蛋白质支架

技术领域

本发明提供了一种蛋白质支架和制备、筛选、工程化和使用所述蛋白质支架的方法。

背景技术

本发明涉及蛋白质支架，其可用于例如生成具有新的结合特性的产物。

例如蛋白质和配体等分子之间的相互作用对于生物体中的多重功能是必需的。获得对感兴趣的靶标具有结合特性的蛋白质分子的能力在生物科学和医学中是重要的。例如，可以通过检测与患病状态相关的感兴趣的靶标的存在的能力来促进诊断疾病的能力。在另一实例中，已知体内的分子之间的相互作用的调节具有治疗效果，并且通过利用与配体、受体、酶和治疗目的的其它靶标结合的分子开发了许多药物。

由于抗体相对大且复杂的结合表面，已知抗体通常对其靶标具有比小分子药物更高的特异性，并且在治疗应用中，已知它们具有较低的由无差别结合诱导毒性的可能性。然而，已知抗体的使用有时存在缺点，例如通常需要哺乳动物细胞生产以获得用于治疗用途的全长抗体，并且与较小的分子相比，全长抗体的组织穿透性通常较低。

尽管抗体片段的使用可以克服这些缺点中的一些，但是抗体片段具有聚集的趋势并且不如全长抗体稳定。例如，由于scFv分子的不稳定性问题，对于一些应用，有时需要耗时的稳定性成熟(Honegger A.等人,2009)，并且缺乏热稳定性有时会使scFv分子在体内为无用的(Willuda J.等人,1999)。在一些情况中，scFv的不稳定性可为它们用于工程化双特异性和多特异性构建体的阻碍(Miller B.等人,2010,Xu L.等人,2013)。这引起了对工程化非免疫球蛋白蛋白质分子以克服这些缺点中的一些的兴趣。

已努力通过随机化蛋白质表面以生成新的结合蛋白的文库来开发非免疫球蛋白蛋白质分子(例如，Binz H.等人,2003,Vogt M.,Skerra A.,2004)。然而，在一些情况中，随机化期间遇到的工程化困难可导致支架文库成员的稳定性仅略微优于抗体片段的稳定性。通常还认为单个支架蛋白质的结构和支架结合表面的拓扑结构(topography)的差异导致各个支架有效识别的表位的类型的偏差(Gilbreth R.,Koide S.,2012)。例如，DARPins的刚性和凹形(concave)结合表面被认为限制了能够被该支架识别的表位的结构多样性。(Schilling J.等人,2014,Gilbreth R.,Koide S.,2012)。在相关实例中，LoopDARPin支架用在中间具有突起的一者替代DARPin的凹形结合表面，并且预期与DARPin相比结合至不同形状的表位(Schilling J.等人,2014)。在其它实例中，anticalin支架的篮状结构倾向于支撑结合的靶标，并且亲和体具有倾向于识别其靶标中类似的平坦的表面的平坦的结合位点结构(Gilbreth R.,Koide S.,2012)。支架结合表面的拓扑结构通常与以高亲和力识别的表位的类型的相关。

因此，需要开发用于各种治疗、诊断和工业应用的小的、稳定的人工抗体样分子。

本文的参考文献的引用或讨论不应被解释为承认这是本发明的现有技术。

发明内容

本发明提供了重组的、非天然存在的蛋白质支架，其可用于获得与感兴趣的化合物的结合活性。特别地，本文所述的支架可用于展示与抗体可变区的互补决定区(“CDR”)类似的限定的环。可对这些环进行随机化或限制性进化以生成结合多种靶标化合物所需的多样性。

本发明提供了重组的、非天然存在的多肽支架，其包含重组CheB

在具体实施方案中，重组支架蛋白质(下文中称为“本发明支架”)包含重组CheB

在另一实施方案中，本发明还提供了包含多个本发明支架的多肽展示文库。本发明的文库可用于捕获和鉴定本发明的靶标结合支架。

在另一实施方案中，本发明还提供了编码本发明支架和文库的分离的核酸分子。

在另一实施方案中，本发明还提供了制备、使用、筛选、优化、和工程化本发明支架和文库的方法。

在仍另一实施方案中，本发明还提供了包含本发明支架的药物组合物。

在另一实施方案中，本发明还提供了通过施用治疗有效量的本发明支架或包含本发明支架的药物组合物来治疗、预防、改善、检测、诊断、或监控患者中的疾病或其症状的方法。

附图说明

出于说明本发明的目的，在附图中描绘了本发明的某些实施方案。然而，本发明不限于附图中描绘的实施方案的精确排列和手段。

图1.包含野生型CheB

图2.野生型CheB

图3.衍生自移植有3个人工环的本发明支架的测试环移植物构建体的模型的本发明的人工切割的支架的示意图。(A)人工环(包含三个测试环移植物)的结构示意图。图中描绘了在(i)位置1、(ii)位置2、和(iii)位置3的单独的人工环，并且分别由SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:87组成。(B)支架的基部的结构示意图。(C)本发明支架的测试环移植物构建体的结构示意图，其由三个测试环移植物和组合的支架的基部组成，并且包含SEQ ID NO:11。

图4.CheB

图5.CheB

图6.本发明支架的测试环移植物构建体的比对的多肽序列的图示。序列标识显示在比对方案中它们各自序列的右侧。比对方案显示与不含测试环移植物的CheB

图7.本发明支架的纯化测试环移植物构建体的SDS-PAGE。在图的顶部标记泳道。泳道M：Precision Plus蛋白质标准品(Bio-Rad)；泳道1：CheB

图8.在位置1和2和3具有测试环移植物的本发明支架的纯化测试环移植物构建体(SEQ ID NO:11)的尺寸排阻色谱图。图中标记的箭头指示的是蛋白质种类(species)的SEC色谱图衍生的尺寸估计值及其相对丰度。(A)显示22.6kDa蛋白质峰种类(对应于单体级分)以96.4％存在。(B)显示47.7kDa蛋白质峰种类(对应于二聚体)以3.6％存在。

图9.本发明支架的纯化测试环移植物构建体通过差示扫描荧光测定法(DSF)获得的荧光强度的一阶导数曲线。(A)在位置2和3具有测试环移植物的构建体(SEQ ID NO:8)的Tm为89.9℃。(B)在位置1和2具有测试环移植物的构建体(SEQ ID NO:9)的Tm为92.0℃。(C)在位置1和3具有测试环移植物的构建体(SEQ ID NO:10)的Tm为91.3℃。(D)在位置1和2和3具有测试环移植物的构建体(SEQ ID NO:11)的Tm为89.4℃。

图10.用于生成包含本发明支架的随机化文库的编码区的组装DNA片段的引物和DNA片段的图示。图中的箭头表示用于扩增和组装各个DNA片段的表1中列出的PCR引物的退火位置和方向。图中的矩形表示DNA片段，矩形内的标记表示包含由相应DNA片段编码的多肽区的框架和环的标识。矩形的重叠区域代表重叠互补核苷酸序列，其能够通过PCR连接DNA片段。外部引物EcoRIF和AscIR分别包含EcoRI和AscI的限制性酶切位点。

图11.包含编码本发明支架的随机化文库的框架和环区的序列的DNA片段的重叠延伸PCR组装的图示。图中的箭头表示用于扩增和组装各个DNA片段的表1中列出的PCR引物的退火位置和方向。图中的矩形表示DNA片段，矩形内的标记表示包含由相应DNA片段编码的多肽区的框架和环的标识。矩形的重叠区域代表重叠互补核苷酸序列，其能够通过PCR连接DNA片段。外部引物EcoRIF和AscIR分别包含EcoRI和AscI的限制性酶切位点。(A)DNA片段的第一PCR组装的代表(representation)，所述DNA片段包含FR1+L1、FR2+L2、和FR3+L3+FR4的编码区。(B)显示DNA片段的后续组装的第二PCR组装的代表，所述DNA片段包含FR1-L1+FR2-L2+FR3-L3-FR4的编码区。(C)显示所得DNA片段的组装产物的代表，所述DNA片段包含随机化支架文库的编码区。

图12A.来自针对靶标PD-L1的选择输出的单个克隆的ELISA筛选。条形图显示了从各克隆获得的ELISA信号，所述克隆从第三轮的噬菌体展示选择的输出获得，所述第三轮噬菌体展示选择用(i)5nM的浓度和(ii)0.5nM的浓度(分别为板1和板2)的PD-L1靶标进行。

图12B.来自针对靶标HER2的选择输出的单个克隆的ELISA筛选。条形图显示了从各克隆获得的ELISA信号，所述克隆从第三轮噬菌体展示选择的输出获得，所述第三轮噬菌体展示选择用(i)5nM的浓度和(ii)0.5nM的浓度(分别为板3和板4)的HER2靶标进行。

图13.本发明支架的所选纯化ELISA阳性靶标结合蛋白的变性SDS-PAGE(4-12％)分析。在天然(native)条件下，在钴琼脂珠上从含有诱导表达构建体的大肠杆菌(E.coli)XL1-Blue细胞的裂解物的可溶性级分纯化蛋白。各凝胶泳道中纯化蛋白的上样量相当于源自100微升的过夜2xYT肉汤摇瓶培养物的量。用考马斯(coomassie)蓝染色使蛋白质可视化。箭头表示基于分子量计算的支架蛋白质的近似预期迁移位置。在图的顶部标记样品泳道。泳道M:Precision Plus蛋白质标准品(Bio-Rad)；泳道1:1-12D(SEQ ID NO:52)；泳道2:1-12B(SEQ ID NO:53)；泳道3:2-8B(SEQ ID NO:54)；泳道4:1-2A(SEQ ID NO:55)；泳道5:1-3E(SEQ ID NO:56)；泳道6:1-12C(SEQ ID NO:57)；泳道7:1-10B(SEQ ID NO:58)；泳道8:1-1E(SEQ ID NO:59)；泳道9:2-3H(SEQ ID NO:60)；泳道10:2-6D(SEQ ID NO:61)；泳道11:3-1D(SEQ ID NO:62)；泳道12:3-3A(SEQ ID NO:63)；泳道13:3-5A(SEQ ID NO:64)；泳道14:3-7E(SEQ ID NO:65)；泳道15:3-8A(SEQ ID NO:66)；泳道16:3-10H(SEQ ID NO:67)；泳道17:4-3E(SEQ ID NO:68)；泳道18:4-7D(SEQ ID NO:69)；泳道19:4-9B(SEQ ID NO:70)；泳道20:4-12B(SEQ ID NO:71)。

图14.本发明支架的所选纯化ELISA阳性靶标结合蛋白的变性SDS-PAGE(4-12％)分析。在天然条件下，在钴琼脂珠上从含有诱导表达构建体的大肠杆菌XL1-Blue细胞的裂解物的可溶性级分纯化蛋白。各凝胶泳道中纯化蛋白的上样量相当于源自100微升的过夜2xYT肉汤摇瓶培养物的量。用考马斯蓝染色使蛋白质可视化。箭头表示基于分子量计算的支架蛋白质的近似预期迁移位置。在图的顶部标记样品泳道。泳道M:Precision Plus蛋白质标准品(Bio-Rad)；泳道1:1-12B(SEQ ID NO:53)；泳道2:1-2A(SEQ ID NO:55)；泳道3:1-3E(SEQ ID NO:56)；泳道4:1-12C(SEQ ID NO:57)；泳道5:1-1E(SEQ ID NO:59)；泳道6:2-3H(SEQ ID NO:60)；泳道7:1-8E(SEQ ID NO:72)；泳道8:1-11C(SEQ ID NO:73)；泳道9:1-1B(SEQ ID NO:74)；泳道10:1-12E(SEQ ID NO:75)；泳道11:1-1F(SEQ ID NO:76)；泳道12:2-5H(SEQ ID NO:77)；泳道13:2-5C(SEQ ID NO:78)；泳道14:2-7B(SEQ ID NO:79)。

图15.本发明支架的所选纯化ELISA阳性靶标结合蛋白、和源自多节闪烁杆菌(Fervidobacterium pennivorans)的趋化蛋白CheY的测试环移植物构建体(SEQ ID NO:49)的纯化蛋白的变性SDS-PAGE(4-12％)分析。在天然条件下，在钴琼脂珠上从含有诱导表达构建体的大肠杆菌XL1-Blue细胞的裂解物的可溶性级分纯化蛋白。各凝胶泳道中纯化蛋白的上样量相当于源自100微升的过夜2xYT肉汤摇瓶培养物的量。用考马斯蓝染色使蛋白质可视化。箭头表示基于分子量计算的支架蛋白质的近似预期迁移位置。在图的顶部标记样品泳道。泳道M:Precision Plus蛋白质标准品(Bio-Rad)；泳道1:3-3A(SEQ ID NO:63)；泳道2:3-7E(SEQ ID NO:65)；泳道3:3-8A(SEQ ID NO:66)；泳道4:4-7D(SEQ ID NO:69)；泳道5：源自多节闪烁杆菌的趋化蛋白CheY的测试环移植物构建体(SEQ ID NO:49)。

图16A.本发明支架的所选纯化ELISA阳性靶标结合蛋白通过差示扫描荧光法(DSF)获得的荧光强度的一阶导数曲线。每种蛋白质的熔解温度在图中表示为：(i)1-12C：84.5℃；(ii)1-2A：84.6℃；(iii)1-3E：85.6℃。蛋白质的序列标识分别为SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56。

图16B.本发明支架的所选纯化ELISA阳性靶标结合蛋白通过差示扫描荧光法(DSF)获得的荧光强度的一阶导数曲线。每种蛋白质的熔解温度在图中表示为：(i)1-1B：81.3℃；(ii)1-8E：82.8℃；(iii)1-12E：88.0℃。蛋白质的序列标识分别为SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:75。

图16C.本发明支架的所选纯化ELISA阳性靶标结合蛋白通过差示扫描荧光法(DSF)获得的荧光强度的一阶导数曲线。每种蛋白质的熔解温度在图中表示为：(i)1-11C：81.0℃；(ii)2-7B：84.3℃。蛋白质的序列标识分别为SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:79。

图16D.本发明支架的所选纯化ELISA阳性靶标结合蛋白通过差示扫描荧光法(DSF)获得的荧光强度的一阶导数曲线。每种蛋白质的熔解温度在图中表示为：(i)3-7E：85.9℃；(ii)3-8A：81.9℃。蛋白质的序列标识分别为SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66。

