一种衰老细胞的构建方法及评价抗衰老功效的方法

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及到一种衰老细胞的构建方法及评价抗衰老功效的方法。

背景技术

每个人从出生起就经历衰老，皮肤衰老是机体衰老最明显和最直观的表现，可以作为预期寿命和健康的预测指标。与人体其他器官不同，皮肤衰老不仅不可避免地受到内在因素的影响，而且还受到各种外在环境因素的影响，加速衰老，尤其是紫外线辐射(UVR)。其中，皮肤受到紫外线辐射、吸烟、风吹、日晒及有害化学物质等环境因素导致的皮肤衰老称为外源性衰老，其中由于日光中紫外线辐射是环境因素中导致皮肤衰老的主要因素，所以外源性衰老又称为光老化。内源性衰老和外源性衰老均可导致皮肤结构完整性降低、功能丧失和外观的累积变化，如皱纹增多、松弛、弹力纤维增生、毛细血管扩张和皮肤色素沉着异常。目前，虽然这两个皮肤衰老过程不仅均是高度复杂和尚未完全理解的，而且均是缺乏通用的生物标志物来明确检测和评估的，但是目前研究均认为皱纹是皮肤衰老的外在表现，内部细胞衰老才是根源。

细胞衰老是生理衰老过程的先决条件和最终驱动力，在其大部分进展过程中基本上是看不见的。细胞衰老是一种由压力信号刺激产生，存在于特定生理过程的细胞状态，将生理和应激信号与组织内稳态和组织健康联系起来。可由各种不同的细胞应激出发，如DNA损伤、癌基因激活、氧化应激或外源性毒物暴露等。细胞衰老不等同于细胞死亡，衰老的细胞在一段时间内仍保持代谢活性，也会出现一些明显的变化，具有典型的细胞周期停滞、衰老相关分泌表型、大分子损伤及代谢紊乱四个特征。

目前对于皮肤衰老使用的评价方法主要有临床评价、重组三维真皮表皮皮肤模型评价、常规体外细胞评价。

临床评价的优点是最接近于真实效果，缺点如下：1)需要专有的临床仪器评价设备如VISIA皮肤检测仪、皮肤显微镜及活性皮肤表面分析系统Visioscan VC98、皮肤超声检测仪、皮肤弹性检测仪、Antera 3D皮肤成像测量仪等设备；这些仪器设备一般价格昂贵且需要专有人员操作；2)需要的检测人员至少有三名，其中一位为临床医生；3)需要有效受试者人数至少30例，受试者难招募，而且不同的化妆品针对的衰老表现可能不同；4)临床评价实验周期比较长，一般从确定进行到最终结果获得需要6个月左右；5)不能通量进行，一般一次只能测试一个样品，不适合筛选或化妆品原料测试；6)检测费用比昂贵，一般一个样品的费用可能在10万元人民币以上；7)临床评价误差很大，样品效果极强时才能获得比较明确结果；8)临床评价安全风险大。

重组三维真皮表皮皮肤模型评价优点是与临床效果比较接近，但其缺点如下：1)检测费用比较高，一般一个样品的费用至少为3万元人民币；2)实验周期长，一般实验室无重组三维真表皮皮肤模型，需要购买，一般从确定进行到数据结果获得至少3个月；3)不能用于高通量筛选；4)衰老时期不明确，常将重组三维真表皮皮肤模型最旺盛时期用于评价衰老产品的抗衰效果；且不能将产品抗衰效果细分；5)由于目前商品化重组真表皮皮肤模型稳定性的较少，因此试错成本比较高。

常规体外细胞评价方法优点如下：1)可高通量筛选；2)检测周期短，一般从确定进行到数据结果获得需要7个工作，熟练操作可能需要5个工作日；3)需要检测人员少：一般一个样品需要一个专业检测人员即可；4)检测费用低；一般10个样品的检测费用约1万元人民币；5)误差最小；6)检测结果稳定，同样的处理方式，不同的人员检测，结果稳定。但目前的体外细胞评价方法仍存在下述缺点：1)与临床评价结果相关度相对低；2)衰老时期不明确，可能将年轻细胞用于评价衰老产品的抗衰老；3)无明确细分自然老化和光衰老体外细胞评价方法，同样一个样品，采用不同处理方式评价效果可能不一样。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种衰老细胞的构建方法及评价抗衰老功效的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供了一种外源性衰老细胞的构建方法，包括以下步骤：

