一种多重PCR建库防止污染的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体为一种多重PCR建库防止污染的方法。

背景技术

多重PCR建库是一项能同时扩增多对引物的高效技术，它能同时加入多对引物进行PCR反应，理论上能高效准确地检测和鉴定多种微生物。但在实践中，当样本数量过多时，由于PCR气溶胶、人工操作不确定性等等原因导致样本间会有相互污染，甚至会出现样本发生混淆、样本信息录入错误等现象，进而影响到实验的结果，除了与实验人员沟通，并加强意识、提高警惕之外，我们仍需要其他方法来防止样本混淆，为此，提出一种多重PCR建库防止污染的方法。

发明内容

本发明提供了一种多重PCR建库防止污染的方法，解决了上述背景技术中提出的样本数量较多易污染、易混淆的问题。

本发明提供如下技术方案：一种多重PCR建库防止污染的方法，包括以下步骤：

步骤一、设计并合成核苷酸标签序列，稀释分装并编号；

步骤二、将至少一种核苷酸标签序列加入到样本中；

步骤三、对样本进行核酸提取、PCR靶向扩增和产物纯化；

步骤四、向步骤三中获得的PCR产物中添加测序接头、barcode，进行第二轮PCR扩增；

步骤五、对步骤四中的扩增产物进行纯化，最后混库上机；

步骤六、通过测序，识别reads中是否包含标签序列，判断实际检测出来的标签序列与加入的标签序列是否一致，如果完全一致，说明该样本没有发生混淆，如果该样本只检出该样本加入的探针，则说明该样本未发生污染，如果该样本中除了检测到自己的标签，同时也能检测到别样本的标签，说明该样本发生了污染。

优选的，每个样本加入的标签的浓度为10^1至10^9拷贝之间，且样本间添加的核苷酸标签序列为不同的。

优选的，人工设计并合成的核苷酸标签序列能被至少一对引物扩增，该核苷酸序列中的标签序列能被测序读长读到，且该核苷酸标签序列至少有一端的reads覆盖到样本上对应的标签序列。

优选的，每个核苷酸标签序列具有2bp以上的差异。

优选的，样本被污染时，可以按照比例进行污染过滤。

优选的，在第一轮PCR靶向扩增后，采用磁珠对扩增产物进行纯化，去掉过剩的引物和二聚体非特异，在第二次扩增产物进行纯化后，去掉部分多余的引物和非特异扩增。

与现有技术对比，本发明具备以下有益效果：

1、该多重PCR建库防止污染的方法，通过在样本中分别加入一种或多种的人工标签序列，每一对标签都可以随着样品被引物池中的至少一对引物扩增，能够防止在建库的过程中出现难以避免的因素而导致的样本污染，且在后续的生物信息分析中可以通过不同的标签来对样本进行区分，有效避免由于样本混淆或者样本污染导致样本检测结果有误。

2、该多重PCR建库防止污染的方法，可以区分出每个样本中所检测出的标签是否和建库时加入的标签一致，从而确定样本没有发生混淆和检测结果的准确性，同时可以分析每个样本中的标签组成来防止精确判断样本是否发生污染，以及污染程度。

附图说明

图1为本发明实施例中测序示意图；

图2为本发明实施例中第二轮PCR反应条件示意图；

图3为本发明实施例中某个PCR反应的示例条件示意图；

图4为本发明实施例扩增体系配置示意图；

图5为对不同样本中加入不同的防污染标签序列的测试结果示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种实施例：一种多重PCR建库防止污染的方法，包括以下步骤：

步骤一、根据多重引物集中中的找一对引物，设计并合成能被至少一对引物扩增的至少一种核苷酸标签序列，稀释分装并编号，且每个核苷酸标签序列具有2bp以上的差异；

步骤二、将至少一种核苷酸标签序列加入到样本中，每个样本加入的标签的浓度为10^1至10^9拷贝之间，且样本间添加的核苷酸标签序列为不同的，便于判断样品是否被污染；

步骤三、对样本进行核酸提取、PCR靶向扩增和产物纯化，去掉过剩的引物、二聚体非特异等；

步骤四、向步骤三中获得的PCR产物中根据不同的测序平台添加相适配的测序接头、barcode，进行第二轮PCR扩增，去掉部分多余的引物和非特异扩增；

步骤五、对步骤四中的扩增产物进行纯化，去掉部分多余的引物和非特异扩增，最后混库上机；

步骤六、通过测序，识别reads中是否包含标签序列，判断实际检测出来的标签序列与加入的标签序列是否一致，如果完全一致，说明该样本没有发生混淆，如果该样本只检出该样本加入的探针，则说明该样本未发生污染，如果该样本中除了检测到自己的标签，同时也能检测到别样本的标签，说明该样本发生了污染，而样本被污染时，可以按照比例进行污染过滤。