图16E.本发明支架的所选纯化ELISA阳性靶标结合蛋白通过差示扫描荧光法(DSF)获得的荧光强度的一阶导数曲线。每种蛋白质的熔解温度在图中表示为：(i)4-7D：82.4℃；(ii)3-3A：81.6℃。蛋白质的序列标识分别为SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:63。

图17A.本发明支架的所选纯化PD-L1结合蛋白的亲和力测定。通过ELISA确定EC

图17B.本发明支架的所选纯化HER2结合蛋白的亲和力测定；通过ELISA确定EC

图18.CheB

图19.多节闪烁杆菌来源的蛋白质结构域的测试环移植的图示。(A)多节闪烁杆菌的趋化蛋白CheY(SEQ ID NO:48)GenBank ID:ANE42371.1氨基酸残基147-337的多肽序列的图示，对选择用于测试环移植的位置加下划线。图中的残基编号对应于SEQ ID NO:48。(B)源自多节闪烁杆菌的趋化蛋白CheY GenBank ID:ANE42371.1氨基酸残基147-337的测试环移植物构建体(SEQ ID NO:49)的多肽序列的图示，对人工测试环移植物加下划线。图中的残基编号对应于SEQ ID NO:49。

图20.多节闪烁杆菌的趋化蛋白CheY GenBank ID:ANE42371.1氨基酸残基147-337的野生型多肽序列(SEQ ID NO:48)(Sbjct)与对应的测试环移植物构建体(SEQ ID NO:49)(Query)的多肽序列比对的计算机生成的输出的一部分的示意图。在NCBI(美国国家生物技术信息中心)网站上用blastp算法进行序列比对。闪烁杆菌属菌种来源的蛋白质的残基编号对应于GenBank ID编号方案。野生型CheY多肽序列(Sbjct)的图中的残基编号对应于GenBank ID编号方案，而测试环移植物构建体(Query)的图中的残基编号对应于SEQ IDNO:49。

图21.源自多节闪烁杆菌的趋化蛋白CheY的测试环移植物构建体(SEQ ID NO:49)的纯化蛋白通过差示扫描荧光法(DSF)获得的荧光强度的一阶导数曲线。蛋白质的熔解温度为78.0℃。

表格

表格的简要说明

表1.用于扩增、组装、和克隆本发明支架的支架框架DNA片段、测试环移植物DNA片段、和随机化环区DNA片段的PCR引物的核苷酸序列。

表2.在位置2和3具有测试环移植物的本发明支架的测试环移植物构建体(SEQ IDNO:8)、在位置1和2具有测试环移植物的本发明支架的测试环移植物构建体(SEQ ID NO:9)、在位置1和3具有测试环移植物的本发明支架的测试环移植物构建体(SEQ ID NO:10)、以及在位置1和2和3具有测试环移植物(SEQ ID NO:11)的本发明支架的测试环移植物构建体的纯化收率和熔解温度。从2xYT培养基中的50ml大肠杆菌摇瓶培养物纯化蛋白。

表1

表2

具体实施方式

本文所述的蛋白质支架已被设计为优于抗体衍生的片段和非抗体结构域。本发明支架相对于抗体片段的主要优点是结构上的。支架衍生自在多种原核生物中发现的结构上保守、稳定和可溶的蛋白质结构域。因此，它表现出比抗体片段更好的折叠和热稳定性，所述抗体片段的产生涉及去除完整抗体中的一部分的抗体天然折叠，通常暴露会包埋在疏水环境中的氨基酸残基，例如可变结构域和恒定结构域之间的界面。将这样的疏水性残基暴露于溶剂增加了聚集的可能性。

此外，本发明支架提供了抗体分子的功能优势。特别地，尽管事实上本发明支架不是免疫球蛋白，但人工工程化结合表面与IgG重链的可变区具有一些设计的相似性，其以与抗体CDR类似的方式包括溶剂暴露的可变环。由于这种结构，本发明支架具有与抗体的那些实际上相似的抗原结合特性。因此，可以在体外采用类似于体内抗体的亲和力成熟过程的环随机化和改组(shuffling)策略。

本发明支架基于CheB甲酯酶C-末端催化结构域(CheB

在本发明中，令人惊讶地发现CheB

因此，在本发明中，发现CheB

发现本文采用的随机化设计和随机筛选方法提供了获得针对感兴趣的靶标的特异性结合物的简便且有效的手段。因此，预期本发明支架特别地可用于开发例如但不限于针对多种靶标的各种治疗试剂、诊断试剂、和检测试剂。

作为上述的结果，本发明涉及一种重组支架蛋白质，其包含重组CheB

对于本领域技术人员显而易见的是，3

在另一具体实施方案中，本发明支架包含十四个环区，其由以下组成：SEQ ID NO:1的氨基酸残基位置16至18(包括端值)、29至37(包括端值)、43至47(包括端值)、60至61(包括端值)、66至75(包括端值)、80至84(包括端值)、92至93(包括端值)、103至107(包括端值)、124至125(包括端值)、135至137(包括端值)、149至150(包括端值)、160至162(包括端值)、173至176(包括端值)和180至181(包括端值)，与对应于SEQ ID NO:1的非环区的二级结构元件连接，和；其中所述环区的至少一个是SEQ ID NO:1的同源环区的非天然存在的变体，和；在非天然存在的变体环区外与SEQ ID NO:1具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％氨基酸序列同一性。

在另一具体实施方案中，本发明支架包含四个框架区FR1(SEQ ID NO:40)、FR2(SEQ ID NO:41)、FR3(SEQ ID NO:42)、和FR4(SEQ ID NO:43)的序列，其中框架区多肽与SEQ ID NO:1的同源区具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％氨基酸序列同一性；由环区连接，其中至少一个环区是SEQ ID NO:1的同源环区的非天然存在的变体。

在另一实施方案中，本发明还涉及编码本发明支架的随机化变体的单个和集体文库成员的核酸。存在各种在编码多肽序列的核酸中引入变异的方法，包括但不限于并入含有简并密码子或偶联三核苷酸的混合物的DNA片段、采用易错PCR、DNA片段改组、以及各种其它方法和方法的组合，并且这些方法是本领域技术人员熟知且容易使用的。

在具体实施方案中，三核苷酸混合物的偶联是公知的方法，其能够增加对随机化DNA片段中并入的密码子的相对频率和变异的控制。然而，由于该方法的不完全精确性，还并入了人工密码子，并且还发生了三核苷酸的随机缺失或插入。这些事件提供了另外的变异来源，可以偶然地使得能够分离具有有用性质的另外的支架变体，因此从这种众所周知的另外的变异来源产生的支架变体构成本发明的一个实施方案。类似地，采用简并NNK密码子编码寡核苷酸的方法也导致各种众所周知的人工产物。因此，这两种方法能够生成编码多肽序列中受控和偶然的变异二者的不同DNA片段。作为上述的结果，在本发明的具体实施方案中，编码本发明支架的框架区多肽的多核苷酸与编码变体环区多肽的寡核苷酸连接，通过三核苷酸偶联或简并NNK密码子或其组合来随机化。

在另一具体实施方案中，编码变体环区多肽的寡核苷酸可以通过各种简并密码子来随机化，例如但不限于NNK、NNS、NHK、VNK、NNN、或其组合。在其它实施方案中，编码变体环区多肽的寡核苷酸可以通过以下来随机化：通过易错聚合酶如在易错PCR中，通过培养的细胞或微生物的诱变株，或通过本领域技术人员已知的各种其它随机或靶向诱变手段。

在本发明的具体实施方案中，包含编码本发明支架的随机化环区的序列的DNA片段(例如，SEQ ID NO:16-20中所示的那些)与包含编码本发明支架的框架区的序列的DNA片段(例如，SEQ ID NOs:81-84中所示的那些)连接，其中框架区多肽与SEQ ID NO:1的同源区具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％氨基酸序列同一性。在具体实施方案中，片段通过重叠延伸PCR、通过例如图10和11中描绘的方案中所示的方式来连接。当然，产生重组DNA分子的其它合适的方法可以被替代，并且是本领域技术人员熟知的。另外，本领域技术人员可以凭经验测试环长度和编码的随机化氨基酸组成中的多种变化以产生适当随机化的支架变体。此外，本领域技术人员熟知，采用不同密码子的多种可能的核酸序列可用于编码相同的多肽。本领域技术人员可以选择已知在不同生物体内以不同频率使用的密码子作为例如优化本发明支架的产量的手段。因此，本发明的核酸序列不限于本文所示的代表性实例。

在具体实施方案中，本发明支架包含四个框架区FR1(SEQ ID NO:40)、FR2(SEQ IDNO:41)、FR3(SEQ ID NO:42)、和FR4(SEQ ID NO:43)，其中框架区多肽与SEQ ID NO:1的同源区具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％氨基酸序列同一性；和三个环区L1(SEQ ID NO:44)、L2(SEQ ID NO:44)、和L3(SEQ IDNO:47)，其中Xaa表示任何氨基酸；和其中L1在FR1和FR2之间连接、L2在FR2和FR3之间连接、并且L3在FR3和FR4之间连接以形成包含排列FR1-L1-FR2-L2-FR3-L3-FR4的连续多肽。在另一具体实施方案中，在L1、L2和L3环区中，Xaa表示获得自由以下组成的组的氨基酸：丝氨酸、天冬氨酸、精氨酸、丙氨酸、亮氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、色氨酸、甘氨酸、谷氨酸、缬氨酸和酪氨酸。在一个实施方案中，本发明支架包含例如由SEQ ID NO:2表示的多肽。在另一实施方案中，其由包含例如由SEQ ID NO:5表示的多核苷酸的多核苷酸编码。本领域技术人员可以用最小的努力取代其它多核苷酸以获得包含由SEQ ID NO:2表示的多肽的编码区的多核苷酸。

在另一具体实施方案中，本发明支架包含四个框架区FR1(SEQ ID NO:40)、FR2(SEQ ID NO:41)、FR3(SEQ ID NO:42)、和FR4(SEQ ID NO:43)，其中框架区多肽与SEQ IDNO:1的同源区具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％氨基酸序列同一性；和三个环区L1(SEQ ID NO:45)、L2(SEQ ID NO:46)、和L3(SEQ ID NO:47)，其中Xaa表示任何氨基酸；和其中L1在FR1和FR2之间连接、L2在FR2和FR3之间连接、并且L3在FR3和FR4之间连接以形成包含排列FR1-L1-FR2-L2-FR3-L3-FR4的连续多肽。在另一具体实施方案中，在L1和L2环区中，Xaa表示任何氨基酸，和；对于L3环区，Xaa表示氨基酸获得自选自由以下组成的组：丝氨酸、天冬氨酸、精氨酸、丙氨酸、亮氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、色氨酸、甘氨酸、谷氨酸、缬氨酸和酪氨酸。在一个实施方案中，本发明支架包含例如由SEQ ID NO:3表示的多肽。在另一实施方案中，其由包含例如由SEQ ID NO:6表示的多核苷酸的多核苷酸编码。本领域技术人员可以用最小的努力取代其它多核苷酸以获得包含由SEQ ID NO:3表示的多肽的编码区的多核苷酸。

在一些实施方案中，本发明支架可以通过移植从其它结合分子例如但不限于抗体的CDR获得的环区或从具有已知结合活性的其它多肽获得的环区而与靶标结合。在其它实施方案中，可以将具有已知活性的肽，例如抗微生物肽、细胞膜穿透肽、血小板聚集抑制肽、转移抑制肽、免疫调节肽和具有已知活性的其它肽移植至支架中。

在其它实施方案中，可以在本发明支架上进行亲和力成熟以获得具有比亲本克隆更强或更弱的结合亲和力或生物活性的结合物。存在许多出于亲和力成熟目的而引入序列变异的方法，这些方法是本领域技术人员熟知的，包括但不限于环随机化、易错PCR、有性PCR(sexual PCR)、和其它方法。此类方法也可用于获得具有改变的生物物理性质、生理性质或其它性质的结合物。

在其它实施方案中，本发明支架可以随机化，例如具有各种不同的环长度、环移植位置、环氨基酸组成和移植环的数量。意识到本文的发现，CheB

在一些实施方案中，可以将变异引入环区外的本发明支架的一个或更多个结构区中。意识到本文公开的发现，并且通过利用例如免费获得的结构数据，本领域技术人员将能够仅通过常规试验和误差来鉴定和测试适用于突变和随机化的支架的区域。因此，在一个实施方案中，这些非环区可用于引入结构变化和生成具有人工结合表面的不同支架分子池。

在另一实施方案中，随机化方法可用于生成具有人工结合表面的不同支架分子池，所述人工结合表面包括环区、非环区及其组合的变体。

在一些实施方案中，可以将变异引入先前未随机化的本发明支架的区域中，从而生成本发明的进一步随机化文库。此类变体可以包括例如但不限于先前未随机化的环区或支架框架区的变体，从而生成具有更高或更低亲和力、或具有改变的生物物理性质、生理性质或其它性质的与靶标的结合物。

在其它实施方案中，可以容易地生成截短或伸长形式的本发明支架。例如，已知SEQ ID NO:1的前四个氨基酸残基并未在包含野生型CheB

在另一实施方案中，环状排列版本的本发明支架可以通过连接支架分子的N-末端和C-末端并在另一个位置引入新的末端来形成。已知支架的N-末端和C-末端彼此接近，并且意识到支架的稳定性，对于本领域技术人员来说，使用可获得的支架的结构数据以鉴定用于工程化替代末端以生成环状排列的本发明支架的合适位置是显而易见和微不足道的。此类构建体可以仅使用常规实验容易地工程化并测试稳定性而不需要过度的努力。

在另一实施方案中，也可以使用例如内含肽(intein)介导的反式剪接环化、二硫键形成、异肽键形成、或本领域技术人员已知的各种化学或分子生物学技术来构建不具有末端的本发明支架的环化分子。众所周知环化蛋白质通常具有增强的构象稳定性和对外肽酶和热降解的抗性。

