RNA快速建库方法及其应用

技术领域

本发明专利涉及一种RNA快速建库方法，属于生物技术领域。

背景技术

RNA二代测序技术(RNA Next-generation sequencing,RNA-seq)是一种高通量大规模的RNA并行测序技术，可以同时对几十万乃至几百万个RNA分子进行序列测定，用于未知病原的鉴定、生物遗传进化分析、基因表达差异分析和RNA合成及加工分析等。因此，RNA-seq广泛用于科学研究和疾病诊断等领域，并取得了许多突破性的结果。RNA NGS文库构建是指通过逆转录和接头连接等过程将RNA转化为二代测序仪可识别的双链DNA的过程，是RNA-seq的关键步骤。传统的RNA建库方法需要的RNA投入量较大(1ng以上)，因此建库需要的细胞量较多(每个人类细胞中的总RNA量低于10pg)。此外，传统的RNA建库技术获得的RNANGS文库无法区分RNA的具体细胞来源，RNA-seq获得的数据只能分析样本中RNA丰度的平均值，而不能计算出样本中每个细胞的RNA表达丰度。这对于异质性较大的样本如血液样本、肿瘤组织样本、羊水样本、胚胎样本和小型动植物个体等的RNA种类及丰度的检测是极为不利的，在很大程度上影响了疾病的诊断和生长发育进程的分析。

单细胞转录组测序技术(Single cell RNA sequencing,scRNA-seq)的出现，为解决样本异质性问题提供了有效的方案。通过激光捕获显微切割技术、流式细胞仪技术、微滴技术和微流体技术等单细胞分离技术获取独立的单个细胞，并通过逆转录反应为每个细胞的cDNA加上具有独立标识DNA序列(Cell barcode)，在测序数据分析过程中通过这个独立标识的DNA序列鉴别每条RNA序列的细胞来源，从而分析样本中每个细胞中的RNA丰度。scRNA-seq技术大大提高了我们对生物系统和细胞病变的了解，使研究者能够以前所未有的分辨率研究基因表达图谱。scRNA-seq为分析和诊断疾病进程、血液细胞分型、产前诊断和生物生长发育提供了更加高效准确的工具与方案，因此受到科学研究和疾病诊治领域的广泛关注。但是，scRNA-seq需要对单个细胞的RNA进行文库构建，这极大地提高了RNA建库的难度。传统的RNA建库技术操作复杂、损失严重，因此无法应用在scRNA-seq的文库构建上。为解决这一问题，研究者们开发了多种单细胞RNA文库构建方法，来提高RNA文库构建的效率，减少建库过程的损失，如Smart-seq、CEL-seq、Quartz-seq、SUPeR-seq和MATQ-seq等。但这些scRNA-seq技术由于建库设计的原因，存在基因检出率低、RNA信息完整度差和操作复杂等缺陷，严重阻碍了scRNA-seq技术的发展和应用。因此，开发一种更加高效的单细胞转录组测序技术，对于疾病诊断和生物生长发育等研究，具有重要的意义。

本发明提供一种高效快速的RNA建库技术，称为Easy-seq(Easy RNAsequencing)。相较于传统的RNA建库方法，Easy-seq具有耗时短、操作简单和损失小等优点，因此可以应用于单细胞转录组测序(scEasy-seq)。相较于已有的scRNA-seq技术，scEasy-seq具有基因检出率高、RNA信息完整和建库产量高等优点，是一种高效灵敏的单细胞转录组测序技术，可以广泛应用于科学研究和疾病诊断等领域。

