一种DNA文库构建试剂盒、文库构建方法和应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种DNA文库构建试剂盒、文库构建方法和应用。

背景技术

目前，通常采用建库试剂盒(例如illumina、Roche、NEB等厂商提供的建库试剂盒)进行构建文库，且构建文库的主要流程包括：1.将大片段的DNA打断成为长度200～500bp的DNA片段；2.将片段化的DNA进行末端修复，形成两端的平末端；3.使用聚合酶的末端转移酶活性在DNA片段的3’末端加A碱基；4.使用带有3’末端T碱基的双链Y字型接头与将带有3’A末端的dsDNA杂交后连接；5.将连接上接头的产物进行PCR富集获得可以上机测序的文库。

如CN112708939A公开了一种构建DNA文库的试剂盒及方法，其中试剂盒包括混合酶液、混合缓冲液、连接酶和连接缓冲液，混合酶液包含核酸内切酶、T4 DNA聚合酶、Klenow片段、Taq DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶，混合缓冲液和连接缓冲液包含DTT和PEG 8000，混合酶液和混合缓冲液用于形成第一反应体系，连接酶和连接缓冲液用于形成第二反应体系，测序接头为Y字型接头，所述Y字型接头由P5端接头序列与P7端接头序列退火而形成，所述P5端接头序列的3'端最后两位碱基之间的连接键经硫代修饰，所述P7端接头序列的5'端第一位碱基经磷酸化修饰。

然而，目前市面上常见的接头连接方式是TA连接，双链DNA的四个末端需要同时并且分别与接头进行连接，任何一个末端未连接成功，则该条模板链就不能被扩增成可以测序的文库；按照每个末端的连接效率为90％效率评估，文库模板的连接效率最高仅可达60～70％的效率。

综上所述，提供一种高效的文库构建试剂盒对于基因测序领域具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种DNA文库构建试剂盒、文库构建方法和应用，本申请的特设计接头试剂，对P7接头盒P5接头进行特殊修饰，组合使用，并采用全新接头连接模式，能够有效提高连接效率以及建库效率。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种DNA文库构建试剂盒，所述试剂盒包括P7接头和P5接头，所述P7接头由反向互补的第一链和第二链组成，所述第一链5’端具有修饰基团，所述修饰基团包括磷酸基团、羟基或腺苷酰化修饰基团；所述第二链的3’端经封闭修饰，所述封闭修饰包括双脱氧修饰，所述P5接头由单链组成，P5接头的5’末端修饰有羟基基团，3’末端修饰有羟基基团，且3’末端两个碱基之间包含至少一个硫代修饰。

本发明中，对P7接头(P7 Truncated Adapter)和P5接头(P5 Truncated Adapter)进行特殊修饰，并组合使用，能够使其实现全新的连接模式，从而显著提高连接效率，进而提高建库效率。

优选地，所述P7接头的第一链的核酸序列包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的序列。

优选地，所述P7接头的第二链的dT碱基全部替换成为dU碱基。

优选地，所述P7接头的第二链的序列由核糖核酸组成。

优选地，所述P7接头的第二链的核酸序列包括SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQID NO.11所示的序列。

优选地，所述P5接头的核酸序列包括SEQ ID NO.10所示的序列。

SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.11序列如表1所示，其中，5p表示5’末端包含一个磷酸基团，ddC表示2’,3’-二脱氧胞苷(ddC)，-NH

表1

优选地，所述P7接头由两条反向互补的链组成，结构示意图如图2A所示，第一条链5’末端带有一个磷酸基团修饰，3’末端经封闭修饰，所述封闭修饰包括C6氨基修饰、C12氨基修饰、双脱氧修饰或spacer修饰；第二条链与第一条链不完全反向互补，其3’末端具有双脱氧修饰，中间的碱基T碱基替换碱基U。

优选地，所述的P7接头由两条反向互补的链组成，结构示意图如图2B所示，第一条链5’末端为羟基基团修饰，3’末端经封闭修饰，所述封闭修饰包括C6氨基修饰、C12氨基修饰、双脱氧修饰或spacer修饰；第二条链与第一条链不完全反向互补，3’末端经羟基基团修饰，中间的碱基T碱基替换碱基U。

优选地，所述的P7接头由两条反向互补的链组成，结构示意图如图2C所示，第一条链5’末端带有一个磷酸基团修饰，3’末端经封闭修饰，所述封闭修饰包括C6氨基修饰、C12氨基修饰、双脱氧修饰或spacer修饰；第二条链与第一条链不完全反向互补，序列由核糖核酸组成，其3’末端具有双脱氧修饰；