在另一实施方案中，具有增强的稳定性的本发明支架可以通过各种手段来生成，例如引入分子内二硫键、分子内化学交联、异肽键形成和其它众所周知的手段。在另一实施方案中，可以进行众所周知的稳定性成熟技术，例如涉及生成突变支架变体的文库的那些，以及借助于增强的稳定性或产量的众所周知的选择方法。在另一实施方案中，可以进行增强的稳定性变体的合理设计。还在另一实施方案中，本发明支架与已知具有高溶解度或稳定性的蛋白质的融合可用于改善包含本发明支架的分子的总体溶解度或稳定性。在另一实施方案中，可以通过上述或通过其它众所周知的稳定性增强和选择技术来改善对聚集的抗性、或对蛋白水解酶的降解的抗性、或对化学降解的抗性。

已知来自不同物种的CheB

在另一实施方案中，可以使用多肽或多核苷酸序列同源性检索来鉴定可以以与本发明类似的方式利用的蛋白质。例如，通过常规的多肽同源性检索，可以确定几种蛋白质，包括多节闪烁杆菌的趋化蛋白CheY的结构域(GenBank ID:ANE42371.1氨基酸残基147-337)(SEQ ID NO:48)的蛋白，表现出与CheB

本发明的进一步实施方案涉及筛选用于与靶标分子特异性结合的本发明随机化文库的方法。

本发明的一个实施方案包括一种获得与靶标结合的多肽支架的方法，所述方法包括：(a)在允许形成支架:靶标配体复合物的条件下，使靶标配体与随机化文库接触和，(b)从复合物获得结合靶标配体的支架。

所有选择技术的基本原理是表型(即展示蛋白)和基因型(即编码展示蛋白的核酸)的物理关联。不同的选择技术使用不同的策略来实现这种关联，并且是本领域技术人员公知的。因此，在一些实施方案中，此类技术的实例包括但不限于病毒展示、细菌展示、酵母展示、哺乳动物细胞展示、mRNA展示、核糖体展示、cDNA展示、或噬菌体展示。例如，已经观察到丝状噬菌体展示在例如热(Dudgeon K.,等人,2013)和活动物中的体内选择(Du B.,等人,2010)等极端选择条件下存活。

在本发明的具体实施方案中，选择噬菌体展示作为选择技术。

尽管大多数噬菌体展示方法已使用丝状噬菌体，但λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统和T7噬菌体展示系统也是已知的。

在本发明的具体实施方案中，用与丝状M13噬菌体的全长pIII蛋白融合的本发明支架进行噬菌体展示。然而，本发明支架的噬菌体展示不限于该实例。本领域技术人员熟知，丝状噬菌体展示可以通过将感兴趣的蛋白与全长pIII次要外壳蛋白的N-末端、或与其截短的衍生物、或其重组衍生物融合来进行，并且这些可以由本领域技术人员容易地替换。

本领域技术人员熟知，感兴趣的蛋白在噬菌体表面上的展示通常取决于感兴趣的蛋白向细菌周质的易位。在一些实施方案中，包含与噬菌体外壳蛋白融合的感兴趣的蛋白的融合蛋白易位。在其它实施方案中，允许感兴趣的蛋白在易位至周质后与噬菌体外壳蛋白形成二硫键。已经描述了适合于将各种感兴趣的蛋白易位至周质的多种信号序列，并且是本领域技术人员熟知的。可以容易地从已知有效且大量输出至周质的蛋白中鉴定另外的信号序列(Schmidt A.等人,2015)，并且这些明显选择的信号序列可以通过本领域技术人员已知的确立的技术容易地与感兴趣的蛋白质融合。当与多种信号序列融合时，可以容易地采用众所周知的测定法如ELISA来监控感兴趣的蛋白质在噬菌体颗粒上的展示(Zhao N.等人,2016)。因此，使用常规方法并且无需过度实验，对于本领域技术人员来说，以合理的成功预期利用多种信号序列构建各种合适的噬菌体展示载体用于本发明支架的噬菌体展示的目的是微不足道的。

在本发明的具体实施方案中，包含对应于文库插入物的限制性位点的EcoRI和AscI限制性酶切位点的修饰的pADL-10b噬菌粒载体(Antibody Design Labs)用于构建本发明的文库和生成本发明支架与噬菌体pIII蛋白的融合体用于噬菌体颗粒上的展示。通过EcoRI和AscI位点将编码本发明的随机化支架的DNA片段克隆至载体中，以生成大量的编码不同随机化支架文库成员的不同重组噬菌粒。许多其它合适的限制酶或其它合适的生成重组DNA的方法是本领域技术人员熟知的并且可以被替换。

在具体实施方案中，这些重组噬菌粒随后转化至大肠杆菌菌株XL1-Blue中以生成共同编码本发明支架的大量不同随机化文库成员的大量的克隆。当然，许多其它合适的大肠杆菌菌株如TG1可以容易地被替换，并且是本领域技术人员熟知的。通常，通过该方法可以获得1x10

在本发明的具体实施方案中，随后根据已知方法、用例如VCSM13等M13辅助噬菌体在液体培养物中重复感染(superinfect)该文库。诸如例如M13KO7等其它辅助噬菌体菌株可被容易地替换，并且是本领域技术人员熟知的。这些辅助噬菌体菌株通常包含突变的DNA序列，所述突变的DNA序列有利于将噬菌粒(含有编码本发明支架的单个随机化文库基因)包装至成熟噬菌体颗粒中，从而生成支架的单个噬菌体展示的随机化文库成员和编码它们的基因之间的物理连接。

在具体实施方案中，在该感染之后，降低培养物的孵育温度以产生展示本发明支架的随机化文库成员的噬菌体颗粒。具体孵育温度是已知有效产生本发明支架与噬菌体外壳蛋白的融合蛋白的孵育温度，例如26℃。在本发明的具体实施方案中，通过添加IPTG至0.5mM，从噬菌粒lac启动子在细菌细胞中诱导具有本发明支架的pIII融合蛋白的基因的表达。选择诱导条件使得产生的大部分噬菌体呈现至少一种本发明的随机化支架。当然，本领域技术人员可以容易地选择其它合适的实验条件，包括使用其它噬菌粒启动子、和诱导条件等，只需微不足道的实验即可。

在另一具体实施方案中，在例如16小时的培养孵育期后，分离重组噬菌体的所得混合物。已知用于从培养物分离噬菌体混合物的各种方法，诸如例如用聚乙二醇和NaCl的浓缩溶液从细菌培养物上清液中沉淀。然后将展示大量的本发明支架的随机化文库成员的分离的噬菌体混合物重悬浮于合适的缓冲液例如含20％(v/v)甘油的PBS中，并等分试样用于在-80℃下储存。其它合适的储存缓冲液和储存条件是本领域技术人员熟知的并且可以被替代。通常，通过该方法获得的噬菌体滴度为每毫升10

在另一实施方案中，包含在其各自的噬菌体颗粒上展示的大量的个体随机化本发明支架的这些噬菌体文库原种(stock)用作通过本领域技术人员熟知的选择方法来获得对期望的靶标的高亲和力结合物的来源。这种选择对靶标的结合物的方法存在许多可能的变化，例如，使用在其表面上过表达期望的靶标分子的细胞(以获得针对蛋白质复合物的结合物)、或针对细菌或病毒颗粒进行选择(以获得针对传染性因子的治疗候选物)、或活体动物中的体内选择(以获得肿瘤或组织特异性结合物)、或针对从上述获得的组分进行选择。在一些实施方案中，这些方法涉及允许将靶标分子固定至固体支撑体，与噬菌体文库一起孵育预定的时间间隔，洗去未结合的噬菌体文库成员，并使用洗脱缓冲液(诸如，例如，酸性缓冲液如含有100mM甘氨酸的缓冲液pH 2.2)来洗脱与期望的靶标分子结合的噬菌体文库成员。存在大量的本领域技术人员熟知的其它洗脱方法，例如使用碱性pH的缓冲液，使用蛋白酶如胰蛋白酶，高盐缓冲液，与未标记的靶标竞争以释放结合物，与已知结合靶标的其它分子竞争，使用改变靶标结构的条件，以及可以容易地使用的其它技术。

在一个实施方案中，洗脱的噬菌体文库成员随后用于感染合适的大肠杆菌菌株并生成富集的噬菌体文库成员的多个拷贝，然后将其用于随后的选择循环以获得结合克隆的进一步富集。

在本发明的另一实施方案中，通过将选择输出与变体环区的集合重组以生成富集文库成员的变体的群体，可以进一步增加在富集过程的各个阶段获得的选择输出的多样性。在其它实施方案中，可以通过例如用随机化变体取代环区、随机化另外的环区、或产生支架框架的变体来引入此类变体。在一个实施方案中，PCR可用于将从选择输出获得的DNA与编码变体环区的DNA片段重组，并且这些也可用于生成展示富集文库成员的变体的噬菌体。使用这些类型的富集文库成员变体中的一些或全部的进一步选择循环可用于获得具有诸如例如增加的亲和力等期望性质的更多样化的靶结合克隆。因此，在一个实施方案中，可以获得包含使用三核苷酸偶联或简并密码子产生的环变体的混合物的文库成员，以及包含通过许多其它众所周知的方法引入的变异的文库成员。

在本发明的具体实施方案中，用生物素标记靶标，随后将生物素化的靶标捕获至用链霉亲和素、中性亲和素、或本领域技术人员已知的类似生物素结合分子包被的表面。在一些实施方案中，可以采用包被有生物素结合表面的顺磁珠。在该方法中，可以精确控制靶标分子的浓度(例如，在500nM至50pM或更低之间)，这有助于高亲和力结合文库成员的选择。当然，靶标呈递和选择条件中存在许多变化，这些变化是众所周知的并且可以被本领域技术人员使用。

在另一实施方案中，在多个选择循环后，获得了已富集以与期望的靶标结合的噬菌体文库克隆的群体。编码具有结合活性的本发明支架的蛋白的单个噬菌粒克隆包含在该群体中。编码这些结合物的基因可以通过噬菌粒的DNA纯化、或PCR扩增、或本领域技术人员已知的多种其它方法来获得，并且多肽序列可以从其DNA序列推导出，所述DNA序列可以通过本领域技术人员熟知的DNA测序技术容易地获得。在另一实施方案中，在亚克隆至适当的表达载体中后，可以使用多种纯化程序从本领域技术人员熟知的多种宿主细胞或体外翻译系统中纯化感兴趣的单个本发明支架。可以使用诸如ELISA和表面等离子体共振等技术、或本领域技术人员熟知的各种其它技术来表征单个结合物的结合亲和力和特异性。

本发明的进一步实施方案涉及编码本发明支架的结合蛋白或融合蛋白的多核苷酸，包含所述多核苷酸的载体，和包含所述多核苷酸和/或所述载体的宿主细胞。多核苷酸可以是DNA、RNA或其任何其它类似物。存在可用于适应多种目的本领域技术人员已知的许多载体和宿主细胞。这样的目的可以包括(但不限于)例如蛋白质生产、或基因治疗、或展示或编码感兴趣的蛋白的病毒颗粒的生产。本领域技术人员将能够从许多众所周知的选项中选择多核苷酸、载体和宿主细胞，并通过常规方法确认它们的适用性。

在本发明的另一实施方案中，包含含有本发明支架的多肽的编码区的多核苷酸可以用于通过施用所述多核苷酸以在体内产生所述多肽，用于例如治疗疾病的目的。在一个实施方案中，编码所述多肽的核苷修饰的RNA可以在基于聚合物基于或脂质的制剂中静脉内施用，以使得能够在患者的体内翻译核酸和产生多肽。

在其它实施方案中，本发明涉及本发明支架及其衍生的融合蛋白的表达和纯化。

在一个实施方案中，这包括：(a)将编码结合靶标配体的支架的核酸分子分离，(b)将核酸与表达载体可操作地连接，和(c)在细胞中表达已与表达载体可操作地连接的核酸。

本领域技术人员熟知，许多宿主生物体，例如大肠杆菌和其它细菌菌株、酵母和其它真核细胞包括哺乳动物和昆虫细胞、多细胞生物体、以及无细胞表达系统可用于重组蛋白生产。此外，可以在多种表达载体和表达方法之间进行选择。本发明支架可以通过本领域技术人员熟知的多种已确立的方法来生产和纯化。方法的适用性取决于所用的宿主生物体、所用的表达载体和表达策略、以及本领域技术人员已知的其它因素。因此，在一些实施方案中，本领域技术人员可以容易地使用这些熟知的重组蛋白生产方法。

在具体实施方案中，本发明支架的纯化可以通过对某些材料具有已知的亲和力的亲和标签肽序列的融合来简化。例如，某些标签如多组氨酸标签、FLAG标签、Strep标签、谷胱甘肽S-转移酶、和许多其它标签是本领域技术人员熟知的，并且可以用于许多亲和纯化方案。例如，这些标签可以方便地与感兴趣的重组蛋白融合，并用于通过固定在树脂上或柱等中的它们各自的亲和配偶体而从复合混合物中选择性捕获重组蛋白。在另一实施方案中，本发明支架的结合靶标(或结合靶标的变体)其自身可被本领域技术人员用于亲和纯化方案中。在本发明的进一步具体实施方案中，可以通过工程化亲和标签和支架之间的蛋白酶切割位点而从本发明支架的重组结合蛋白中去除这样的亲和标签。许多蛋白酶位点如烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶、凝血酶、因子Xa和许多其它蛋白酶位点是本领域技术人员熟知的，并且可以自由选择。

在另一实施方案中，获得的本发明支架可以以未修饰的状态使用，或者可以通过构建多种融合蛋白如双特异性或多特异性结合分子、或与多种其它组分融合来进一步修饰。所述融合物和以下实施方案中描述的那些，可以通过例如但不限于二聚化结构域、共价异肽键、化学交联、二硫键、氨基酸接头、或本领域技术人员熟知的其它手段来形成。在一个具体实施方案中，所述氨基酸接头包括可溶性和柔性多肽接头，包含小的和/或亲水性氨基酸如甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸残基，尽管本领域技术人员可以使用许多其它氨基酸组合来产生具有期望的性质的接头。

因此，在另一实施方案中，本发明涉及包含至少两种本发明支架以生成双特异性或二价融合分子的融合蛋白。在另一实施方案中，本发明支架也可以融合以生成多特异性和/或多价融合分子。

在另一实施方案中，本发明还涉及融合蛋白，所述融合蛋白包含与例如scFv或具有结合活性的其它结构域等另外的结合结构域融合的一种或更多种本发明支架以生成多特异性和/或多价靶结合蛋白。