发明内容

本发明的目的是提供一种RNA快速建库方法，具有耗时短、操作简单和损失小的优点。

本发明采取的技术方案为：一种RNA快速建库方法，其特征在于其步骤包括：

(1)提取样本中的total RNA，采用逆转录阻碍探针法去除rRNA，同时逆转录获得一端带有P7序列的cDNA；

(2)对多余的随机引物进行消解处理；

(3)对cDNA进行多聚腺苷酸化，在cDNA的3’端加上polyA，采用带有3’突出末端的双链DNA接头，在cDNA的另一端接上P5序列；

(4)文库扩增及回收。

优选的，步骤(1)中使用的逆转录引物的5’端带有P7序列和识别细胞的独立标识DNA序列。

优选的，步骤(3)中双链DNA接头的3’突出末端为一段多聚胸腺嘧啶的单链DNA序列，与cDNA的多聚腺苷酸配对。

优选的，步骤(3)中多聚胸腺嘧啶的数量为10-15个。

优选的，步骤(2)中消解处理使用的酶为T4 DNA聚合酶、Exonuclease I、Exonuclease T的一种或多种。

优选的，步骤(2)中消解处理的温度为37℃，时间为10-60分钟。

优选的，步骤(3)中多聚腺苷酸化和接头连接同时进行，采用的酶混合物包括TdT，还包括T4 DNA连接酶、Taq DNA连接酶或E.coli DNA连接酶的一种或多种。

优选的，步骤(1)中逆转录引物序列为：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT+细胞识别序列+NNNNNNNN；

步骤(3)中的接头序列为：F：/5Phos/分子识别标志+ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT/NH2C6/；

R:AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT+分子识别标志+poly(dT)/NH2C6/，其中poly(dT)的数量为10-15个。

其中细胞识别序列可用于区分细胞来源，分子识别标志用于区分原始的DNA分子拷贝。

优选的，步骤(3)中反应温度为37℃，时间为10-30分钟。

本发明公开的上述的RNA快速建库方法可应用于单细胞转录组测序。

本发明目的在于提供一种高效快速的RNA建库技术，称为(Easy RNAsequencing)。相较于传统的RNA建库方法，Easy-seq具有耗时短、操作简单和损失小等优点，因此可以应用于单细胞转录组测序(scEasy-seq)。相较于已有的scRNA-seq技术，scEasy-seq具有基因检出率高、RNA信息完整和建库产量高等优点，是一种高效灵敏的单细胞转录组测序技术，可以广泛应用于科学研究和疾病诊断等领域。

附图说明

图1Easy-seq和scEasy-seq流程。

图2Easy-seq和scEasy-seq建库原理示意图。

图3Easy-seq与传统RNA-seq在文库产量上对比。

图4Easy-seq与传统RNA-seq的文库大小对比。

图5Easy-seq对不同RNA投入量建库的文库大小。

图6scEasy-seq与其他三种scRNA-seq的原理比较。

图7scEasy-seq与其他三种scRNA-seq的特点比较。

图8scEasy-seq与其他三种scRNA-seq的文库大小分布比较。

图9scEasy-seq与其他三种scRNA-seq的文库产量比较。

图10scEasy-seq与其他三种scRNA-seq的转录组比对率比较。

图11scEasy-seq与其他三种scRNA-seq的rRNA残留率比较。

图12scEasy-seq与其他三种scRNA-seq的基因检出数比较。

图13scEasy-seq与其他三种scRNA-seq的基因区域覆盖均一性比较。

图14scEasy-seq结合微流控进行scRNA-seq流程示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式做进一步说明。

本实施例所使用的探针和引物序列及修饰如表1所示，N为随机碱基，即A、T、C、G中任意一种碱基。

表1探针及引物序列

实施例1：Easy-seq流程的建立

在本实施例中，我们组建了Easy-seq的流程，流程和原理示意图见图1。具体方式如下：

1)rRNA去除、逆转录和随机引物消解：

表2

94℃ 5min，75℃ 1min，55℃ 1min，4℃保存。

表3

25℃ 10min，42℃ 30min，85℃ 5min，4℃保存。加入1μL T4 DNA聚合酶(5U/μL，ThermoFisher)，37℃ 30min，85℃ 10min，立即置于冰上。

2)P5接头连接

P5接头退火：将100μM P5-F与100μM P5-R1溶解于1×Annealing buffer(10mMTris-HCl，50mM NaCl，1mM EDTA，pH 7.9)中，吸取等体积混匀，94℃ 5min，94-15℃ 0.1℃/min，15℃保存。退火完成后将接头稀释成10μM终浓度。