优选地，所述的P7接头由两条反向互补的链组成，结构示意图如图2D所示，第一条链的5’末端含有腺苷酰化修饰基团，3’末端经封闭修饰，所述封闭修饰包括C6氨基修饰、C12氨基修饰、双脱氧修饰或spacer修饰；可选的，第二条链选用核糖核酸碱基组成的RNA链；可选的，第二条链为DNA链，且是3’末端具有封闭修饰，中间的dT碱基全部替换成为dU碱基，5’末端羟基修饰，3’末端采用双脱氧修饰。

优选地，所述P7接头的第一条链如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示，第二链如SEQ ID NO.8所示；或者第一条链如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ IDNO.3所示，第二链如SEQ ID NO.9所示；或者，第一链如SEQ ID NO.4所示，第二链如SEQ IDNO.11所示；或者，第一链如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示所示，第二链如SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示。

优选地，所述试剂盒还包括酶组合物和/或缓冲液。

优选地，所述酶组合物包括DNA打断酶、末端修复酶、PCR扩增酶或连接酶中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述缓冲液包括末端修复缓冲液和/或连接缓冲液。

本发明中，末端修复试剂不作特别限定，可选用市售商业化试剂，如End prepBuffer(ABclonal cat.RM20207)和Endprep Enzymes(ABclonal，cat.RM20208)，DNA打断酶可选用DNA Frag Reaction Buffer(ABclonal cat.RM20671)和DNA Frag Enzyme Mix(ABclonal，cat.RM20672)。

优选地，所述连接酶包括T4 DNA连接酶、T4 DNA连接酶突变体或T7 DNA连接酶。

第二方面，本发明提供一种DNA文库构建方法，所述方法包括：

采用第一方面所述的DNA文库构建试剂盒进行文库构建。

本发明中，基于构建的DNA文库构建试剂盒设计一种DNA文库构建方法，所述方法采用全新接头连接模式，如图1A～图1F所示，将接头分成两步进行连接，显著提高连接效率，进而提高文库构建效率。

优选地，所述DNA文库构建方法包括以下步骤：

(1)对基因组DNA进行处理，得到片段化基因组DNA，并对片段化基因组DNA进行DNA末端修复，纯化产物，得到具有特定末端结构的片段化基因组DNA；

(2)使用DNA连接酶将P7接头连接至具有特定末端结构的片段化基因组DNA的3’端；

使用酶将P5接头连接至具有特定末端结构的片段化基因组DNA的5’端；

(3)纯化连接产物，并对连接产物进行PCR扩增，得到所述DNA文库。

优选地，所述纯化包括利用磁珠进行纯化。

优选地，所述P5接头的连接所使用的酶包括所述P5接头的连接所使用的酶包括RNase H酶、UDG酶、Endo Ⅷ酶、taq聚合酶、A家族高保真聚合酶、B家族聚合酶、taq DNA连接酶或E.coli DNA连接酶中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述DNA文库构建方法包括以下步骤：

(1)对基因组DNA进行处理，得到片段化基因组DNA，并对片段化基因组DNA进行DNA末端修复，利用磁珠纯化产物，得到具有特定末端结构的片段化基因组DNA；

(2)使用DNA连接酶将P7接头连接至具有特定末端结构的片段化基因组DNA的3’端；

使用酶将P5接头连接至具有特定末端结构的片段化基因组DNA的5’端；

(3)利用磁珠纯化连接产物，并对连接产物进行PCR扩增，利用磁珠纯化扩增产物，得到所述DNA文库。

第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的DNA文库构建试剂盒在构建DNA文库中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明中，对P7接头(P7 Truncated Adapter)和P5接头(P5 TruncatedAdapter)进行设计及特殊修饰，并组合使用，能够使其实现全新的连接模式，从而显著提高连接效率及试剂盒的灵敏性，进而提高建库效率；

(2)本发明中，基于构建的DNA文库构建试剂盒设计一种DNA文库构建方法，所述方法采用全新接头连接模式，将接头分成两步进行连接，显著提高连接效率，进而提高文库构建效率。

附图说明

图1A为采用TA连接分步连接的接头连接方式图，先在DNA的3’末端连接P7接头，然后通过RNase H或者UDG酶和Endo VIII酶消化P7第二条链，然后通过退火作用使P5接头退火，在DNA的5’末端连接P5接头；

图1B为基于平末端的分步连接的接头连接方式图，先在DNA的3’末端连接P7接头，然后通过RNase H或者UDG酶和Endo VIII酶消化P7第二条链，然后通过退火作用使P5接头退火，在DNA的5’末端连接P5接头；