在另外的实施方案中，本发明涉及本发明支架与一种或更多种蛋白的融合，其共价或非共价缔合以形成多蛋白复合物，从而产生具有多价和/或多特异性结合活性的蛋白复合物。所述融合体可以通过例如但不限于二聚化结构域、化学交联、二硫键、异肽键、氨基酸接头、或本领域技术人员熟知的其它手段形成。

在另外的实施方案中，本发明涉及融合蛋白，其包含与功能性Fc结构域融合的一种或更多种本发明支架，在一些具体实施方案中，所述功能性Fc结构域是人Fc结构域。这可以包括N-末端或C-末端Fc-融合、或与Fc结构域的内部区域融合、或与这些的组合融合。此外，所得融合蛋白可以包含对不同配体靶标具有特异性的本发明的不同结合支架，从而产生双特异性或多特异性配体结合融合蛋白。在另一实施方案中，一种或更多种本发明支架也可以与现有抗体融合以产生增强的功能，诸如，例如多特异性结合。在仍另一实施方案中，Fc结构域可用于将生物体的免疫应答靶向或重定向至本发明的结合蛋白的特异性结合位点。

在进一步实施方案中，采用一种或更多种本发明支架的单价、双特异性或多特异性构建体可用于免疫治疗应用，例如开发CAR-T细胞样疗法。其它实例包括(但不限于)在癌细胞周围局部地或全身地募集T细胞或抑制免疫检查点。本领域技术人员了解可以有效利用以实现该目的的许多生物靶标和免疫系统机制。

在另一实施方案中，本发明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包含与药学上和/或诊断上活性组分融合的一种或更多种本发明支架。本发明支架的融合蛋白可以包含非多肽组分如非肽接头、非肽配体或治疗上或诊断上相关放射性核素。在具体实施方案中，这样的药学上和/或诊断上活性组分可以选自包括以下这样的分子的组：细胞因子、毒性化合物、趋化因子、配体、受体、荧光染料、光敏剂、促凝血因子、抗凝血因子、用于前药活化的酶、和放射性核素。存在本领域技术人员已知的许多其它药学上和/或诊断上活性组分，并且本发明不限于本文列出的代表性实例。

在另一实施方式中，本发明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包含与调节血清半衰期的组分融合的一种或更多种本发明支架，所述组分例如但不限于聚乙二醇(PEG)、免疫球蛋白和白蛋白结合肽。本领域技术人员可以选择适合作为融合配偶体、也适用于延长血清半衰期的目的的另外的大分子或结合结构域。

在本发明的具体实施方案中，包含本发明支架的重组蛋白基本上不在哺乳动物诸如例如小鼠、大鼠、猴或人中引发免疫原性反应。因此，本发明的实施方案涉及生成具有降低的免疫原性的本发明支架的衍生物。当然，本发明支架的衍生物的免疫原性不仅取决于支架衍生的部分，也取决于融合蛋白的随机化区域和其它部分。多种软件和数据库可用于与MHC分子的结合的肽的计算机预测，并且本领域技术人员可以使用这样的软件或数据库作为辅助以产生本发明的重组支架的衍生物，以及包含具有降低的免疫原性风险的本发明的重组支架的融合构建体。在一个具体实施方案中，通过检索预测与MHC II类分子结合的肽的免费可用数据库，发现包含野生型海栖热袍菌CheB

在一些实施方案中，本发明支架包含具有改善的可开发性的多肽序列变体。此类变体可包括例如缺少半胱氨酸残基的变体、缺少预测的N-糖基化位点的变体、以及具有降低的预测的降解风险的变体，如预测的脱酰胺、异构化、氧化、片段化、和聚集。在一个具体实施方案中，通过并入氨基酸残基取代Cys161Ser来修饰SEQ ID NO:80能够生成无半胱氨酸的支架。对于本领域技术人员来说，通过使用熟知的技术来生成具有改善的质量的另外的支架序列变体是微不足道的。

在其它实施方案中，预期本发明的文库将生成高度稳定和可溶性靶标结合候选物，具有高特异性和亲和力，使得它们特别适用于治疗和/或诊断应用。因此，本发明的高度相关的实施方案涉及本发明支架或其融合衍生物用于制备药物或诊断工具的用途。

在一个具体实施方案中，一种或更多种本发明支架、或其融合衍生物用于制备用于疾病的治疗或诊断的药物或诊断手段，在另一具体实施方案中，用于诊断或治疗癌症、心血管疾病、传染病、或炎性疾病。

在一个具体实施方案中，一种或更多种本发明支架、或其融合衍生物用于制备诊断手段，所述诊断手段包括利用表面等离子体共振用于检测结合复合物的装置、用于诊断癌症或心血管疾病、传染病或炎性疾病的装置。

本发明的另一实施方案涉及药物或诊断组合物，其包含一种或更多种本发明支架、或其融合衍生物、并在合适的情况下包含药学上可接受的赋形剂和/或载体。本领域技术人员将能够从丰富的现有技术中选择合适的赋形剂和载体，并且能够使用常规方法确定它们的适用性。

在另一实施方案中，为了治疗或诊断怀疑患有疾病的受试者中的疾病，一种或更多种本发明支架、或其融合衍生物可以以多种形式或模式施用，这使得化合物以有效量可用。许多施用途径是本领域技术人员熟知的，并且包括(但不限于)口服、皮下、肌内、静脉内、腹膜内、皮内、脊柱、局部、鼻内、和眼内等，并且最合适的可以基于诸如例如从体内实验获得的药代动力学数据、常规医学实践、和本领域技术人员广泛可获得的其它知识来源来容易地选择。在一些实施方案中，NMR、PET、CT、荧光成像、和各种其它众所周知的体内成像技术可用于使用一种或更多种本发明支架或其衍生物来诊断疾病。

本发明的另一实施方案涉及与另外的治疗剂的共同施用或治疗，例如细胞因子、类固醇、化学治疗剂、抗生素、放射或本领域熟知的其它治疗剂和治疗。这是增强药物治疗效果的众所周知的方法。可以基于本领域技术人员已知的各种相关因素来选择另外的疗法的适当剂量、组合和时机。

本发明还提供了通过利用本发明支架来检测化合物的方法。基于通过文库筛选而获得的支架的结合特异性，可以在测定中使用这样的支架以检测样品中的特异性靶标，例如用于诊断方法。在一个实施方案中，检测化合物的方法包括在允许化合物:支架复合物形成的条件下使样品中的所述化合物与本发明支架接触，检测所述支架，从而检测样品中的所述化合物。在进一步实施方案中，标记支架(例如，放射性标记、荧光、酶联或比色标记)以促进所述化合物的检测。在进一步实施方案中，利用本发明支架或其衍生物的体内植入装置的使用可用于检测感兴趣的化合物。

本发明还提供了利用本发明支架捕获化合物的方法。基于通过文库筛选而获得的支架的结合特异性，可以在测定中使用这样的支架以捕获样品中的特异性靶标，例如用于纯化方法。在一个实施方案中，捕获样品中的化合物的方法包括在允许形成化合物:支架复合物的条件下，使样品中的所述化合物与本发明支架接触，从样品中去除所述复合物，从而捕获所述样品中的所述化合物。在进一步实施方案中，固定支架以促进化合物:支架复合物的去除。

本领域技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同物。本文所述的发明旨在涵盖此类等同物。

示例性实施方案

1.一种重组多肽支架，其包含重组CheB

(i)对应于SEQ ID NO:1的同源环区的十四个环区，SEQ ID NO:1的同源环区由以下残基组成：

(a)从16至18，包括端点；

(b)从29至37，包括端点；

(c)从43至47，包括端点；

(d)从60至61，包括端点；

(e)从66至75，包括端点；

(f)从80至84，包括端点；

(g)从92至93，包括端点；

(h)从103至107，包括端点；

(i)从124至125，包括端点；

(j)从135至137，包括端点；

(k)从149至150，包括端点；

(l)从160至162，包括端点；

(m)从173至176，包括端点；

(n)从180至181，包括端点，

(ii)与对应于SEQ ID NO:1的非环区的二级结构元件连接和；

其中所述环区的至少一个是SEQ ID NO:1的同源环区的非天然存在的变体，和；

与SEQ ID NO:1在非天然存在的变体环区外具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％氨基酸序列同一性。

2.实施方案1所述的支架，其包括：四个框架区FR1(SEQ ID NO:40)、FR2(SEQ IDNO:41)、FR3(SEQ ID NO:42)、和FR4(SEQ ID NO:43)的线性序列，其中框架区与SEQ ID NO:1的同源区具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％氨基酸序列同一性；由环区连接，其中至少一个环区是SEQ ID NO:1的同源环区的非天然存在的变体。

3.实施方案2所述的支架，其包括：四个框架区FR1(SEQ ID NO:40)、FR2(SEQ IDNO:41)、FR3(SEQ ID NO:42)、和FR4(SEQ ID NO:43)，其中框架区与SEQ ID NO:1的同源区具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％氨基酸序列同一性；和三个环区L1(SEQ ID NO:44)、L2(SEQ ID NO:44)、和L3(SEQ ID NO:47)，其中Xaa表示任何氨基酸；

和其中L1在FR1和FR2之间连接、L2在FR2和FR3之间连接、和L3在FR3和FR4之间连接以形成包含排列FR1-L1-FR2-L2-FR3-L3-FR4的连续多肽。

4.实施方案2所述的支架，其包含四个框架区FR1(SEQ ID NO:40)、FR2(SEQ IDNO:41)、FR3(SEQ ID NO:42)、和FR4(SEQ ID NO:43)，其中框架区与SEQ ID NO:1的同源区具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％氨基酸序列同一性；和三个环区L1(SEQ ID NO:45)、L2(SEQ ID NO:46)、和L3(SEQ ID NO:47)，其中Xaa表示任何氨基酸，和其中L1在FR1和FR2之间连接、L2在FR2和FR3之间连接、和L3在FR3和FR4之间连接以形成包含排列FR1-L1-FR2-L2-FR3-L3-FR4的连续多肽。

5.实施方案3所述的支架，其中对于L1、L2和L3环区，Xaa表示丝氨酸、天冬氨酸、精氨酸、丙氨酸、亮氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、色氨酸、甘氨酸、谷氨酸、缬氨酸和酪氨酸。

6.实施方案4所述的支架，其中对于L1和L2环区，Xaa表示任何氨基酸，和；其中对于L3环区，Xaa表示丝氨酸、天冬氨酸、精氨酸、丙氨酸、亮氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、色氨酸、甘氨酸、谷氨酸、缬氨酸和酪氨酸。

7.一种多核苷酸，其编码实施方案1所述的支架。

8.一种细胞，其被基因工程化以表达实施方案7所述的多核苷酸。

9.实施方案1所述的支架，其还包含荧光团、放射性同位素、药物缀合物、酶、血清半衰期延长多肽、或靶标结合多肽。

10.实施方案9所述的支架，其还包含将支架连接至荧光团、放射性同位素、药物缀合物、酶、血清半衰期延长多肽、或靶标结合多肽的具有一个或更多个甘氨酸残基的接头。

11.实施方案1所述的支架，其中支架能够与被另外的靶标结合多肽结合的靶标结合。

12.实施方案11所述的支架，其中靶标结合多肽是多组氨酸标签。

13.实施方案11所述的支架，其中靶标结合多肽是FLAG标签。

14.一种靶标检测装置，其包括实施方案1所述的支架。

15.一种组合物，其包含实施方案1所述的支架和药学上可接受的载体。

16.实施方案1-6中任一项所述的支架，已确定所述支架结合靶标。

17.实施方案1-6中任一项所述的支架，其中已确定所述支架以至少100μM的亲和力(K

18.实施方案17所述的支架，其中所述靶标是细胞表面抗原、可溶性抗原、固定化抗原、免疫静默抗原(immunosilent antigen)、胞内抗原、核内抗原、自身抗原、非自身抗原、癌抗原、细菌抗原、或病毒抗原。

19.实施方案17所述的支架，其中所述支架表现至少40℃的热熔解温度(Tm)。

20.实施方案17所述的支架，其中所述支架与异源试剂缀合，其中所述试剂选自由以下组成的组：聚乙二醇(PEG)、人血清白蛋白(HSA)、抗体的Fc区、IgG分子、细胞毒性药物、显像剂、毒素、生物素、核酸、或细胞因子。

21.一种多结构域构建体，其包括实施方案17所述的支架，其中所述多结构域构建体进一步包括表位结合结构域，其中所述表位结合结构域选自由以下组成的组：实施方案17的另外的支架、与实施方案17无关的支架、抗体、抗体片段、双体抗体(diabody)、scFv、Fab、Fv、或结合肽。

22.实施方案21所述的多结构域构建体，其中所述多结构域构建体识别一种表位。

23.实施方案21所述的多结构域构建体，其中所述多结构域构建体识别两种表位。

24.实施方案21所述的多结构域构建体，其中所述多结构域构建体识别三种或更多种表位。

25.实施方案21-24中任一项所述的多结构域构建体，其中所述支架通过IgG分子或其片段、Fc区、二聚化结构域、二硫键、或氨基酸接头与所述表位结合结构域连接。

26.实施方案21-24中任一项所述的多结构域构建体，其中所述支架通过酶促或化学反应与所述表位结合结构域共价连接。

27.实施方案25-26中任一项所述的多结构域构建体，其还包含荧光团、放射性同位素、药物缀合物、酶、或血清半衰期延长多肽。

28.一种分离的核酸分子，其编码实施方案21-25中任一项所述的多结构域构建体。

29.实施方案28所述的核酸，其与表达载体可操作地连接。

30.一种宿主细胞，其包含实施方案29所述的构建体。

31.一种多肽展示文库，其包含多种实施方案1-6中任一项所述的变体支架。

32.一种分离的核酸分子的集合，所述分离的核酸分子编码根据实施方案31所述的文库。

33.实施方案32所述的核酸分子，其与表达载体可操作地连接。

34.一种获得与靶标结合的多肽支架的方法，所述方法包括(a)在允许形成支架:靶标配体复合物的条件下，使靶标配体与实施方案1-6中任一项所述的文库接触，和(b)从复合物获得与靶标配体结合的支架。