表4

10×P5连接缓冲液：85mM MgCl2，0.26mM NAD+，pH 7.9。

37℃ 60min，95℃ 2min，保存于4℃。

3)文库扩增及回收

表5

98℃ 3min，7cycles(98℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 30s)，72℃ 3min，保存于4℃。

反应结束后，加入45μL Agencourt AMPure XP beads(Beckman，A63881)混匀后，室温静置孵育5min。将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸去上清；加入200μL新鲜配制的80％乙醇静置30s，吸去上清；加入200μL新鲜配制的80％乙醇静置30s，吸干净乙醇。室温静置3min，晾干乙醇，加入20μL无核酸酶水悬浮磁珠。室温静置5min，将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸出上清。

实施例2：不同外切酶消化对Easy-seq文库产量的影响。

在本实施例中，我们验证了3种不同外切酶消化方法对Easy-seq文库产量的影响。具体方式如下：

1)rRNA去除、逆转录和随机引物消解：

表6

94℃ 5min，75℃ 1min，55℃ 1min，4℃保存。

表7

25℃ 10min，42℃ 30min，85℃ 5min，4℃保存。

外切酶条件1：加入1μL T4 DNA聚合酶(5U/μL，ThermoFisher)，37℃ 30min，85℃10min，立即置于冰上。

外切酶条件2：加入0.25μL Exonuclease I(20U/μL，NEB)，37℃ 30min，85℃10min，立即置于冰上。

外切酶条件3：加入1μL Exonuclease T(5U/μL，ThermoFisher)，37℃ 30min，85℃10min，立即置于冰上。

按照实施例1进行P5接头连接和文库扩增及回收。结果如下表所示：

表8三种外切酶消解方式对Easy-seq文库产量的影响

结果如表8所示，三种外切酶的消化都具有良好的文库产量，其中T4 DNA聚合酶消化未参与逆转录的引物，Easy-seq的文库产量最高。

实施例3：不同T4 DNA聚合酶消化时间对Easy-seq文库产量的影响。

在本实施例中，我们验证了不同T4 DNA聚合酶消化时间对Easy-seq文库产量的影响。

具体方式如下：

1)rRNA去除、逆转录和随机引物消解：

表9

94℃ 5min，75℃ 1min，55℃ 1min，4℃保存。

表10

25℃ 10min，42℃ 30min，85℃ 5min，4℃保存。

加入1μL T4 DNA聚合酶(5U/μL，ThermoFisher)，37℃ x min，85℃ 10min，立即置于冰上。(x为10、20、30、40、50、60)

按照实施例1进行P5接头连接和文库扩增及回收。结果如下表所示：

表11不同T4 DNA聚合酶消化时间对Easy-seq文库产量的影响

结果如表11所示，T4 DNA聚合酶的消化时间在10-20min时，Easy-seq的文库产量最高。为保证逆转录引物消解充分，选定T4 DNA聚合酶的消化时间为20min。

实施例4：不同连接酶对Easy-seq文库产量的影响。

在本实施例中，我们验证了不同T4 DNA聚合酶消化时间对Easy-seq文库产量的影响。

具体方式如下：

1)rRNA去除、逆转录和随机引物消解：见实施例3。

2)P5接头连接

P5接头退火：将100μM P5-F分别与100μM P5-R1溶解于1×Annealing buffer(10mM Tris-HCl，50mM NaCl，1mM EDTA，pH 7.9)中，吸取等体积混匀，94℃ 5min，94-15℃0.1℃/min，15℃保存。退火完成后将接头稀释成10μM终浓度。

表12

37℃ 60min，95℃ 2min，保存于4℃。

连接酶1：E.coli DNA ligase(60U/μl，TaKaRa)

连接酶2：T4 DNA ligase(400U/μl，NEB)

连接酶3：Taq DNA ligase(40U/μl，NEB)