图1C为基于DNA 5’羟基平末端的分步连接的接头连接方式图，先在DNA的3’末端连接P7接头，然后通过RNase H或者UDG酶和Endo VIII酶消化P7第二条链，并且使用外切酶将5’羟基末端消化，露出磷酸末端，然后通过退火作用退火使P5接头退火，在DNA的5’末端连接P5接头；

图1D为基TA连接的分步连接的接头连接方式图，先在DNA的5’末端连接P7接头，然后通过RNase H或者UDG酶和Endo VIII酶消化P7第二条链，然后通过退火作用使P5接头退火，在DNA的3’末端连接P5接头；

图1E为基于TA连接的分步连接的接头连接方式图，P7接头5’末端采用腺苷酰化修饰，先在DNA的3’末端快速高效连接P7接头，然后通过RNase H或者UDG酶和Endo VIII酶消化P7第二条链，然后通过退火作用使P5接头退火，在DNA的5’末端连接P5接头；

图1F为基于DNA平末端连接的分步连接的接头连接方式图，P7接头5’末端采用腺苷酰化修饰，先在DNA的3’末端快速高效连接P7接头，然后通过RNase H或者UDG酶和EndoVIII酶消化P7第二条链，然后通过退火作用使P5接头退火，在DNA的5’末端连接P5接头；

图2A为P7 Truncated Adapter结构示意图，P7接头为双链结构，第一条链的5’末端磷酸修饰，3’末端氨基修饰；第二条链的3’末端为双脱氧T，且第二条链中的dT碱基替换为dU碱基；

图2B为P7 Truncated Adapter结构示意图，P7接头为双链结构，第一条链的5’末端羟基修饰，3’末端氨基修饰；第二条链的3’末端羟基，且第二条链中的dT碱基替换为dU碱基；

图2C为P7 Truncated Adapter结构示意图，P7接头为双链结构，第一条链的5’末端磷酸修饰，3’末端氨基修饰；第二条链的3’末端双脱氧碱基T，且第二条链中的碱基为核糖核酸碱基；

图2D为P7 Truncated Adapter结构示意图，P7接头为双链结构，第一条链的5’末端腺苷酰化修饰，3’末端氨基修饰；第二条链的3’末端为双脱氧T，且第二条链中的dT碱基替换为dU碱基；

图3A为300bp PCR片段的Agilent 2100峰形鉴定结果图；

图3B为300bp PCR片段连接P7接头产物的Agilent 2100峰形鉴定结果图；

图4A为1ng片段化(痕量DNA)DNA经过本发明建库方法进行文库制备结果图；

图4B为100ng片段化DNA经过本发明建库方法进行文库制备结果图；

图5为1ng intact gDNA经过本发明建库方法进行文库制备结果图；

图6为100ng intact gDNA经过本发明建库方法进行文库制备结果图；

图7为传统的基于TA连接的一步法连接P7接头与P5接头的连接效率评估结果图，图中上中下3个峰形图结果为三个接头连接测试的实验重复。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1

本实施例分析本发明P7接头连接效率。

(1)配制末端修复体系

本实施案例使用人血液DNA(健康人混合全血)为模板，使用引物进行扩增富集得到300bp长度的PCR片段，按照下表2配制反应体系，吹打混匀，瞬时离心至管底；

表2

(2)将反应体系至于PCR仪器中进行末端修复，反应条件如表3所示；

表3

(3)使用2.2×比例的cleanup磁珠进行纯化；

(4)按照表4配置反应体系，吹打混匀，瞬时离心至管底；

表4

(5)将反应体系至于PCR仪器中进行P7 Truncated Adapter的连接；

使用2.2×比例的cleanup磁珠进行纯化，然后将连接产物进行Qsep 100峰形鉴定，结构如图3A和3B所示，图3A为300bp PCR片段的Agilent 2100峰形鉴定结果图；，图3B为300bp PCR片段连接P7接头产物的Agilent 2100峰形鉴定结果图，由图3B和3A可知PCR片段已经全部连接上P7接头，连接效率在90％以上。