35.实施方案34所述的方法，其还包括随机化步骤(b)的所述支架的至少一个环区以产生进一步随机化的支架，并使用所述进一步随机化的支架重复步骤(a)和(b)。

36.实施方案34所述的方法，其还包括随机化步骤(b)的所述支架的至少一个非环区以产生进一步随机化的支架，并使用所述进一步随机化的支架重复步骤(a)和(b)。

37.一种检测样品中的化合物的方法，所述方法包括在允许形成化合物:支架复合物的条件下，使所述样品与实施方案16-20中任一项所述的支架接触，并检测所述复合物，从而检测所述样品中的所述化合物。

38.一种捕获样品中的化合物的方法，所述方法包括在允许形成化合物:支架复合物的条件下，使所述样品与实施方案16-20中任一项所述的固定化支架接触，并去除所述固定化支架，从而捕获所述样品中的所述化合物。

39.一种检测样品中的化合物的方法，所述方法包括在允许形成化合物:多结构域构建体复合物的条件下，使所述样品与实施方案21-27中任一项所述的多结构域构建体接触，并检测所述复合物，从而检测所述样品中的所述化合物。

40.一种捕获样品中的化合物的方法，所述方法包括在允许形成化合物:多结构域构建体复合物的条件下，使所述样品与实施方案21-27中任一项所述的固定化多结构域构建体接触，并去除所述固定化多结构域构建体，从而捕获所述样品中的所述化合物。

41.一种无菌无热原组合物，其包含实施方案16-20中任一项所述的支架或实施方案21-27中任一项所述的多结构域构建体。

42.一种药物组合物，其包含实施方案41。

43.一种用实施方案41或42所述的组合物预防、治疗、管理或改善患者中的疾病的方法。

44.一种用实施方案41或42所述的组合物诊断或成像患者中的疾病的方法。

45.实施方案43所述的方法，其中所述方法还包括附加疗法，其中所述疗法是免疫疗法、生物疗法、化学疗法、放射疗法、或小分子药物疗法。

46.实施方案43-45中任一项所述的方法，其中所述疾病是自身免疫性疾病、炎性疾病、增殖性疾病、传染病、呼吸疾病、心血管疾病、退行性疾病或代谢病。

47.一种重组非天然存在的多肽支架，其包含重组CheBc结构域，与SEQ ID NO:1在环区外具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％氨基酸序列同一性；并且其中所述环区的至少一个通过从SEQ ID NO:1的相应环区缺失、取代或添加至少一个氨基酸而变化。

48.实施方案47所述的支架，其中所述支架包含两个环区序列，其由SEQ ID NO:1的相应环区通过缺失、取代或添加至少一个氨基酸而变化。

49.实施方案47所述的支架，其中所述支架包含三个环区序列，其由SEQ ID NO:1的相应环区通过缺失、取代或添加至少一个氨基酸而变化。

50.实施方案47所述的支架，其中所述支架包含四个环区序列，其由SEQ ID NO:1的相应环区通过缺失、取代或添加至少一个氨基酸而变化。

51.实施方案47所述的支架，其中所述支架包含五个环区序列，其由SEQ ID NO:1的相应环区通过缺失、取代或添加至少一个氨基酸而变化。

52.实施方案47所述的支架，其中所述支架包含六个环区序列，其由SEQ ID NO:1的相应环区通过缺失、取代或添加至少一个氨基酸而变化。

53.实施方案47所述的支架，其中所述支架包含七个环区序列，其由SEQ ID NO:1的相应环区通过缺失、取代或添加至少一个氨基酸而变化。

54.实施方案47所述的支架，其中所述支架包含八个或更多个的环区序列，其由SEQ ID NO:1的相应环区通过缺失、取代或添加至少一个氨基酸而变化。

55.一种多肽展示文库，其包含多个实施方式47-54中任一项所述的变体支架。

56.一种分离的核酸分子的集合，所述分离的核酸分子编码实施方案55所述的文库。

57.实施方案56所述的核酸分子，其与表达载体可操作地连接。

58.实施方案47-54中任一项所述的支架，已确定其结合靶标。

59.实施方案47-54中任一项所述的支架，已确定其以至少100μM的亲和力(K

60.实施方式59所述的支架，其中所述靶标是细胞表面抗原、可溶性抗原、固定化抗原、免疫静默抗原、胞内抗原、核内抗原、自身抗原、非自身抗原、癌抗原、细菌抗原、或病毒抗原。

61.实施方案59所述的支架，其中所述支架表现出至少40℃的热熔解温度(Tm)。

62.实施方式59所述的支架，其中所述支架与异源试剂缀合，其中所述试剂选自由以下组成的组：聚乙二醇、人血清白蛋白(HSA)、抗体的Fc区、IgG分子、细胞毒性药物、显像剂、毒素、生物素、核酸、或细胞因子。

63.一种多结构域构建体，其包含实施方案59所述的支架，其中所述多结构域构建体还包含表位结合结构域，其中所述表位结合结构域选自由以下组成的组：实施方案59的另外的支架、与实施方案59无关的支架、抗体、抗体片段、双体抗体、scFv、Fab、Fv、或结合肽。

64.根据实施方案63所述的多结构域构建体，其中所述多结构域构建体识别一种表位。

65.根据实施方案63所述的多结构域构建体，其中所述多结构域构建体识别两种表位。

66.根据实施方案63所述的多结构域构建体，其中所述多结构域构建体识别三种或更多种表位。

67.实施方案63-66中任一项所述的多结构域构建体，其中所述支架通过IgG分子或其片段、Fc区、二聚化结构域、二硫键或氨基酸接头与所述表位结合结构域连接。

68.实施方案60-63中任一项所述的多结构域构建体，其中所述支架通过酶促或化学反应与所述表位结合结构域共价连接。

69.实施方式67-68中任一项所述的多结构域构建体，其还包含荧光团、放射性同位素、药物缀合物、酶、或血清半衰期延长多肽。

70.一种分离的核酸分子，其编码实施方案63-67中任一项所述的多结构域构建体。

71.实施方案70所述的核酸，其与表达载体可操作地连接。

72.一种宿主细胞，其包含实施方案71所述的构建体。

73.一种检测样品中的化合物的方法，所述方法包括在允许形成化合物:支架复合物的条件下，使所述样品与实施方案58-62中任一项所述的支架接触，并检测所述复合物，从而检测所述样品中的所述化合物。

74.一种捕获样品中的化合物的方法，所述方法包括在允许形成化合物:支架复合物的条件下，使所述样品与实施方案58-62中任一项所述的固定化支架接触，并去除所述固定化支架，从而捕获所述样品中的所述化合物。

75.一种检测样品中的化合物的方法，所述方法包括在允许形成化合物:多结构域构建体复合物的条件下，使所述样品与实施方案63-69中任一项所述的多结构域构建体接触，并检测所述复合物，从而检测所述样品中的所述化合物。

76.一种捕获样品中的化合物的方法，所述方法包括在允许形成化合物:多结构域构建体复合物的条件下，使所述样品与实施方案63-69中任一项所述的固定化多结构域构建体接触，并去除所述固定化的多结构域构建体，从而捕获所述样品中的所述化合物。

77.一种无菌无热原的组合物，其包含实施方案58-62中任一项所述的支架或实施方案63-69中任一项所述的多结构域构建体。

78.一种药物组合物，其包含实施方案77。

79.一种用实施方案77或78所述的组合物预防、治疗、管理或改善患者中的疾病的方法。

80.一种用实施方案77或78所述的组合物诊断或成像患者中的疾病的方法。

81.实施方案79所述的方法，其中所述方法还包括附加疗法，其中所述疗法是免疫疗法、生物疗法、化学疗法、放射疗法、或小分子药物疗法。

82.实施方案79-81中任一项所述的方法，其中所述疾病是自身免疫性疾病、炎性疾病、增殖性疾病、传染病、呼吸疾病、心血管疾病、退行性疾病、或代谢病。

通过以下实施例和附图以及序列信息进一步说明本发明。

实施例

现在参考以下实施例描述本发明。提供这些实施例仅用于说明的目的，并且本发明决不应被解释为限于这些实施例，而是应被解释为涵盖作为本文提供的教导的结果而产生的任何和所有变体。

实施例1

本发明支架的随机化设计

本发明支架的多肽序列的优化

期望本发明支架基本上不在哺乳动物包括例如人中引发免疫原性反应。针对预测与MHC-II分子DRB1_0101、DRB1_0301、DRB1_0401、DRB1_0701、DRB1_0802、DRB1_1101、DRB1_1302、和DRB1_1501(Jensen K.等人,2018)结合的肽的数据库，筛选包含海栖热袍菌的野生型CheB

本发明支架的重组测试环移植物构建体的生成

分析包含海栖热袍菌的野生型CheB

将包含SEQ ID NO：1的编码区的多核苷酸设计为具有侧翼EcoRI和AscI限制性酶切位点，以生成编码相应多肽SEQ ID NO:4的合成DNA(SEQ IDNO:7)。该合成DNA(SEQ IDNO:7)获得自FASMAC(Japan)并用作PCR模板。

使用图10的方案中所示并列于表1中的合适的侧翼引物、通过PCR、从DNASEQ IDNO:7扩增编码本发明支架的框架区的DNA片段，FR1(SEQ IDNO:81)、FR2(SEQ ID NO:82)、FR3(SEQ ID NO:83)、和FR4(SEQ ID NO:84)。对于要扩增的各个框架区片段编码DNA，使用每50微升反应100fmol的DNA模板进行PCR扩增。在55℃退火温度下、根据制造商的说明使用Pfu Ultra II Fusion HS DNA聚合酶(Agilent)进行PCR反应20个循环。

包含测试环移植物1(SEQ ID NO:37)、测试环移植物2(SEQ ID NO:38)和测试环移植物3(SEQ ID NO:39)的编码区的合成寡核苷酸获得自FASMAC(Japan)。将这些与编码框架区的凝胶纯化DNA片段组装，从而生成编码以下的DNA片段：在位置2和3具有测试环移植物的本发明支架的测试环移植物构建体(SEQ ID NO:12)、在位置1和2具有测试环移植物的本发明支架的测试环移植物构建体(SEQ ID NO:13)、在位置1和3具有测试环移植物的本发明支架的测试环移植物构建体(SEQ ID NO:14)、以及在位置1和2和3具有测试环移植物的本发明支架的测试环移植物构建体(SEQ ID NO:15)(相应的多肽序列比对示于图6)。使用每50微升反应100fmol的各DNA，通过连续轮次的重叠延伸PCR反应来进行邻近DNA片段的组装。在每个扩增步骤之间凝胶纯化PCR产物并用作下一轮重叠延伸PCR组装的模板，直至获得全长产物。重叠延伸PCR的最后一步使用引物EcoRIF和AscIR(表1)以将EcoRI和AscI限制性位点附加至组装产物。将PCR产物凝胶纯化，并在37℃下用20倍过量的EcoRI-HF和AscI(New England Biolabs)消化3小时，然后用Wizard SV凝胶和PCR Clean-Up系统(Promega)对消化的DNA进行柱纯化。将所得DNA插入物克隆至包含相应EcoRI和AscI克隆位点的修饰的pQE-80L载体(QIAGEN)，并转化至大肠杆菌XL1-Blue(Agilent)中。对分离的质粒克隆进行测序，并鉴定了编码包含以下的多肽的克隆：在位置2和3具有测试环移植物的本发明支架的重组测试环移植物构建体(SEQ ID NO:8)、在位置1和2具有测试环移植物的本发明支架的重组测试环移植物构建体(SEQ ID NO:9)、在位置1和3具有测试环移植物的本发明支架的重组测试环移植物构建体(SEQ ID NO:10)、和在位置1和2和3具有测试环移植物的本发明支架的重组测试环移植物构建体(SEQ ID NO:11)。

本发明支架的重组测试环移植物构建体的表达和纯化

序列验证的克隆的甘油原种用于接种含有50微克/mL卡那霉素和0.1％葡萄糖的2xYT培养基的50mL培养物，并在37℃、在剧烈振荡下生长直至OD

本发明支架的重组测试环移植物构建体的热稳定性

包含本发明支架的重组测试环移植物构建体的纯化蛋白的热稳定性通过DSF(差示扫描荧光法)测定、用SYPRO橙色染料(Merck)、用PBS缓冲液(pH7.4)中500微克/mL的蛋白、在0.5℃/min的扫描速率下确定(图9)。从荧光强度的一阶导数曲线的最大值处的温度确定蛋白质的熔解温度。蛋白质的熔解温度报告于表2中。对于所评价的本发明支架的所有重组测试环移植物构建体，观察到约90℃的熔解温度，并且在不同测试构建体之间观察到仅几度的热稳定性的差异(Tm范围89.4-92.0℃)。这表明本发明支架可以能够支持多种比本文评价的测试环移植物组合更广泛的修饰，并且本领域技术人员和知晓这些发现的人员可以通过常规实验在生成和利用此类变体方面具有成功的合理预期。

单体级分的测定

在4℃下、在PBS缓冲液(pH 7.4)中以1mg/mL储存2周，然后在室温下储存2周后，通过尺寸排阻色谱法来测定包含在位置1和2和3具有测试环移植物的本发明支架的测试环移植物构建体(SEQ.ID NO.11)的纯化蛋白的单体级分。在Superdex 75 10/300柱(GELifesciences)上用PBS缓冲液(pH 7.4)中500微克的蛋白进行SEC(图8)。发现纯化的蛋白为96.4％单体。实验确定的单体质量为22.6kDa，其与约24kDa的预测分子量相差很小。

实施例2

本发明支架的随机文库的构建

使用图10的方案中所示并列于表1中的合适的侧翼引物、通过PCR、从DNASEQ IDNO:7扩增分别编码框架区FR1(SEQ ID NO:40)、FR2(SEQ IDNO:41)、FR3(SEQ ID NO:42)、和FR4(SEQ ID NO:43)的DNA片段SEQ IDNO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、和SEQ ID NO:84。对于要扩增的各个框架区编码DNA，使用每50微升反应100fmol的DNA模板进行8次单独的PCR扩增。在72℃退火温度下、根据制造商的说明使用Phusion Hot Start Flex DNA聚合酶(New England Biolabs)进行PCR反应20个循环。使用Wizard SV凝胶和PCR Clean-Up系统(Promega)对PCR产物进行凝胶纯化。