A1、将原代细胞接种于完全培养基中培养一周，期间对细胞进行2次换液，且每次换液过程中对细胞进行紫外光照射，得UVA-P1代细胞；

A2、将UVA-P1代细胞代替步骤A1的原代细胞进行相同的处理，得UVA-P2代细胞；

A3、重复步骤A2，得到相应的UVA-P3～UVA-Pn代细胞；其中，UVA-Pn中的n为4～20的正整数；

A4、将前述步骤获得的UVA-P1～UVA-Pn代细胞进行COL I含量、MMP-1含量、细胞数量检测，并根据检测结果将UVA-P3～UVA-P4代细胞作为早期衰老细胞、UVA-P5～UVA-P7代细胞作为中期衰老细胞、≧UVA-P8代细胞作为晚期衰老细胞。

优选地，步骤A1中，所述原代细胞选自人原代成纤维细胞、人原代角质形成细胞、人原代黑色素细胞中的任一种；

所述原代细胞的接种密度为1.2×10

所述培养的条件为在37℃、5％CO

优选地，步骤A1中，所述换液的具体步骤为：弃旧培养基，使用PBS缓冲液清洗一遍，然后再加入PBS缓冲液，使用UVA辐照仪紧贴细胞培养皿进行照射10min，辐照剂量为14.4J；照射结束后，弃PBS缓冲液，加入新鲜完全培养基，继续培养；

所述换液在培养的第三天和第五天进行。

优选地，步骤A4中，所述早期衰老细胞、中期衰老细胞、晚期衰老细胞的COL I含量、MMP-1含量、细胞数量如下表所示：

第二方面，本发明提供了一种评价皮肤抗衰老功效的方法，包括以下步骤：

S1、以前述方法制备的UVA-P3～UVA-P4代细胞评价25～29岁的临床早期衰老人群、UVA-P5～UVA-P7代细胞评价30～45岁的临床中期衰老人群、≧UVA-P8代细胞评价46岁及以上的临床晚期衰老人群；

S2、将选取的细胞接种于细胞培养板上培养24h；

S3、弃旧培养基，向细胞培养板中加入含或不含待测样品的新鲜完全培养基，继续培养24-96h；

S4、对步骤S3培养后的细胞进行检测，以不含待测样品培养的细胞作为对照组，评价待测样品的抗衰老功效。

优选地，步骤S2中，所述细胞的接种密度为5×10

所述细胞培养板为6孔板、12孔板、24孔板、48孔板、96孔板中的任一种；

步骤S2和S3中，所述培养条件均为37℃、5％CO

优选地，步骤S4中，当培养的细胞为UVA-P3～UVA-P4代细胞时，检测指标为细胞周期、DNA量、ATP；

当培养的细胞为UVA-P5～UVA-P7代细胞时，检测指标为COL I、MMP-1/-3、ATP、SA-β-gel、Hes-1、8-OHdG、GLS1、γH2AX；

当培养的细胞为≧UVA-P8代细胞时，检测指标为细胞数量、COL I、γH2AX、MMP-3、Hes-1、8-OHdG。

在本发明前期的实验中发现，基于不同衰老时期细胞采用不同的特定检测指标，可使检测结果更准确。

第三方面，本发明提供了一种评价待测物对不同时期衰老细胞的抗衰老功效的方法，包括以下步骤：

a.构建内源性衰老细胞

a1、将原代细胞接种于完全培养基中培养一周，期间对细胞进行2次换液，得P1代细胞；

a2、将P1代细胞代替步骤a1的原代细胞进行相同的处理，得P2代细胞；

a3、重复步骤a2，得到相应的P3～Pn代细胞；其中，n为11～20的正整数；

a4、将前述步骤获得的P1～P n代细胞进行COL I含量、MMP-1、细胞数量检测，并根据检测结果将P3～P4代细胞作为生长期细胞、P5～P7代细胞作为早期衰老细胞、P8～P10代细胞作为中期衰老细胞、≧P11代细胞作为晚期衰老细胞；

b.将步骤a制备的P3～P4代细胞、P5～P7代细胞、P8～P10代细胞、≧P11代细胞和权利要求1制备的UVA-P3～UVA-P4代细胞、UVA-P5～UVA-P7代细胞、≧UVA-P8代细胞分别接种于细胞培养板上培养24h；