实施例2

本实施例以人血液DNA(human blood DNA)为样本进行建库。

(1)将人血液gDNA进行covaris打断，打断至250bp片段左右，然后按照表5配制反应体系，吹打混匀，瞬时离心至管底；

表5

(2)将反应体系至于PCR仪器中进行末端修复，反应条件如表3所示；

(3)使用2.2×比例的cleanup磁珠进行纯化；

(4)按照表6配制反应体系，吹打混匀，瞬时离心至管底；

表6

(5)将反应体系至于PCR仪器中进行P7 Truncated Adapter的连接，反应条件如表7所示；

表7

(6)按照表8进行P5Truncated Adapter接头连接体系的配置，吹打混匀，瞬时离心至管底；

表8

(7)将反应体系置于PCR仪器中进行P5接头的连接，反应体系如表9所示；

表9

(8)使用2.2×比例的cleanup磁珠进行纯化；

(9)按照表10进行PCR扩增体系的配置，吹打混匀，瞬时离心至管底；

表10

(10)将反应体系置于PCR仪器中进行PCR反应，反应条件如表11所示；

表11

(11)使用1.0×比例的cleanup磁珠进行纯化，获得可上机测序的文库；

(12)将文库进行Qubit定量，如表12所示；

表12

(13)将文库稀释至2ng/μL，进行Qsep 100进行峰形鉴定，如图4A和图4B所示，图4A为1ng DNA样本所制备的文库峰形图，图4B为100ng DNA样本所制备的文库峰形图，文库大小合适，符合Illumina测序仪上机标准。

实施例3

本实施例以人血液DNA(健康人混合全血)为样本进行建库。

(1)将人血液DNA进行酶切打断，按照表13配置反应体系，吹打混匀，瞬时离心至管底；

表13

(2)将反应体系至于PCR仪器中进行末端修复，反应条件如表14所示：

表14

(3)反应结束后，立即使用2.2×比例的cleanup磁珠进行纯化；

(4)按照表15配置反应体系，吹打混匀，瞬时离心至管底；

表15

(5)将反应体系置于PCR仪器中进行P7 Truncated Adapter的连接，反应条件如表7所示；

(6)按照表16进行P5 Adapter接头连接体系的配置，吹打混匀，瞬时离心至管底；

表16

(7)将反应体系置于PCR仪器中进行P5接头的连接，反应体系如表9所示：

(8)使用2.2×比例的cleanup磁珠进行纯化；

(9)按照表17进行PCR扩增体系的配置，吹打混匀，瞬时离心至管底；

表17

(10)将反应体系置于PCR仪器中进行PCR反应，反应条件如表11所示；

(11)使用1.2×比例的cleanup磁珠进行纯化，获得可上机测序的文库；

(12)将文库进行Qubit定量，如下表18所示；

表18

(13)将文库稀释至2ng/μL，进行Qsep 100进行峰形鉴定，如图5示和图6，图5为1ngDNA样本所制备的文库峰形图，图6为100ng DNA样本所制备的文库峰形图；文库大小合适，符合Illumina测序仪上机标准。

对比例

本对比例以人血液DNA(健康人混合全血)为样本，以传统建库方法进行建库。传统的建库方式是基于TA方式进行dsDNA两端接头的连接的方式，首先进行末端修复，使DNA5’末端磷酸修饰，3’末端含有一个dA尾；然后在连接酶的催化下，DNA两端同时连接上一个Y字型接头，此种连接产物中包含DNA片段、连接上一个接头的片段、连接上两个接头的产物三种连接产物，市面快速建库的接头连接效率一般在60％左右，如图7所示。本发明进步之处在于优化接头的连接方式，通过分步连接的方式，即采用分步的方式将P7接头与P5接头连接至DNA的两端，保证每一步的连接效率在90％以上，从而使接头的连接效率达到80％以上，与传统的60％的连接效率相比大大提高接头的连接效率。

综上所述，本发明对P7接头(P7 Truncated Adapter)和P5接头(P5 TruncatedAdapter)进行设计及特殊修饰，并组合使用，能够使其实现全新的连接模式，从而显著提高连接效率及试剂盒的灵敏性，进而提高建库效率，基于构建的DNA文库构建试剂盒设计一种DNA文库构建方法，所述方法采用全新接头连接模式，将接头分成两步进行连接，显著提高连接效率，进而提高文库构建效率。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 上海英基生物科技有限公司

<120> 一种DNA文库构建试剂盒、文库构建方法和应用

<130> 2022-05-03

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agatcggaag agcacacgtc tgaactccag t 31

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tc 32

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tc 32

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tc 32

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agatcggaag agcacacgtc tgaactccag t 31

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tc 32

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tc 32

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agacgugugc ucutccgauc 20

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agacg tgtgc tcttccgatc 40

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

actctttccc tacacgacgc tcttccgatc t 31

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

agacgugugc ucutccgauc t 21