综上所述：该方法的原理为：在样本中分别加入一种或多种的人工标签序列，每一对标签都可以随着样品被引物池中的至少一对引物扩增；通过文库构建，测序最后可以通过该样本中的标签是否与加入的标签一致来判断是否发生污染。如果发现样本有污染，可以按照比例进行污染过滤，如果不加入标签序列，分析出的结果可能是样本混淆后的结果，尤其是对某些低分度的信号判断会有较大的影响。而加入了标签序列，能够检测测序结果和建库结果是否一致，从而使得结果更准确可信。

实施例：

该实施例为某个样本基于二代测序平台，且运用多重PCR扩增的，运用本办法检测流程，确定样品是否有混淆，具体步骤如下：

1、扩增体系

采用0.2ml PCR单管/八连管，按照附图4所示体系配置反应，且注意事项为：(1)所有试剂解冻后必须进行涡旋和离心，防止冻融后溶液成分不均一；(2)*标记的成分须在试剂分装室制备反应mix；(3)每次上机需要增加两个阴性对照：模板分别为核酸抽提用水和建库用水；(4)配好的PCR体系在上机之前应先瞬时离心将管壁上的液体离心至管底。

2、第一轮PCR反应

请参阅图3，在以第一轮反应中，如果待检测样本的核酸里面含有panel A mix里面的扩增靶标，则会被引物扩增；若不含有panel A mix里面的扩增靶标，则不会被扩增；但是，无论待检测样本核酸里面是否含有panel A mix里面的扩增靶标，IAC集合都会被panelA mix里面的引物扩增。通过扩增消化引物，使得二聚体大量减少，提高PCR扩增产物质量。

3、第一轮扩增产物纯化

在完成第一轮PCR反应后，会采用磁珠对扩增产物进行纯化，去掉过剩的引物，二聚体非特异等等。某个举例纯化条件如下：

ⅰ、向PCR反应液中加入0.5倍原始PCR体积的DNA纯化磁珠(如PCR体系为30ul，则加15ul磁珠)；用移液器50ul量程上下吹打10-15次，以使扩增产物与磁珠充分混匀。室温静置2分钟。

ⅱ、用磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止(大约需要2min)。用移液器转移上清至新的EP管中，避免吸到磁珠，弃磁珠。

ⅲ、向上清液中加入0.7倍原始PCR体积的DNA纯化磁珠(如PCR体系为30ul，则加21ul磁珠)；用移液器50ul量程上下吹打10-15次，以使扩增产物与磁珠充分混匀。室温静置2min。

ⅳ、用磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止。用移液器小心去除上清，避免吸到磁珠。

ⅴ、向磁珠中加入40ul BW11，重悬磁珠，室温静置2分钟。

ⅵ、用磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止(大约需要2min)。用移液器去除上清，避免吸到磁珠。

ⅶ、向磁珠中加入100ul 80％乙醇，用磁力架反复在不同的两面来回吸附磁珠以充分悬浮洗涤磁珠，用磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止(大约需要2min)。用移液器小心去除上清，避免吸到磁珠。

4、第二轮PCR反应

在获得PCR产物之后，可以根据不同的测序平台选择连接不同的接头。举例PCR条件如附图2所示。

5、第二轮PCR纯化

在连接完测序接头之后，需要对文库进行纯化，去掉部分多余的引物和非特异扩增。示例流程如下：

ⅰ、向PCR反应液中加入0.9倍体积的DNA纯化磁珠(如PCR体系为30ul，则加27ul磁珠)用移液器50ul量程上下吹打，以使回收产物与磁珠充分混匀。室温静置2分钟。

ⅱ、用磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止(大约需要2min)。

ⅲ、用移液器小心去除上清，避免吸到磁珠。

ⅳ、向磁珠中加入40ul BW08，涡旋均匀，室温静置2min。

ⅴ、用磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止(大约需要2min)。用移液器去除上清。

ⅵ、加入100ul 80％乙醇，用磁力架反复在不同的两面来回吸附磁珠以充分悬浮洗涤磁珠,用移液器小心去除上清，避免吸到磁珠。

6、上机测序

上机测序可以选择illumina或者iontorent，MGI等平台测序。但本方法需要测序长度能够覆盖到样本对应的标签序列，以便区分检测结果来自IAC序列还是真实检测序列；如附图1所示，测序至少有一端的reads覆盖IAC上的tag标签。

7、数据分析

在获得测序数据之后，需要对测序数据进行区分，通过比对软件，检查每个样本检测出的标签序列和预处理时加入的标签序列是否一致，从而可以确定样本是否有混淆。

该方法使用效果如图5所示：表中登记标签一行为在样本中初始加入的标签ID，实际标签为测序技术实际测出来的标签，表中其它行是每种标签在每个样本中检出的reads数，只有实际标签与登记标签完全一致的时候，才认为该样本没有发生混淆或者污染。如果该样本中，除了有登记标签以外，还有其他标签，说明该样本有污染，再按照等比例原则扣除即可。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。