一种低密度醛基基片以及低密度生物芯片的制备方法

技术领域

本申请涉及生物芯片领域，尤其是涉及一种低密度醛基基片以及低密度生物芯片的制备方法。

背景技术

生物芯片目前广泛应用于生物检测领域。目前生物芯片，特别是高密度生物芯片受到制造成本、样品处理时间、高分辨率检测仪器的多方面制约，伴随着测序技术的高速发展与测序成本的降低，高密度生物芯片的市场受到了极大的挤压。但低密度芯片具有制造成本低、样本处理速度快、检测成本低的优势，在POCT领域取得良好发展势头。

低密度生物芯片上探针数目较少，通过适当加大点样量与提高探针位点间的间隔，可以实现低成本的POCT检测。制造适宜于低密度生物芯片生产的专用基片，不仅可以提升低密度芯片质量，还可以进一步降低基片价格。本领域需要这种针对低密度生物芯片的基片。

发明内容

本发明针对当下市场缺少低密度芯片专用基片的不足，提出一种低密度醛基基片，以及制备低密度生物芯片的方法，能根据目标探针点位信息进行特定位置上的醛基修饰，只在与探针反应的位置上有修饰后的醛基并与带有氨基的探针结合；位点以外是疏水环境，不与探针结合从而降低成像检测背景，还有通过疏水作用趋动探针向醛基修饰位点聚集，提高探针与醛基位点的结合，同时也使用芯片的制作不依赖专业的点样仪也可以完成。

本申请提供一种低密度醛基基片，包括：

醛基修饰基片，和

多孔膜板，所述多孔膜板由疏水材料制成且带有通孔阵列，所述多孔膜板附接于所述醛基修饰基片的醛基修饰表面。

本申请还提供一种低密度生物芯片的制备方法，包括：

S1. 提供具有醛基修饰基片；

S2. 将由疏水材料制成的带有通孔阵列的多孔膜板粘附到所述醛基修饰基片的醛基修饰表面上，得到所述低密度醛基基片；

S3. 将带有氨基的探针施加到所述通孔中，使所述探针固定在所述基片上，得到所述低密度生物芯片。

本申请的低密度醛基基片通过醛基基片上附接疏水材料制成的多孔膜板，在利用该低密度醛基基片制备生物芯片时可以利用疏水性将点样液聚集在疏水通孔内，完成芯片制备，方法简便易行；并且可以用移液枪进行芯片制备，适用性广泛。

附图说明

图1示出低密度醛基基片示意图，1为多孔膜板，2为多孔膜板的通孔，3为醛基修饰基片；

图2示出实施例1的检测结果。

具体实施方式

下面通过实施例对本申请进一步详细说明。通过这些说明，本申请的特点和优点将变得更为清楚明确。

在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

此外，下面所描述的本申请不同实施方式中涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

如图1所示，本申请提供一种低密度醛基基片，包括：

醛基修饰基片3，和

多孔膜板1，所述多孔膜板由疏水材料制成且带有通孔阵列，所述多孔膜板附接于所述醛基修饰基片的醛基修饰表面。

在本公开中，相对于每平方厘米上有过万探针的高密度芯片，“低密度”是指每平方厘米上的探针数少于4000，尤其是探针数目在1000以内。

在本公开中，低密度醛基基片包括醛基修饰基片3。该醛基修饰基片3可以为玻璃基片例如低荧光玻璃基片，其一个表面经醛基修饰处理，形成醛基修饰表面。

提供醛基修饰基片包括：

S11. 使基片表面活化；

S12. 对表面活化的基片进行氨基修饰；

S13. 对经氨基修饰的基片进行醛基修饰，得到所述醛基修饰基片。

可以对基片例如低荧光白玻璃片进行表面清洗，去除油渍与灰尘，并进行表面活化（例如可以用浓硫酸与双氧水（95：5体积比）进行处理），水洗后进行表面氨基修饰。

可以将基片置于氨基修饰溶液中进行表面氨基修饰。在一种实施方式中，进行氨基修饰包括：用氨基修饰剂的溶液处理0.5-2小时。

所述氨基修饰剂为具有下式I的化合物：

其中，R

R

优选地，氨基修饰剂可以为3-氨丙基三乙氧基硅烷等。可以使用氨基修饰剂的溶液处理0.5-2小时，辅助轻微振荡。例如，可以1mol/L的3-氨丙基三乙氧基硅烷的丙酮溶液，室温下作用0.5-2小时。

对氨基修饰基片进行二醛化合物修饰，得到醛基修饰基片。可以将基片置于二醛化合物溶液中，进行醛基修饰，得到醛基修饰基片。进行醛基修饰的条件为：将二醛化合物溶液加入到基片上之后，室温下作用0.5-2小时。常用的二醛化合物可以选自对苯二甲醛、戊二醛等，例如可以使用1mol/L的二醛化合物丙酮溶液作为醛基修饰剂溶液。

氨基修饰基片置于二醛化合物中时，可以使其一个醛基与氨基进行脱水形成希夫碱，而另一个醛基显露在基片表面，可以与带有氨基的探针分子结合。

本公开的低密度醛基基片包括多孔膜板1，所述多孔膜板1由疏水材料制成且带有通孔2的通孔阵列，所述多孔膜板1附接于所述醛基修饰基片3的醛基修饰表面。

在本申请中，多孔膜板1由疏水材料制成。使用疏水材料制成的多孔膜板1对于本申请来说是关键的。在由该低密度醛基基片来制备生物芯片时，将探针溶液滴加到通孔上，由于该多孔膜板的疏水材料的疏水性，液滴自动聚集到通孔中，液滴中的探针的氨基与基片上的醛基形成希夫碱，从而将探针固定在基片上，完成生物芯片的制备。而且，疏水材料及其上的通孔为每个探针可结合的亲水位点提供一个疏水围栏，防止点样液向外周的流动，防止点样液边缘蒸发造成的探针位点边缘变形，提高生物芯片质量。每个探针可结合的亲水位点周围都是疏水环境，利用疏水环境在生物芯片制造过程中克服表面全部活化造成的探针点移位和探针外噪声点形成，提高生物芯片的成品率与质量。在一种实施方式中，具有疏水性质的材料例如金属，蜡膜，油纸、陶瓷、树脂等都可以用来制造该多孔膜板。