按照实施例1进行文库扩增及回收。结果如下表所示：

表13不同DNA连接酶对Easy-seq文库产量的影响

结果如表13所示，使用E.coli DNA ligase时，Easy-seq的文库产量最高。

实施例5：DNA接头寡聚胸腺苷酸长度对Easy-seq文库产量的影响。

在本实施例中，我们验证了DNA接头寡聚胸腺苷酸长度对Easy-seq文库产量的影响。

具体方式如下：

1)rRNA去除、逆转录和随机引物消解：见实施例3。

2)P5接头连接

P5接头退火：将100μM P5-F与100μM P5-R(1-6)溶解于1×Annealing buffer(10mM Tris-HCl，50mM NaCl，1mM EDTA，pH 7.9)中，吸取等体积混匀，94℃ 5min，94-15℃0.1℃/min，15℃保存。退火完成后将接头稀释成10μM终浓度。

表14

37℃ 60min，95℃ 2min，保存于4℃。

按照实施例1进行文库扩增及回收。结果如下表所示：

表15 DNA接头寡聚胸腺苷酸长度对Easy-seq文库产量的影响

结果如表15所示，当DNA接头寡聚胸腺苷酸长度为12nt(P5-R2)时，Easy-seq的文库产量最高。

实施例6：DNA接头连接时间对Easy-seq文库产量的影响。

在本实施例中，我们验证了DNA接头连接时间对Easy-seq文库产量的影响。具体方式如下：

1)rRNA去除、逆转录和随机引物消解：见实施例3。

2)P5接头连接

P5接头退火：将100μM P5-F与100μM P5-R2溶解于1×Annealing buffer(10mMTris-HCl，50mM NaCl，1mM EDTA，pH 7.9)中，吸取等体积混匀，94℃ 5min，94-15℃ 0.1℃/min，15℃保存。退火完成后将接头稀释成10μM终浓度。

表16

37℃ x min，95℃ 2min，保存于4℃。(x为10，15，20，30，40，60)

按照实施例1进行文库扩增及回收。结果如下表所示：

表17 DNA接头连接时间对Easy-seq文库产量的影响

结果如表17所示，当DNA接头连接时间为15min时，Easy-seq的文库产量最高。

实施例7：Easy-seq与传统RNA建立方法的比较

根据实施例1-6，我们组建出最佳的Easy-seq流程。流程和原理示意图见图1和图2，具体流程如下：

1)rRNA去除、逆转录和随机引物消解：

表18

94℃ 5min，75℃ 1min，55℃ 1min，4℃保存。

表19

25℃ 10min，42℃ 30min，85℃ 5min，4℃保存。加入1μL T4 DNA聚合酶(5U/μL，ThermoFisher)，37℃ 20min，85℃ 10min，立即置于冰上。

2)P5接头连接

P5接头退火：将100μM P5-F与100μM P5-R2溶解于1×Annealing buffer(10mMTris-HCl，50mM NaCl，1mM EDTA，pH 7.9)中，吸取等体积混匀，94℃ 5min，94-15℃ 0.1℃/min，15℃保存。退火完成后将接头稀释成10μM终浓度。

表20

10×P5连接缓冲液：85mM MgCl2，0.26mM NAD+，pH 7.9。

37℃ 15min，95℃ 2min，保存于4℃。

3)文库扩增及回收

表21

98℃ 3min，7cycles(98℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 30s)，72℃ 3min，保存于4℃。

反应结束后，加入45μL Agencourt AMPure XP beads(Beckman，A63881)混匀后，室温静置孵育5min。将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸去上清；加入200μL新鲜配制的80％乙醇静置30s，吸去上清；加入200μL新鲜配制的80％乙醇静置30s，吸干净乙醇。室温静置3min，晾干乙醇，加入20μL无核酸酶水悬浮磁珠。室温静置5min，将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸出上清。

在本实施例中，我们将优化好的Easy-seq与传统的RNA建库方法进行了对比。传统RNA建库方法使用

使用Qubit对构建好的文库进行定量，Qsep 100验证文库大小分布。构建好的文库在Illumina NovaSeq 6000平台上进行测序并分析。结果见表22、图3-图4。