c.弃旧培养基，向细胞培养板中加入含或不含待测样品的新鲜完全培养基，继续培养24-96h；

d.对步骤c培养后的细胞进行检测，以不含待测样品培养的细胞作为对照组，评价待测样品对各细胞的抗衰老功效。

优选地，步骤a1中，所述原代细胞的接种密度为1.2×10

所述换液的具体步骤为：弃旧培养基，使用PBS缓冲液清洗一遍，然后加入新鲜完全培养基，继续培养；所述换液在培养的第三天和第五天进行；

步骤a4中，所述早期衰老细胞、中期衰老细胞、晚期衰老细胞的COL I含量、MMP-1含量、细胞数量如下表所示：

步骤b中，所述细胞的接种密度为5×10

所述细胞培养板为6孔板、12孔板、24孔板、48孔板、96孔板中的任一种；

步骤b和c中，所述培养条件均为37℃、5％CO

优选地，步骤d中，当培养的细胞为UVA-P3～UVA-P4代细胞时，检测指标为细胞周期、DNA量、ATP；

当培养的细胞为UVA-P5～UVA-P7代细胞时，检测指标为COL I、MMP-1/-3、ATP、SA-β-gel、Hes-1、8-OHdG、GLS1、γH2AX；

当培养的细胞为≧UVA-P8代细胞时，检测指标为细胞数量、COL I、γH2AX、MMP-3、Hes-1、8-OHdG；

当培养的细胞为P3～P4代细胞时，检测指标为细胞周期、DNA量、ATP；

当培养的细胞为P5～P7代细胞时，检测指标为细胞周期、DNA量、ATP；

当培养的细胞为P8～P10代细胞时，检测指标为COL I、MMP-1/-3、ATP、SA-β-gelHes-1、8-OHdG、GLS1、γH2AX；

当培养的细胞为≧P11代细胞时，检测指标为细胞数量、COL I、γH2AX、MMP-3、Hes-1、8-OHdG。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1.本发明通过采用传代和紫外线(UVA)直接照射同时发生的方式模拟外源性衰老(光老化)细胞，并通过对各衰老细胞进行指标检测，将构建的衰老细胞分为早期衰老细胞、中期衰老细胞、晚期衰老细胞，并通过各时期衰老细胞与不同年龄人群所处的皮肤衰老时期进行关联，从而建立衰老细胞代数与人群年龄的对应关系，从而将构建的不同时期衰老细胞作为临床衰老的体外替代细胞来进行相应的抗衰老评价。由此为化妆品等活性成分对早、中、晚期皱纹等衰老功效的评价提供了客观依据，为皮肤衰老的测试提供了一种创新的、精准的、可替代临床的细胞学方法。

2.采用本发明构建的衰老细胞模型进行抗衰老功效评价的结果与临床评价结果的关联性强、假阳性结果少，且相比临床评价的方法具有测试成本较低、可重复性高、测试周期短、筛选通量高的优点。

3.本发明进一步通过构建的不同时期的外源性(光老化)衰老细胞和内源性(自然衰老)衰老细胞，可精准评价待测物对不同时期内源性或外源性衰老细胞的作用，为抗衰老功效产品的精准研发提供了实验基础。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为实施例1和2构建的不同代数内源性衰老细胞和外源性衰老细胞的检测结果；其中，图1A为COL I含量结果；图1B为MMP-1含量结果；图1C为细胞数量结果；其中的Aging组代表内源性衰老细胞，UVA-Aging组代表外源性衰老细胞；

图2为实施例3中不同时期衰老细胞的促增殖效果；

图3为实施例4中采用皮肤超声仪检测不同年龄段人群的真皮层高回声区变化结果；

图4为实施例4中的不同时期衰老细胞模型的线粒体膜完整性评价结果；

图5为实施例4中的不同时期衰老细胞模型的SA-β-SA评价结果；

图6为实施例4中的采用3％浓度的Biomenta样品在临床中期皮肤衰老模型的真皮层高回声区变化结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明中的词语“优选的”、“优选地”、“更优选的”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。

应当理解，除了在任何操作实例中，或者以其他方式指出的情况下，表示例如说明书和权利要求中使用的成分的量的所有数字应被理解为在所有情况下被术语“约”修饰。因此，除非相反指出，否则在以下说明书和所附权利要求中阐述的数值参数是根据本发明所要获得的期望性能而变化的近似值。至少并不是试图将等同原则的适用限制在权利要求的范围内，每个数值参数至少应该根据报告的有效数字的个数并通过应用普通舍入技术来解释。

尽管阐述本发明的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是具体实例中列出的数值尽可能精确地报告。然而，任何数值固有地包含由其各自测试测量中发现的标准偏差必然产生的某些误差。