分别包含编码三核苷酸随机化环区L1(SEQ ID NO:44)、L2(SEQ ID NO:44)和L3(SEQ ID NO:47)的DNA序列的三核苷酸偶联寡核苷酸SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、和SEQID NO:18(图10)获得自ELLABiotech GmbH(Germany)。将这些溶解在TE缓冲液(10mM Tris，5mM EDTApH 8.0)中至50μM。

使用表1中列出的合适的引物、通过重叠延伸PCR来进行将随机化环区编码DNA片段组装至框架DNA编码片段的第一阶段(第一PCR组装)。进行三种分别的PCR组装方案以组装DNA片段，包括FR1+L1的编码区(使用引物FR1F和L1R)以生成编码FR1-L1的片段，包括FR2+L2的编码区(使用引物FR2F和L2R)以生成编码FR2-L2的片段，和包括FR3+L3+FR4的编码区(使用引物FR3F和FR4R)以生成编码FR3-L3-FR4的片段，如图11中图示。总共对每个方案进行5个重复的100微升PCR反应，每个反应包含500fmole的随机化环片段DNA模板。在72℃退火温度下、使用Phusion Hot Start Flex DNA聚合酶(New England Biolabs)进行PCR 18个循环。如上所述凝胶纯化各个片段组件。

使用外部引物EcoRIF和AscIR(表1)、用每50微升PCR反应管125fmole的上述各个片段组件、通过重叠延伸PCR来进行将上述片段最终组装为全长随机化文库编码DNA片段，所述DNA片段包括FR1-L1-FR2-L2-FR3-L3-FR4的编码区，包含三个三核苷酸偶联随机化环区(第二PCR组装)。总共，176个PCR反应管用于在72℃退火温度下扩增全长片段组装体20个循环。

包含NNK随机化编码环区的全长随机化文库编码DNA片段的生成如下进行。分别包含编码NNK随机化环区L1(SEQ ID NO:45)和L2(SEQ ID NO:46)的DNA序列的寡核苷酸SEQID NO:19和SEQ ID NO:20获得自FASMAC(Japan)。包含编码三核苷酸随机化环区L3(SEQ IDNO:47)的DNA序列的三核苷酸偶联寡核苷酸SEQ ID NO:18获得自ELLA Biotech GmbH(Germany)。

除了使用外部引物EcoRIF和AscIR(表1)、用每50微升PCR反应管125fmole的各个组装的片段、通过重叠延伸PCR来将片段最终组装成全长随机化文库编码DNA片段(第二PCR组装)以外，如上所述进行随机化环区编码DNA片段至框架DNA编码片段的组装。总共，112个PCR反应管用于在72℃退火温度下扩增全长片段组装体20个循环。

将对应于包含三个三核苷酸偶联随机化环区的全长随机化文库编码DNA片段和包含NNK随机化环区的全长随机化文库编码DNA片段的PCR产物如上所述单独地凝胶纯化。随后将这两种文库分别克隆并在噬菌体上展示。

总共，在37℃下、在2.4mL体积中用各1400U的EcoRI-HF和AscI(New EnglandBiolabs)消化72微克的包含三个三核苷酸偶联随机化环编码区的凝胶纯化全长随机化文库编码DNA片段7小时，以产生用于连接的文库插入物。此外，在37℃下、在1.6mL体积中用各960U的EcoRI-HF和AscI(New England Biolabs)消化48微克的包含NNK随机化环编码区的凝胶纯化全长随机化文库编码DNA片段7小时，从而生成用于连接的文库插入物。然后使用Wizard SV凝胶和PCR Clean-Up系统(Promega)分别对所得消化的插入物DNA进行柱纯化。

包含EcoRI和AscI限制性酶切位点的修饰的pADL-10b噬菌粒载体(AntibodyDesign Labs)用于构建文库和生成本发明支架与噬菌体pIII蛋白的融合体，用于在噬菌体颗粒上展示。在37℃下，用各3000U的EcoRI-HF和AscI(New England Biolabs)在4mL体积中消化该载体的1mg等分试样3小时，以产生用于连接的消化的载体DNA。如上所述凝胶纯化对应于消化的载体DNA的DNA片段。

在16℃下，用10,000U的T4 DNA连接酶(New England Biolabs)在2.5mL体积中建立15.5微克的消化的载体和5微克的上述消化的插入物(插入物:载体为约2:1摩尔比)的单独连接过夜。在65℃下加热连接物15分钟，并使用Amicon Ultra 30K MWCO柱(Millipore)、通过重复旋转和水置换将连接缓冲液更换为milliQ超纯水。

从在TB培养基中剧烈生长直至OD

实施例3

本发明支架的随机化文库的噬菌体展示

将上述本发明支架的随机化文库的大肠杆菌甘油原种的等分试样解冻，并在总共5升的2xYT培养基(对于包含三个三核苷酸偶联随机化环区的文库)和1升的2xYT培养基(对于包含NNK随机化环区的文库)中稀释，得到OD

在4℃下以8000xg离心培养物20分钟，并小心地回收包含噬菌体颗粒的上清液。将这些在冰上冷却，添加0.25x体积的20％(w/v)PEG、2.5M NaCl，在冰上放置1小时以沉淀噬菌体。在4℃下以8000xg离心沉淀物30分钟，并通过重悬浮于PBS来洗涤噬菌体沉淀。然后如前所述用20％(w/v)PEG、2.5MNaCl沉淀，并通过重悬浮于PBS来再次洗涤噬菌体沉淀。将这些再次沉淀并重悬浮于PBS，添加甘油至最终体积为20％。然后将噬菌体等分成0.6mL体积(对于包含三个三核苷酸偶联的随机化环区的文库)和0.09mL体积(对于包含NNK随机化环区的文库)，并在-80℃下储存，作为噬菌体文库原种。

实施例4

从支架噬菌体展示文库选择结合物

针对靶标PD-L1和HER2的本发明支架的文库的第一轮噬菌体展示选择

如下将包含人IgG1 Fc结构域的生物素化人PD-L1抗原和包含一部分的HER2胞外结构域的生物素化人HER2抗原(Acro Biosystems)单独地用作淘选靶标。

对于每种靶标，将两种噬菌体文库原种(包含三个三核苷酸偶联随机化环区，和包含NNK随机化环区)的每一种的等分试样解冻并合并。添加封闭试剂(PBS中添加BSA至3％(w/v)和添加Tween-20至0.05％(v/v))，得到1mL的最终体积。对于PD-L1靶标选择，还添加非生物素化人IgG1 Fc蛋白(Acro Biosystems)作为封闭试剂至1000pM终浓度。然后将200微升等分试样的Dynal M-280免疫磁珠(dynabead)悬浮液(Invitrogen)在含有3％ BSA、0.05％Tween-20的PBS中洗涤两次，并将封闭的噬菌体添加至洗涤的免疫磁珠并在4℃下旋转1小时以去除与珠结合的噬菌体。然后通过磁体收集珠，并将噬菌体上清液转移至新管中。然后将生物素化抗原添加至噬菌体上清液至终浓度为50nM，并通过在4℃下旋转混合物过夜使噬菌体与抗原结合。此后，将100微升的免疫磁珠悬浮液在PBS、3％ BSA、0.05％Tween-20中洗涤两次，并弃去上清液。然后将噬菌体和抗原混合物加入至含有洗涤的免疫磁珠的管中，并通过在4℃下旋转混合物30分钟来将生物素化抗原捕获在免疫磁珠上。此后，通过磁体收集免疫磁珠以拉下(pull down)与捕获在免疫磁珠的表面上的生物素化抗原结合的噬菌体，并用PBS、3％ BSA、0.05％ Tween-20的1mL溶液洗涤珠3次。然后如上所述用PBS、0.05％ Tween-20洗涤珠3次，然后用PBS洗涤3次。然后通过磁体收集珠并弃去上清液，通过用300微升的100mM甘氨酸、500mM NaCl(pH 2.2)孵育珠10分钟来洗脱结合的噬菌体。然后再次通过磁体捕获珠，并将含有洗脱的噬菌体的上清液添加至15mL体积的2xYT培养基中OD

第一轮文库选择输出的L1和L3环的随机化

如下进行各个选择输出的L1环和L3环的随机化。通过使用FastGene PlasmidMini试剂盒(NIPPON Genetics,Japan)从上述第一轮淘选选择输出大肠杆菌甘油原种的等分试样中分离重组噬菌粒DNA池。对于L1环随机化，引物FR2F和AscIR(表1)用于扩增不具有L1环编码区的第一轮选择输出文库DNA片段池。对于各个要扩增的DNA片段池，使用两个50微升反应中各8fmol的DNA模板进行PCR扩增。在72℃退火温度下、根据制造商的说明使用Phusion Hot Start Flex DNA聚合酶(New England Biolabs)进行PCR扩增18个循环。使用Wizard SV凝胶和PCR Clean-Up系统(Promega)对PCR产物进行凝胶纯化。这些片段通过PCR与编码FR1-L1的DNA片段(图11)连接，所述DNA片段先前在文库构建期间产生(实施例2)，并且包含通过三核苷酸偶联产生的随机化环1编码区。引物EcoRIF和AscIR(表1)用于在7个50微升PCR反应中连接各个靶标的片段，每个PCR反应包含125fmol的各个模板，72℃退火温度12个循环。如上所述对PCR产物进行凝胶纯化。对于L3环随机化，引物EcoRIF和L2R(表1)用于PCR扩增不具有L3环编码区的第一轮选择输出文库支架DNA。对于各个要扩增的DNA片段池，使用两个50微升反应各8fmol的DNA模板进行PCR扩增。在72℃退火温度下、根据制造商的说明使用Phusion Hot Start Flex DNA聚合酶(New England Biolabs)进行PCR扩增18个循环。使用Wizard SV凝胶和PCR Clean-Up系统(Promega)对PCR产物进行凝胶纯化。这些片段通过PCR与编码FR3-L3-FR4的DNA片段(图11)连接，所述DNA片段先前在文库构建期间产生(实施例2)，并且包含通过三核苷酸偶联产生的随机化环3编码区。引物EcoRIF和AscIR(表1)用于在7个50微升PCR反应中连接各个靶标的片段，每个PCR反应包含125fmol的各个模板，72℃退火温度12个循环。如上所述对PCR产物进行凝胶纯化。将包含所得环1和环3随机化第一轮淘选选择输出编码DNA池的PCR产物组合，并在37℃下用各100U的EcoRI-HF和AscI(New England Biolabs)消化5微克的该DNA4小时。然后使用Wizard SV凝胶和PCRClean-Up系统(Promega)对消化的DNA进行柱纯化，以产生环1和环3随机化第一轮淘选选择输出插入物DNA。在16℃下、用5,000U的T4 DNA连接酶(New England Biolabs)、在1.25mL体积中进行7.75微克的消化的噬菌粒载体(用于实施例2中的文库构建)和2.5微克的上述环1和环3随机化第一轮淘选选择输出插入物DNA(插入物:载体为约2:1摩尔比)的连接过夜。在65℃下加热连接物10分钟，并使用Amicon Ultra 30K MWCO柱(Millipore)、通过重复旋转和水置换将连接缓冲液更换为milliQ超纯水。然后，使用对于文库构建方案(实施例2)所述的过程，将这些连接物各自转化至电感受态大肠杆菌菌株XL1-Blue(Agilent)中，收获各个转化培养物，并在37℃下在含有TB琼脂、2％葡萄糖和100微克/mL氨苄青霉素的大500cm

针对靶标PD-L1和HER2的第二轮和第三轮噬菌体展示选择

将随机化第一轮淘选选择输出的各个大肠杆菌甘油原种的等分试样解冻并在500mL的2xYT培养基中稀释，得到OD

在4℃下以8000xg离心各个过夜培养物的50mL等分试样20分钟，小心地回收含有噬菌体颗粒的上清液并通过0.45微米过滤器(Sartorius)过滤。在冰上冷却这些滤液，添加0.25x体积的20％(w/v)PEG、2.5M NaCl，并在冰上放置1小时以沉淀噬菌体。在4℃下以8000xg离心沉淀物30分钟，并将噬菌体沉淀单独重悬浮于500微升的PBS中。对于每种靶标，将源自随机化第一轮淘选选择输出的62微升的噬菌体和源自第一轮淘选选择输出的438微升的噬菌体合并，以得到合并噬菌体的500微升体积混合物。

然后将这些合并噬菌体混合物中的每一种用于如上所述对它们各自的生物素化抗原进行第二轮选择，但将生物素化抗原添加至噬菌体上清液至终浓度为10nM。从PD-L1和HER2第二轮淘选输出分别获得约3.6x10