表22 1000ng RNA投入量的文库产量

结果如表22和图3、图4所示，相较于传统RNA-seq方法，Easy-seq能够显著提高文库的产量。在比对率和rRNA去除效率上，Easy-seq和传统RNA-seq都能够高效去除rRNA，并具有很高的比对率。在基因检出数上，Easy-seq要比传统RNA-seq略高。这些结果表明，Easy-seq比传统RNA-seq具有更高的建库效率和产量。

实施例8：Easy-seq对不同RNA投入量的建库效果

在本实施例中，我们验证了Easy-seq在HEK293F 0.01ng-1000ng RNA投入量条件下的建库效果，实验流程见实施例1，PCR循环数和文库产量见表23，文库大小分布见图5。

表23

结果如表23和图5所示，Easy-seq可以对投入量为0.01-1000ng的RNA进行转录组建库，且具有较高的文库产量和基因检出率。这说明Easy-seq可以应用于单个细胞RNA起始量(10pg左右)的文库构建。

实施例9：Easy-seq在单细胞转录组建库过程的应用

在本实施例中，我们验证了Easy-seq对单个细胞来源样本的转录组建库效果，流程示意图见图1。具体方式如下：

1)细胞裂解，rRNA去除、逆转录和随机引物消解：

使用流式细胞分离技术分离出单个HEK293F细胞，置于5.5μL细胞裂解液中。

表24

94℃ 5min，75℃ 1min，55℃ 1min，4℃保存。

表25

25℃ 10min，42℃ 30min，85℃ 5min，4℃保存。加入1μL T4 DNA聚合酶(5U/μL，ThermoFisher)，37℃ 30min，85℃ 10min，立即置于冰上。

2)P5接头连接

P5接头退火：将100μM P5-F与100μM P5-R2溶解于1×Annealing buffer(10mMTris-HCl，50mM NaCl，1mM EDTA，pH 7.9)中，吸取等体积混匀，94℃ 5min，94-15℃ 0.1℃/min，15℃保存。退火完成后将接头稀释成10μM终浓度。

表26

10×P5连接缓冲液：85mM MgCl2，0.26mM NAD+，pH 7.9。

37℃ 15min，95℃ 2min，保存于4℃。

3)文库扩增及回收

表27

98℃ 3min，25cycles(98℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 30s)，72℃ 3min，保存于4℃。

反应结束后，加入45μL Agencourt AMPure XP beads(Beckman，A63881)混匀后，室温静置孵育5min。将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸去上清；加入200μL新鲜配制的80％乙醇静置30s，吸去上清；加入200μL新鲜配制的80％乙醇静置30s，吸干净乙醇。室温静置3min，晾干乙醇，加入20μL无核酸酶水悬浮磁珠。室温静置5min，将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸出上清。

Smart-seq使用TaKaRa的

MATQ-seq按照Nature Methods(Sheng et al.,2017)的流程进行操作。

SUPeR-seq按照Genome Biology(Fan X.et al.,2015)的流程进行操作。

使用Qubit对构建好的文库进行定量，Qsep 100验证文库大小分布。构建好的文库在Illumina NovaSeq 6000平台上进行测序并分析。各类单细胞测序技术示意图和特点见图6和图7。结果见表28和图8-13。

表28

如表28和图8-13所示，相较于其他三种单细胞转录组测序技术，scEasy-seq具有文库产量高、比对率高、rRNA残留少、基因检出数高和覆盖均一性好等优点，能够显著单细胞转录组测序文库和数据的质量，简化单细胞转录组测序的操作和降低单细胞转录组测序的成本。

综上，本发明提供一种高效快速的RNA建库技术，称为(Easy RNA sequencing)。相较于传统的RNA建库方法，Easy-seq具有耗时短、操作简单和损失小等优点，因此可以应用于单细胞转录组测序(scEasy-seq，如图14)。相较于已有的scRNA-seq技术，scEasy-seq具有基因检出率高、RNA信息完整和建库产量高等优点，是一种高效灵敏的单细胞转录组测序技术，可以广泛应用于科学研究和疾病诊断等领域。