成纤维细胞是真皮中最丰富的细胞类型，直接或间接通过与其他细胞的相互作用导致皮肤老化，也是体外研究皮肤衰老经常使用的细胞。人成纤维细胞是功能活动旺盛的细胞，细胞和细胞核较大，轮廓清楚，核大而明显，细胞质弱嗜碱性，具有明显的蛋白质合成和分泌活动。本发明通过对人原代成纤维细胞在自然衰老和光衰老在细胞周期、衰老相关分泌表型、大分子损伤、代谢紊乱等方面的共同点研究来建立一种体外人原代成纤维细胞衰老模型。同时，通过一些细胞衰老的指标和人临床衰老指标进行对比建立体外人原代成纤维细胞衰老与临床衰老的关联。通过该方法提高体外评价的结果更接近于临床评价结果，为化妆品等活性成分对衰老的评价提供客观的依据。

成纤维细胞衰老与皮肤衰老的发生发展密切相关。成纤维细胞是构成皮肤真皮层最主要的细胞，其功能障碍和大多数皮肤表型变化，如皱纹形成密切相关，因此，真皮成纤维细胞成为细胞水平研究内源性和外源性衰老的首选模型。以下实施例中使用的人原代成纤维细胞是由本实验室从人包皮组织分离获得，供体信息：男，20岁。细胞鉴定依据成纤维细胞胶原蛋白/MMP-1/MMP-3等功能变现以及转录组基因比对。细胞编号G2018001FF。

以下实施例采用的成纤维细胞完全培养基为：包含10％新生牛血清、1％的青霉素、链霉素和两性霉素B三种的混合溶液、余量为DMEM基础培养基。

实施例1

本实施例提供了一种内源性衰老(自然衰老)细胞模型的构建方法，具体步骤如下：

1)取编号为G2018001FF分离的人原代成纤维细胞按接种密度为7.5×10

2)第一天，按6×10

3)第三天和第五天，对P1代细胞进行换液，具体操作为：弃旧培养基，使用PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)洗一遍，加入新鲜的成纤维细胞完全培养基，放置37℃、5％CO

4)第八天，将P1代细胞进行细胞消化和计数，得到P1代细胞及其细胞数量；所述细胞消化、计数具体操作为：弃旧培养基，使用PBS缓冲液洗两遍，每皿加入2mL0.05％胰酶消化液，37℃消化3min，弃胰酶消化液，再每皿加入5mL完全培养基终止消化，轻轻吹打细胞，得到细胞悬液，直接使用细胞计数仪测量8次，取平均值的细胞数量(见表1)。

5)第八天，将前述传代培养后得到的P1代细胞进行步骤2)-4)的操作，得到P2代细胞，并以此重复，得到P3-P14代细胞。

6)将P1-P14代细胞按2×10

7)根据步骤6)的各检测结果，将前述P1-P14代细胞按照表1所示的范围进行划分为生长期细胞(P3-P4代细胞)早期衰老细胞(P5-P7代细胞)、中期衰老细胞(P8-P10代细胞)、晚期衰老细胞(P10-P14代细胞)。

表1

实施例2

本实施例提供了一种外源性衰老(光衰老)细胞模型的构建方法，具体步骤如下：

1)取编号为G2018001FF人原代成纤维细胞(以下称为P0代细胞)；

2)第一天，按6×10

3)第三天和第五天，对UVA-P1代细胞进行换液，具体操作为：弃旧培养基，使用PBS缓冲液洗一遍，每皿加入5mL PBS缓冲液，使用UVA辐照仪器中央部位紧贴细胞培养皿，照射10min(辐照剂量为14.4J)。然后弃PBS缓冲液，加入新鲜的成纤维细胞完全培养基，放置37℃、5％CO

4)第八天，将UVA-P1代细胞进行细胞消化和计数，得到UVA-P1代细胞及其细胞数量；所述细胞消化、计数具体操作为：弃旧培养基，使用PBS缓冲液洗两遍，每皿加入2mL0.05％胰酶消化液，37℃消化3min，弃胰酶消化液，再每皿加入5mL完全培养基终止消化，轻轻吹打细胞，得到细胞悬液，直接使用细胞计数仪测量8次，取平均值的细胞数量(见表2)。

5)第八天，将得到的UVA-P1代细胞进行步骤2)-4)的培养和传代，得到UVA-P2代细胞，并以此重复，得到UVA-P3～UVA-P14代细胞。

6)将UVA-P1～UVA-P14代细胞按2×10

7)根据步骤6)的各检测结果，将前述UVA-P1～UVA-P14代细胞按照表2所示的范围进行划分为早期衰老细胞(UVA-P3～UVA-P4代细胞)、中期衰老细胞(UVA-P5～UVA-P7代细胞)、晚期衰老细胞(UVA-P8～UVA-P14)。

