标记SMB4。

其中，PAGE电泳所需试剂和仪器具体包括：

①配制30％质量百分比的胶原液：在离心管中加入29g丙烯酰胺和1g N,N’-甲双丙烯酰胺，然后加入去离子水至100mL，37℃搅拌溶解后存放在4℃避光保存。

②配制0.1g/mL的过硫酸胺(Ammonium persulfate，APS)溶液：将1g过硫酸胺溶解在10mL去离子水中，然后存放在4℃。

③配制pH为8.3的5×TBE(Tris-硼酸-EDTA)缓冲液：将27g的Tris碱、13.75g硼酸和1.86g的Na

④N’，N’，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)。

⑤上样缓冲液：含有0.25％溴酚蓝(W/V)和40％蔗糖水溶液(W/V)，存放在4℃。

⑥封底胶：1％琼脂糖溶液，通过使用1×TBE配置。

⑦染色液：将50mL无水乙醇和0.5g硝酸银溶解于去离子水中，定容至500mL，存放于棕色瓶中，22℃保存。

⑧显色液：将10g氢氧化钠溶解于去离子水中，定容至500mL，22℃保存。PAGE电泳过程中需要使用时，每250mL显色液加入1mL质量百分数为37％的甲醛，现配现用。

⑨仪器：包括DYY-6C型稳压稳流电泳仪、DYCZ-30C型双夹板垂直电泳槽、Tanon2500全自动数码凝胶图像分析系统等。

进一步地，PAGE电泳具体包括如下步骤：

5.1、用去污剂清洁玻璃板、梳子、橡胶套和电泳槽，冲洗自来水后晾干，然后用酒精擦拭。将两块玻璃板插入橡胶套后放入电泳槽中，确保较低的玻璃板朝向负极(黑色电极)，保持水平并紧密密封。

5.2、在微波炉中加热封底胶至沸腾，再用其封闭玻璃板和橡胶套的接缝，同时封闭一块玻璃板底部的空隙。

5.3、制备50mL 12％质量百分比的聚丙烯酰胺凝胶溶液：将19.65mL去离子水、20mL的30％质量百分比的胶原液、10mL的5×TBE缓冲液、35μL的TEMED和350μL的APS溶液进行混合。

5.4、用100mL注射器吸取聚丙烯酰胺凝胶溶液，排净针管中的空气后插入两块玻璃板之间的空隙，注入聚丙烯酰胺凝胶溶液，填满空隙后，立即将合适的梳子轻轻插入聚丙烯酰胺凝胶溶液中，确保梳齿下无气泡，梳子顶端略高于玻璃板上沿。

5.5、在22℃或30℃烘箱中聚合30至60分钟，若聚丙烯酰胺凝胶回缩明显，需补加聚丙烯酰胺凝胶溶液；待聚丙烯酰胺凝胶完全聚合后，梳齿下可见两条折光线。

5.6、使用1×TBE浸润聚丙烯酰胺凝胶顶端2至4分钟，小心拔出梳子，立即用1×TBE冲洗加样孔，以避免梳子残留的少量聚丙烯酰胺凝胶溶液在加样孔聚合，导致表面不平整。

5.7、将胶膜夹在电泳槽上，每20μL体系中加入2μL上样缓冲液，混匀后点样1μL。

5.8、在电泳仪中进行电泳，设定电压为120V，电流为60mA，直至电泳到2/3位置停止(约3小时)。

进一步地，在PAGE电泳结束后，通过银染PAGE胶检测PCR扩增产物的差异性，以筛选出与目标性状(霜霉病抗性)存在连锁关系且位于A04染色体的InDel分子标记SMB4，具体如下步骤：

5.9、在PAGE电泳结束后，取下玻璃板，将聚丙烯酰胺凝胶转移到染色液中，在22℃下以40至80rpm振荡8至10min。

5.10、倒掉染色液，用去离子水(ddH

5.11、用ddH

实施例2：对筛选获得的InDel分子标记SMB.4的PCR扩增产物进行回收和测序

得到的InDel分子标记SMB.4在霜霉病抗病和感病群体中的PCR扩增产物的对比结果如图5所示，在霜霉病感病群体中，InDel分子标记SMB.4的PCR扩增产物大小为136bp，如图6所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体为5’-ACCTGCGACTGCGACTAAAATTATGTTCGTTTACGTGTAGCGCGACTTGTAGATCTGC GACCAGTCGCGCGATCAAAATGTTTATAAGTTTTAGTCACTGTTTCTTCGGGCAACTTGA ATCGGAACCTGCGACTGG-3’；在霜霉病抗病群体中，InDel分子标记SMB.4的PCR扩增产物大小为161bp，如图7所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体为5’-ACCTGCGACTGCGACTAAAATTATGTTCGTTTACGTGTAGCGCGACTTGCGACTTGCG ACATTCGACTAAAATTATGTTTGTTTACATGTCGCGCGATCAACGTTTTTATAAGTTTTAG TCGTTGTTTCTTCGGGCAACTTGAATCGGAACCTGCGACTGG-3’。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。