将上述第二轮淘选选择输出大肠杆菌甘油原种的等分试样解冻并在100mL的2xYT培养基中稀释，得到OD

实施例5

通过ELISA的本发明支架的靶标结合克隆的鉴定

使用FastGene Plasmid Mini试剂盒(NIPPON Genetics,Japan)从来自上述第三轮选择输出的各甘油原种的等分试样中分离重组噬菌粒DNA池。在37℃下用各50单位的EcoRI-HF和AscI(New England Biolabs)消化噬菌粒DNA(5微克)2小时，如前所述对插入物DNA进行凝胶纯化。在16℃下，用400U的T4 DNA连接酶(New England Biolabs)、在20微升体积中将100ng等分试样的所得DNA插入物与100ng的包含相应EcoRI和AscI克隆位点的修饰的pQE-80L(QIAGEN)载体连接2小时。然后在65℃下加热连接混合物10分钟，根据制造商的说明用于转化化学感受态大肠杆菌XL1-Blue(Agilent)，并在37℃下在含有2％葡萄糖和50微克/mL卡那霉素的2xYT琼脂平板上铺板过夜。第二天，从每个转化输出物挑取95个单独的菌落，并在37℃下在含有每孔110微升的2xYT培养基的96孔板(“表达板”)中、在温和摇动下生长4小时，所述2xYT培养基含有0.1％葡萄糖和50微克/mL卡那霉素(各个“表达板”的板孔12H未接种细菌)。此后，将来自各孔的10微升转移至副本96孔板(“储存板”)中，所述96孔板含有每孔100微升的TB培养基，所述TB培养基含有1％葡萄糖和50微克/mL卡那霉素。将储存板在室温下振荡生长过夜。同时，将IPTG添加至表达板的各个孔至终浓度为0.5mM IPTG以诱导单个克隆的表达，并在室温下、在温和摇动下进行表达过夜。第二天，将100微升等分试样的含有1％葡萄糖、50微克/mL卡那霉素和30％甘油的TB培养基添加至储存板的各个孔中。然后用粘性铝箔片密封储存板并在-80℃下冷冻以用作单个克隆的甘油原种。此后，将40微升的含有2.5mg/ml人溶菌酶(Merck)、和20U/ml全能核酸酶(Merck)的裂解缓冲液(24.7g/l硼酸，18.7g/l NaCl，1.49g/l EDTA，pH8.0)添加至表达板的各个孔中，并在室温下振荡1小时。然后将40微升的PBS中12.5％(w/v)脱脂乳粉添加至表达板的各个孔中(终浓度为2.5％(w/v)脱脂乳)，并在室温下振荡板30分钟。如下通过ELISA筛选来自单独表达的克隆的包含本发明支架的该所得封闭的细胞裂解物与靶抗原的结合。将抗原溶解于PBS中至1微克/mL，并在4℃下将100微升包被至96孔MaxiSorp板(Nunc)的各个孔的表面上过夜。第二天，用PBST缓冲液(含有0.05％ Tween-20的PBS)洗涤MaxiSorp板的孔，并用每孔400微升的PBST中5％(w/v)脱脂乳粉封闭孔2小时。然后弃去该封闭缓冲液，并用PBST洗涤板的孔。然后将封闭的细胞裂解物转移至MaxiSorp板中，并使其在室温下、在温和摇动下与固定化封闭抗原结合2小时。此后，弃去裂解物，并用PBST洗涤MaxiSorp板的孔4次。然后，向各个孔添加100微升的含有2.5％(w/v)脱脂乳的PBST中抗FLAG M2 HRP缀合抗体(Sigma)的1/4000稀释溶液，并使其结合1小时。然后将其弃去，并用PBST洗涤板4次。然后每孔添加100微升的ELISAPOD底物TMB试剂盒(HYPER)检测试剂(Nacalai Tesque,Japan)，并通过添加100微升的1M磷酸来终止显色反应。在450nm波长读取各个孔的吸光度(图12A和12B)。鉴定产生阳性结合信号的克隆，并从取自上述甘油原种的各个孔的接种物生长。在37℃下、在2mL的含有1％葡萄糖和50微克/mL卡那霉素的TB培养基中振荡生长培养物过夜。使用FastGenePlasmid Mini试剂盒(NIPPON Genetics,Japan)从这些培养物中分离质粒，并通过Eurofins Genomics(Japan)对编码本发明支架的DNA区域进行测序。

实施例6

靶标结合支架的小规模蛋白质纯化和表征

将来自储存板(实施例5中所述)的序列验证的靶标结合克隆的大肠杆菌甘油原种用于在37℃下、在剧烈振荡下接种含有50微克/mL卡那霉素和0.1％葡萄糖的2xYT培养基的50mL培养物，直至OD

本发明支架的蛋白质的热稳定性通过DSF测定、用SYPRO橙色染料(Merck)、用PBS缓冲液(pH 7.4)中500微克/mL的蛋白、在0.5℃/min的扫描速率下确定(图16A-16E)。从荧光强度的一阶导数曲线的最大值处的温度确定蛋白质的熔解温度。

通过ELISA来估计本发明的各个支架的结合亲和力。将抗原溶解于PBS中至1微克/mL，并在4℃下将100微升包被至96孔MaxiSorp板(Nunc)的各个孔的表面上过夜。第二天，用PBST缓冲液(含有0.05％ Tween-20的PBS)洗涤MaxiSorp板的孔，并用每孔400微升的PBST中5％(w/v)脱脂乳粉封闭孔2小时。然后弃去该封闭缓冲液，并用PBST洗涤板的孔。将本发明的靶标结合支架的纯化蛋白在含有2.5％(w/v)脱脂乳的PBS中、以10.8μM至20pM范围内的各种浓度使用三倍稀释在96孔板中稀释。然后将稀释的靶标结合支架蛋白质转移至抗原包被的MaxiSorp板，并使其在室温下、在温和摇动下与固定化封闭抗原结合2小时。此后，弃去稀释的靶标结合支架蛋白质溶液，并用PBST洗涤MaxiSorp板的孔4次。然后，向各个孔添加100微升的含有2.5％(w/v)脱脂乳的PBST中抗FLAG M2 HRP缀合抗体(Sigma)的1/4000稀释溶液，并使其结合1小时。然后将其弃去，并用PBST洗涤板4次。然后每孔添加100微升的ELISAPOD底物TMB试剂盒(HYPER)检测试剂(Nacalai Tesque,Japan)，并通过添加100微升的1M磷酸来终止显色反应。在450nm波长读取各个孔的吸光度。从测定的吸光度值的四个参数逻辑图计算结合的EC

实施例7

与本发明支架具有序列同源性的蛋白的随机化潜力的评价

为了确定本发明的随机化方案是否广泛适用于与本发明支架具有序列同源性的蛋白，进行多肽序列同源性检索以鉴定同源候选物。CheB

使用从序列比对获得的信息，设计与用于测试本发明支架的随机化设计的测试环移植物类似的测试环移植物，并将其与SEQ ID NO:48中Cys159Ser取代一起并入闪烁杆菌属菌种蛋白质中，以产生无半胱氨酸的测试环移植物构建体(SEQ ID NO:49)(图19和20)。侧翼为EcoRI和AscI位点的测试环移植的闪烁杆菌属菌种蛋白构建体(SEQ ID NO:50)的多肽序列由从Eurofins Genomics(Japan)获得的合成DNA(SEQ ID NO:51)编码，克隆至包含相应的EcoRI和AscI克隆位点的修饰的pQE-80L载体(QIAGEN)中，并转化至大肠杆菌XL1-Blue(Agilent)中。使用序列验证的克隆的甘油原种接种含有50微克/mL卡那霉素和0.1％葡萄糖的2xYT培养基的50mL培养物，并在37℃下、在剧烈振荡下生长直至OD

尽管出于清楚和理解的目的已经相当详细地描述了前述发明，本领域技术人员通过阅读本公开内容将清楚，在不脱离本发明的真实范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。

引用的参考文献

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序列表

<110> 菲利普·罗德利

<120> 蛋白质支架

<130> 01-00001

<140> US 16/911, 398

<141> 2020-06-25

<160> 87

<210> 1

<211> 193

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 1

Gly Ser His Met Val Ser Gly Lys Ile Val Val Ile Gly Ser Ser Thr

1 5 1015

Gly Gly Pro Arg Ser Leu Asp Met Ile Ile Pro Asn Leu Pro Lys Asn

202530

Phe Pro Ala Pro Ile Val Val Val Gln His Met Pro Pro Gly Phe Thr

354045

Lys Ser Leu Ala Gln Arg Leu Asp Ser Thr Ser Glu Leu Thr Val Lys

505560

Glu Ala Glu Asp Gly Glu Glu Val Lys Pro Gly Phe Val Tyr Ile Ala

65707580

Pro Gly Asp Phe His Leu Gly Leu Lys Ala Gln Asn Gly Lys Val Phe

859095

Phe Phe Leu Asp Lys Ser Asp Lys Ile Asn Asn Val Arg Pro Ala Val

100 105 110

Asp Phe Thr Leu Asp Lys Ala Ala Glu Ile Tyr Lys Glu Lys Thr Ile

115 120 125

Ala Val Ile Leu Thr Gly Met Gly Lys Asp Gly Thr Lys Gly Ala Phe

130 135 140

Lys Val Lys Phe Tyr Gly Gly Thr Val Ile Ala Glu Asp Lys Glu Thr

145 150 155 160

Ser Val Val Phe Gly Met Pro Lys Ser Val Ile Glu Glu Gly Tyr Ala

165 170 175

Asp Tyr Val Leu Pro Ala Tyr Lys Ile Pro Glu Lys Leu Ile Glu Leu

180 185 190

Val

<210> 2

<211> 212

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MOD_RES

<222> (44)..(47)

<223> 选自以下的组的氨基酸: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu, Thr, Asn, Trp, Gly,Glu, Val和Tyr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (49)..(52)

<223> 选自以下的组的氨基酸: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu, Thr, Asn, Trp, Gly,Glu, Val和Tyr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (110)..(113)

<223> 选自以下的组的氨基酸: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu, Thr, Asn, Trp, Gly,Glu, Val和Tyr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (115)..(118)

<223> 选自以下的组的氨基酸: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu, Thr, Asn, Trp, Gly,Glu, Val和Tyr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (148)..(150)

<223> 选自以下的组的氨基酸: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu, Thr, Asn, Trp, Gly,Glu, Val和Tyr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (152)..(154)

<223> 选自以下的组的氨基酸: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu, Thr, Asn, Trp, Gly,Glu, Val和Tyr

<400> 2

Gly Ser His Met Val Ser Gly Lys Ile Val Val Ile Gly Ser Ser Thr

1 5 1015

Gly Gly Pro Arg Ser Leu Asp Met Ile Ile Pro Asn Leu Pro Lys Asn

202530

Phe Pro Ala Pro Ile Val Val Val Gln His Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Gly

354045

Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Thr Lys Ser Leu Ala Gln Arg Leu Asp Ser Thr

505560

Ser Glu Leu Thr Val Lys Glu Ala Glu Asp Gly Glu Glu Val Lys Pro

65707580

Gly Phe Val Tyr Ile Ala Pro Gly Asp Phe His Leu Gly Leu Lys Ala

859095

Gln Asn Gly Lys Val Phe Phe Phe Leu Asp Lys Ser Gly Xaa Xaa Xaa

100 105 110

Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Arg Pro Ala Val Asp Phe Thr Leu

115 120 125

Asp Lys Ala Ala Glu Ile Tyr Lys Glu Lys Thr Ile Ala Val Ile Leu

130 135 140

Thr Gly Gly Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Gly Gly Asp Gly Thr Lys

145 150 155 160

Gly Ala Phe Lys Val Lys Phe Tyr Gly Gly Thr Val Ile Ala Glu Asp

165 170 175

Lys Glu Thr Ser Val Val Phe Gly Met Pro Lys Ser Val Ile Glu Glu

180 185 190

Gly Tyr Ala Asp Tyr Val Leu Pro Ala Tyr Lys Ile Pro Glu Lys Leu

195 200 205

Ile Glu Leu Val

210

<210> 3

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MOD_RES

<222> (45)..(47)

<223> 可变氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (49)..(52)

<223> 可变氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (112)..(115)

<223> 可变氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (117)..(119)

<223> 可变氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (150)..(152)

<223> 选自以下的组的氨基酸: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu, Thr, Asn, Trp, Gly,Glu, Val和Tyr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (154)..(156)

<223> 选自以下的组的氨基酸: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu, Thr, Asn, Trp, Gly,Glu, Val和Tyr

<400> 3

Gly Ser His Met Val Ser Gly Lys Ile Val Val Ile Gly Ser Ser Thr

1 5 1015

Gly Gly Pro Arg Ser Leu Asp Met Ile Ile Pro Asn Leu Pro Lys Asn

202530

Phe Pro Ala Pro Ile Val Val Val Gln His Gly Gly Xaa Xaa Xaa Gly

354045

Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Gly Thr Lys Ser Leu Ala Gln Arg Leu Asp Ser

505560

Thr Ser Glu Leu Thr Val Lys Glu Ala Glu Asp Gly Glu Glu Val Lys

65707580

Pro Gly Phe Val Tyr Ile Ala Pro Gly Asp Phe His Leu Gly Leu Lys

859095

Ala Gln Asn Gly Lys Val Phe Phe Phe Leu Asp Lys Ser Gly Gly Xaa

100 105 110

Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Gly Gly Val Arg Pro Ala Val Asp Phe

115 120 125

Thr Leu Asp Lys Ala Ala Glu Ile Tyr Lys Glu Lys Thr Ile Ala Val

130 135 140

Ile Leu Thr Gly Gly Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Gly Gly Asp Gly

145 150 155 160

Thr Lys Gly Ala Phe Lys Val Lys Phe Tyr Gly Gly Thr Val Ile Ala

165 170 175

Glu Asp Lys Glu Thr Ser Val Val Phe Gly Met Pro Lys Ser Val Ile

180 185 190

Glu Glu Gly Tyr Ala Asp Tyr Val Leu Pro Ala Tyr Lys Ile Pro Glu

195 200 205

Lys Leu Ile Glu Leu Val

210

<210> 4

<211> 199

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 4

Gly Asn Ser Gly Ser His Met Val Ser Gly Lys Ile Val Val Ile Gly

1 5 1015

Ser Ser Thr Gly Gly Pro Arg Ser Leu Asp Met Ile Ile Pro Asn Leu

202530

Pro Lys Asn Phe Pro Ala Pro Ile Val Val Val Gln His Met Pro Pro

354045

Gly Phe Thr Lys Ser Leu Ala Gln Arg Leu Asp Ser Thr Ser Glu Leu

505560

Thr Val Lys Glu Ala Glu Asp Gly Glu Glu Val Lys Pro Gly Phe Val

65707580

Tyr Ile Ala Pro Gly Asp Phe His Leu Gly Leu Lys Ala Gln Asn Gly

859095

Lys Val Phe Phe Phe Leu Asp Lys Ser Asp Lys Ile Asn Asn Val Arg

100 105 110

Pro Ala Val Asp Phe Thr Leu Asp Lys Ala Ala Glu Ile Tyr Lys Glu

115 120 125

Lys Thr Ile Ala Val Ile Leu Thr Gly Met Gly Lys Asp Gly Thr Lys

130 135 140

Gly Ala Phe Lys Val Lys Phe Tyr Gly Gly Thr Val Ile Ala Glu Asp

145 150 155 160

Lys Glu Thr Ser Val Val Phe Gly Met Pro Lys Ser Val Ile Glu Glu

165 170 175

Gly Tyr Ala Asp Tyr Val Leu Pro Ala Tyr Lys Ile Pro Glu Lys Leu

180 185 190

Ile Glu Leu Val Gly Ala Pro

195

<210> 5

<211> 636

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> modified_base

<222> (130)..(132)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (133)..(135)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (136)..(138)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (139)..(141)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (145)..(147)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (148)..(150)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (151)..(153)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (154)..(156)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (328)..(330)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (331)..(333)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (334)..(336)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (337)..(339)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (343)..(345)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (346)..(348)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (349)..(351)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (352)..(354)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (442)..(444)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (445)..(447)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (448)..(450)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (454)..(456)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (457)..(459)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (460)..(462)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<400> 5

ggttctcaca tggtttctgg taaaatcgtt gttatcggtt cttctaccgg tggtccgcgt 60

tctctggaca tgatcatccc gaacctgccg aaaaacttcc cggctccgat cgttgttgtt 120

cagcacggan nnnnnnnnnn nggtnnnnnn nnnnnnggga ccaaatctct ggctcagcgt 180

ctggactcta cctctgaact gaccgttaaa gaagctgaag acggtgaaga agttaaaccg 240

ggtttcgttt acatcgctcc gggtgacttc cacctgggtc tgaaagctca gaacggtaaa 300

gttttcttct tcctggacaa atctggtnnn nnnnnnnnng gtnnnnnnnn nnnnggggtt 360

cgtccggctg ttgacttcac cctggacaaa gctgctgaaa tctacaaaga aaaaaccatc 420

gctgttatcc tgaccggtgg annnnnnnnn ggtnnnnnnn nnggtggtga cggtactaag 480

ggcgcgttca aagttaaatt ttacggtggt actgttatcg ctgaagacaa agaaacctct 540

gttgttttcg gtatgccgaa atctgttatc gaagaaggtt acgctgacta cgttctgccg 600

gcttacaaaa tcccggaaaa actgatcgaa ctggtt 636

<210> 6

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> modified_base

<222> (133)..(134)