本公开的低密度醛基基片的点阵密度取决于多孔膜板1中通孔阵列中通孔密度。在一种实施方式中，通孔阵列包括多个呈阵列分布的通孔2，所述多孔膜板的通孔2孔径为100-300μm，两个通孔之间的间距为300-500μm。在通孔2处，可以显露出醛基基片的醛基修饰表面；而在其他位置，醛基基片的醛基修饰表面则被遮盖。由此，在制备生物芯片时，在低密度的醛基基片上的探针可结合的亲水位点间距较大且处于疏水区的包围之中，点样液会自动聚集在亲水位点，不使用专门的点样仪也可以完成芯片的制备过程。

由此，本申请提供一种低密度生物芯片的制备方法，包括：

S1. 提供具有醛基修饰基片；

S2. 将由疏水材料制成的带有通孔阵列的多孔膜板粘附到所述醛基修饰基片的醛基修饰表面上，得到所述低密度醛基基片；

S3. 将带有氨基的探针施加到所述通孔中，使所述探针固定在所述基片上，得到所述低密度生物芯片。

其中，提供具有醛基修饰基片可以如上进行，这里不再赘述。

在一种实施方式中，可以通过粘合剂将所述多孔膜板粘附到所述醛基修饰基片的醛基修饰表面上。所述粘合剂可以选自紫外可固化粘合剂或者可湿固化粘合剂。可以将粘合剂涂覆到多孔膜板上，然后将其粘附到所述醛基修饰基片的醛基修饰表面上，固化之后，即可以得到低密度醛基基片。

探针的氨基只能与通孔处显露的醛基通过希夫碱反应连接，从而将探针分子连接到基片上，水洗去除未反应的探针，干燥后获得检测用的生物芯片。可以通过机械手操作移液枪将所述探针溶液加入到上述低密度醛基基片。特别是可以使用多通道移液枪，极大提高低密度生物芯片的制备效率。可用的生物探针包括本领域的各种基因探针、蛋白质探针等。由于可以与探针结合的亲水性位点处于疏水区的包围之中，在结合探针时，点样液会自动聚集在醛基修饰位点上，使得不使用专门的点样仪也可以完成芯片的制备过程。

实施例1

（1）玻璃表面活化：对低荧光白玻璃片进行表面清洗，去除油渍与灰尘，并用浓硫酸与双氧水（95：5体积比）进行表面活化，水洗后进行表面氨基修饰；

（2）氨基修饰：加入氨基修饰剂进行氨基修饰：使用1mol/L的3-氨丙基三乙氧基硅烷的丙酮溶液，室温下作用0.5-2小时，并辅助轻微振荡，得到氨基修饰基片；

（3）醛基修饰：对氨基修饰基片进行二醛化合物修饰：使用1mol/L的对苯二甲醛的丙酮溶液，室温下作用0.5-2小时，得到醛基基片；

（4）设计多孔膜板：多孔膜板的通孔孔径为100-300μm，两个通孔之间的间距为300-500μm；本实施例使用铝箔，制作方便，制作通孔孔径为200μm，两个通孔之间的间距为500μm的微阵列通孔的多孔膜板；

（5）将疏水材料制备的多孔膜板粘附到醛基修饰的玻璃基片，制得低密度醛基基片，每个通孔对应一个探针可结合的亲水位点；使用（乐泰紫外固化胶/Loctite）UV胶水进行粘附，使用方法：在微阵列通孔的多孔膜板上涂布UV胶水，用玻璃棒刮成薄层，直接粘到醛基基片上，保证只有通孔位置显露出醛基，其他部位的醛基为多孔膜板所遮盖；用波长为365nm的紫外线灯在3cm灯距照射15秒完成初步固化，放置1小时后即可使用；

（6）制备基因芯片：将5'端修饰了氨基的寡核苷酸探针（购自于生工生物工程(上海)股份有限公司，使用浓度为15mmol/L；点样液为晶芯基因芯片点样液，购自于北京博奥生物有限公司）的点样液溶液滴加到通孔上，由于疏水材料的疏水性，液滴自动聚集到通孔中，液滴中的探针的氨基与基片上的醛基形成希夫碱，从而将探针固定在基片上，过夜结合后，清洗去除未反应的探针，即得基因芯片。

（7）检测过程：将待测的靶标DNA加入到已结合了探针的基因芯片上，利用现有的晶芯基因微阵列芯片杂交盒（购自于北京博奥生物有限公司），完成靶标基因的杂交过程，利用基因芯片阅读仪读取杂交结果。检测结果如图2所示。可见每个杂交点圆润饱满且边界清晰，这是由于在制备生物芯片时，该基片的疏水多孔材料及其上的通孔可以为每个探针可结合的亲水位点提供一个疏水围栏，防止点样液向外周的流动造成的探针位点边缘变形，从而使得制成的生物芯片在进行杂交检测时每个杂交点圆润饱满且边界清晰，生物芯片的质量高。

以上结合了优选的实施方式对本申请进行了说明，不过这些实施方式仅是范例性的，仅起到说明性的作用。在此基础上，可以对本申请进行多种替换和改进，这些均落入本申请的保护范围内。