表2

实施例3

本实施例提供了一种评价待测物对不同时期衰老细胞的抗衰老功效的方法，测试样品为VC,包括以下步骤：

1)取实施例1制备的P4代细胞(生长期细胞)、P7代细胞(早期衰老细胞)、P9代细胞(中期衰老细胞)、P12代细胞(晚期衰老细胞)、实施例2制备的UVA-P4代细胞(早期衰老细胞)、UVA-P7代细胞(中期衰老细胞)、UVA-P9代细胞(晚期衰老细胞)，按2×10

2)步骤1)的培养结束后，弃旧培养液，向培养板中加入不含测试样品的新鲜检测用培养基作为对照组，加入含有测试样品(10μg/mL浓度的VC)的新鲜检测用培养基作为实验组，于37℃、5％CO2培养箱中继续培养48h。所述检测用培养基包含1％新生牛血清、1％青霉素/链霉素/两性霉素B混合溶液、余量为DMEM基础培养基。

3)步骤2)的培养结束后，对各时期衰老细胞进出相应指标的检测，具体各细胞检测指标如表3所示。使用收集的上清，可采用COL I、MMP-1/-3Elisa试剂盒，按照Elisa试剂盒标准操作流程完成检测，接种于96孔板中的细胞可按照ATP试剂盒标准操作流程进行ATP检测，可使用特异性MitoBright LT荧光探针按照该试剂盒标准操作流程进行线粒体膜完整性检测，可按照Hoechest33342试剂盒标准流程进行DNA量检测，可按照免疫荧光标准操作流程进行METTL3、GLS1、8-OHdG、γH2AX、Hes-1检测，可按按照SA-β-gel试剂盒标准流程进行SA-β-gel检测；接种于60mm细胞培养皿中的细胞可按照流式细胞术检测细胞周期标准操作流程进行细胞周期检测。

表3

检测结果显示，对于内源性衰老(自然衰老)，VC对于生长期的细胞有较明显的促增殖作用，而对于早期衰老细胞的促增殖效果较差，对于中期衰老细胞和晚期衰老细胞基本无促增殖效果。对于外源性衰老(光衰老)，VC对于早期衰老细胞有较明显的促增殖作用，而对于中期衰老细胞的促增殖效果较差，对于晚期衰老细胞无促增殖效果。图2为P4代细胞、P7代细胞、UVA-P4代细胞和UVA-P7代细胞加或不加VC的ATP检测结果。

实施例4

本实施例提供了一种评价待测物对不同时期衰老细胞的抗衰老功效的方法，测试样品为Biomenta(上海珈凯生物科技有限公司生产，为采用专利文献CN114292773A中方法获得的青春双歧杆菌菌株的溶胞产物)，包括以下步骤：

1)采用实施例1制备的P7代细胞(早期衰老细胞)和P9代细胞(中期衰老细胞)、实施例2制备的UVA-P4代细胞(早期衰老细胞)和UVA-P7代细胞(中期衰老细胞)，按2×10

2)24h后，弃旧培养基，向培养板中加入含或不含有Biomenta的新鲜检测用培养基，于37℃、5％CO

3)将Biomenta进出抗衰临床效果的检测，具体操作如下：

3.1试验方法经伦理委员会审批，志愿者签署知情同意书

3.2志愿者年龄范围18岁～65岁

3.3通过皮肤超声仪收集志愿者的皮肤数据，并根据检测不同年龄人群的真皮层高回声区(胶原)密度变化情况(如图3所示)，将临床皮肤划分为早期衰老、中期衰老、晚期衰老，并与细胞衰老的早期、中期、晚期细胞代数建立一一对应关系，如表3所示。

表3

3.4以25～55岁的志愿者为测试对象，按照临床评测标准流程，使用皮肤超声仪(为丹麦DermaLab Combo皮肤超声检测仪)对志愿者涂抹3％浓度的Biomenta样品前(O d)和连续涂抹3％浓度的Biomenta样品56天(56d)后进行真皮层高回声区密度(胶原)检测。结果如图6所示，3％浓度的Biomenta对中期衰老皮肤(30-45岁的志愿者)具有最明显的缓解作用。与步骤2)的中期外源性衰老(光老化)细胞结果一致。

本实施例的结果说明，采用实施例2的方法获得的UVA-P3\UVA-P4代细胞可作为临床早期衰老(26～30岁)的体外替代细胞进行早期衰老评价；UVA-P5～UVA-P7代细胞可作为临床中期衰老(31～45岁)的体外替代细胞进行中期衰老评价；UVA-P8或大于UVA-P8代细胞可作为临床晚期衰老(46岁或高于46岁)的体外替代细胞进行晚期衰老评价。

本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。