<223> a, c, g或t

<220>

<221> modified_base

<222> (136)..(137)

<223> a, c, g或t

<220>

<221> modified_base

<222> (139)..(140)

<223> a, c, g或t

<220>

<221> modified_base

<222> (145)..(146)

<223> a, c, g或t

<220>

<221> modified_base

<222> (148)..(149)

<223> a, c, g或t

<220>

<221> modified_base

<222> (151)..(152)

<223> a, c, g或t

<220>

<221> modified_base

<222> (154)..(155)

<223> a, c, g或t

<220>

<221> modified_base

<222> (334)..(335)

<223> a, c, g或t

<220>

<221> modified_base

<222> (337)..(338)

<223> a, c, g或t

<220>

<221> modified_base

<222> (340)..(341)

<223> a, c, g或t

<220>

<221> modified_base

<222> (343)..(344)

<223> a, c, g或t

<220>

<221> modified_base

<222> (349)..(350)

<223> a, c, g或t

<220>

<221> modified_base

<222> (352)..(353)

<223> a, c, g或t

<220>

<221> modified_base

<222> (355)..(356)

<223> a, c, g或t

<220>

<221> modified_base

<222> (448)..(450)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (451)..(453)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (454)..(456)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (460)..(462)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (463)..(465)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (466)..(468)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<400> 6

ggttctcaca tggtttctgg taaaatcgtt gttatcggtt cttctaccgg tggtccgcgt 60

tctctggaca tgatcatccc gaacctgccg aaaaacttcc cggctccgat cgttgttgtt 120

cagcacggag gannknnknn kggtnnknnk nnknnkggcg ggaccaaatc tctggctcag 180

cgtctggact ctacctctga actgaccgtt aaagaagctg aagacggtga agaagttaaa 240

ccgggtttcg tttacatcgc tccgggtgac ttccacctgg gtctgaaagc tcagaacggt 300

aaagttttct tcttcctgga caaatctggt ggtnnknnkn nknnkggtnn knnknnkgga 360

ggggttcgtc cggctgttga cttcaccctg gacaaagctg ctgaaatcta caaagaaaaa 420

accatcgctg ttatcctgac cggtggannn nnnnnnggtn nnnnnnnngg tggtgacggt 480

actaagggcg cgttcaaagt taaattttac ggtggtactg ttatcgctga agacaaagaa 540

acctctgttg ttttcggtat gccgaaatct gttatcgaag aaggttacgc tgactacgtt 600

ctgccggctt acaaaatccc ggaaaaactg atcgaactgg tt 642

<210> 7

<211> 597

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 7

gggaattctg gttctcacat ggtttctggt aaaatcgttg ttatcggttc ttctaccggt 60

ggtccgcgtt ctctggacat gatcatcccg aacctgccga aaaacttccc ggctccgatc 120

gttgttgttc agcacatgcc gccgggtttc accaaatctc tggctcagcg tctggactct 180

acctctgaac tgaccgttaa agaagctgaa gacggtgaag aagttaaacc gggtttcgtt 240

tacatcgctc cgggtgactt ccacctgggt ctgaaagctc agaacggtaa agttttcttc 300

ttcctggaca aatctgacaa aatcaacaac gttcgtccgg ctgttgactt caccctggac 360

aaagctgctg aaatctacaa agaaaaaacc atcgctgtta tcctgaccgg tatgggtaaa 420

gacggtacta agggcgcgtt caaagttaaa ttttacggtg gtactgttat cgctgaagac 480

aaagaaacct ctgttgtttt cggtatgccg aaatctgtta tcgaagaagg ttacgctgac 540

tacgttctgc cggcttacaa aatcccggaa aaactgatcg aactggttgg cgcgcca 597

<210> 8

<211> 206

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 8

Gly Ser His Met Val Ser Gly Lys Ile Val Val Ile Gly Ser Ser Thr

1 5 1015

Gly Gly Pro Arg Ser Leu Asp Met Ile Ile Pro Asn Leu Pro Lys Asn

202530

Phe Pro Ala Pro Ile Val Val Val Gln His Met Pro Pro Gly Phe Thr

354045

Lys Ser Leu Ala Gln Arg Leu Asp Ser Thr Ser Glu Leu Thr Val Lys

505560

Glu Ala Glu Asp Gly Glu Glu Val Lys Pro Gly Phe Val Tyr Ile Ala

65707580

Pro Gly Asp Phe His Leu Gly Leu Lys Ala Gln Asn Gly Lys Val Phe

859095

Phe Phe Leu Asp Lys Ser Gly Gly Asp Arg Asn Gly Tyr Ser Ala Gly

100 105 110

Gly Val Arg Pro Ala Val Asp Phe Thr Leu Asp Lys Ala Ala Glu Ile

115 120 125

Tyr Lys Glu Lys Thr Ile Ala Val Ile Leu Thr Gly Gly Leu Val Asp

130 135 140

Gly Arg Glu Ala Gly Gly Asp Gly Thr Lys Gly Ala Phe Lys Val Lys

145 150 155 160

Phe Tyr Gly Gly Thr Val Ile Ala Glu Asp Lys Glu Thr Ser Val Val

165 170 175

Phe Gly Met Pro Lys Ser Val Ile Glu Glu Gly Tyr Ala Asp Tyr Val

180 185 190

Leu Pro Ala Tyr Lys Ile Pro Glu Lys Leu Ile Glu Leu Val

195 200 205

<210> 9

<211> 205

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 9

Gly Ser His Met Val Ser Gly Lys Ile Val Val Ile Gly Ser Ser Thr

1 5 1015

Gly Gly Pro Arg Ser Leu Asp Met Ile Ile Pro Asn Leu Pro Lys Asn

202530

Phe Pro Ala Pro Ile Val Val Val Gln His Gly Gly Leu Asp Asn Gly

354045

Ser Tyr Thr Gly Gly Thr Lys Ser Leu Ala Gln Arg Leu Asp Ser Thr

505560

Ser Glu Leu Thr Val Lys Glu Ala Glu Asp Gly Glu Glu Val Lys Pro

65707580

Gly Phe Val Tyr Ile Ala Pro Gly Asp Phe His Leu Gly Leu Lys Ala

859095

Gln Asn Gly Lys Val Phe Phe Phe Leu Asp Lys Ser Gly Gly Asp Arg

100 105 110

Asn Gly Tyr Ser Ala Gly Gly Val Arg Pro Ala Val Asp Phe Thr Leu

115 120 125

Asp Lys Ala Ala Glu Ile Tyr Lys Glu Lys Thr Ile Ala Val Ile Leu

130 135 140

Thr Gly Met Gly Lys Asp Gly Thr Lys Gly Ala Phe Lys Val Lys Phe

145 150 155 160

Tyr Gly Gly Thr Val Ile Ala Glu Asp Lys Glu Thr Ser Val Val Phe

165 170 175

Gly Met Pro Lys Ser Val Ile Glu Glu Gly Tyr Ala Asp Tyr Val Leu

180 185 190

Pro Ala Tyr Lys Ile Pro Glu Lys Leu Ile Glu Leu Val

195 200 205

<210> 10

<211> 206

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 10

Gly Ser His Met Val Ser Gly Lys Ile Val Val Ile Gly Ser Ser Thr

1 5 1015

Gly Gly Pro Arg Ser Leu Asp Met Ile Ile Pro Asn Leu Pro Lys Asn

202530

Phe Pro Ala Pro Ile Val Val Val Gln His Gly Gly Leu Asp Asn Gly

354045

Ser Tyr Thr Gly Gly Thr Lys Ser Leu Ala Gln Arg Leu Asp Ser Thr

505560

Ser Glu Leu Thr Val Lys Glu Ala Glu Asp Gly Glu Glu Val Lys Pro

65707580

Gly Phe Val Tyr Ile Ala Pro Gly Asp Phe His Leu Gly Leu Lys Ala

859095

Gln Asn Gly Lys Val Phe Phe Phe Leu Asp Lys Ser Asp Lys Ile Asn

100 105 110

Asn Val Arg Pro Ala Val Asp Phe Thr Leu Asp Lys Ala Ala Glu Ile

115 120 125

Tyr Lys Glu Lys Thr Ile Ala Val Ile Leu Thr Gly Gly Leu Val Asp

130 135 140

Gly Arg Glu Ala Gly Gly Asp Gly Thr Lys Gly Ala Phe Lys Val Lys

145 150 155 160

Phe Tyr Gly Gly Thr Val Ile Ala Glu Asp Lys Glu Thr Ser Val Val

165 170 175

Phe Gly Met Pro Lys Ser Val Ile Glu Glu Gly Tyr Ala Asp Tyr Val

180 185 190

Leu Pro Ala Tyr Lys Ile Pro Glu Lys Leu Ile Glu Leu Val

195 200 205

<210> 11

<211> 212

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 11

Gly Ser His Met Val Ser Gly Lys Ile Val Val Ile Gly Ser Ser Thr

1 5 1015

Gly Gly Pro Arg Ser Leu Asp Met Ile Ile Pro Asn Leu Pro Lys Asn

202530

Phe Pro Ala Pro Ile Val Val Val Gln His Gly Gly Leu Asp Asn Gly

354045

Ser Tyr Thr Gly Gly Thr Lys Ser Leu Ala Gln Arg Leu Asp Ser Thr

505560

Ser Glu Leu Thr Val Lys Glu Ala Glu Asp Gly Glu Glu Val Lys Pro

65707580

Gly Phe Val Tyr Ile Ala Pro Gly Asp Phe His Leu Gly Leu Lys Ala

859095

Gln Asn Gly Lys Val Phe Phe Phe Leu Asp Lys Ser Gly Gly Asp Arg

100 105 110

Asn Gly Tyr Ser Ala Gly Gly Val Arg Pro Ala Val Asp Phe Thr Leu

115 120 125

Asp Lys Ala Ala Glu Ile Tyr Lys Glu Lys Thr Ile Ala Val Ile Leu

130 135 140

Thr Gly Gly Leu Val Asp Gly Arg Glu Ala Gly Gly Asp Gly Thr Lys

145 150 155 160

Gly Ala Phe Lys Val Lys Phe Tyr Gly Gly Thr Val Ile Ala Glu Asp

165 170 175

Lys Glu Thr Ser Val Val Phe Gly Met Pro Lys Ser Val Ile Glu Glu

180 185 190

Gly Tyr Ala Asp Tyr Val Leu Pro Ala Tyr Lys Ile Pro Glu Lys Leu

195 200 205

Ile Glu Leu Val

210

<210> 12

<211> 618

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 12

ggttctcaca tggtttctgg taaaatcgtt gttatcggtt cttctaccgg tggtccgcgt 60

tctctggaca tgatcatccc gaacctgccg aaaaacttcc cggctccgat cgttgttgtt 120

cagcacatgc cgccgggttt caccaaatct ctggctcagc gtctggactc tacctctgaa 180

ctgaccgtta aagaagctga agacggtgaa gaagttaaac cgggtttcgt ttacatcgct 240

ccgggtgact tccacctggg tctgaaagct cagaacggta aagttttctt cttcctggac 300

aaatctggtg gcgaccgtaa cggttactct gctggagggg ttcgtccggc tgttgacttc 360

accctggaca aagctgctga aatctacaaa gaaaaaacca tcgctgttat cctgaccggt 420

ggactggttg acggtcgtga agctggtggt gacggtacta agggcgcgtt caaagttaaa 480

ttttacggtg gtactgttat cgctgaagac aaagaaacct ctgttgtttt cggtatgccg 540

aaatctgtta tcgaagaagg ttacgctgac tacgttctgc cggcttacaa aatcccggaa 600

aaactgatcg aactggtt 618

<210> 13

<211> 615

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 13

ggttctcaca tggtttctgg taaaatcgtt gttatcggtt cttctaccgg tggtccgcgt 60

tctctggaca tgatcatccc gaacctgccg aaaaacttcc cggctccgat cgttgttgtt 120

cagcacggag gtctggacaa cggttcttac accggcggga ccaaatctct ggctcagcgt 180

ctggactcta cctctgaact gaccgttaaa gaagctgaag acggtgaaga agttaaaccg 240

ggtttcgttt acatcgctcc gggtgacttc cacctgggtc tgaaagctca gaacggtaaa 300

gttttcttct tcctggacaa atctggtggc gaccgtaacg gttactctgc tggaggggtt 360

cgtccggctg ttgacttcac cctggacaaa gctgctgaaa tctacaaaga aaaaaccatc 420

gctgttatcc tgaccggtat gggtaaagac ggtactaagg gcgcgttcaa agttaaattt 480

tacggtggta ctgttatcgc tgaagacaaa gaaacctctg ttgttttcgg tatgccgaaa 540

tctgttatcg aagaaggtta cgctgactac gttctgccgg cttacaaaat cccggaaaaa 600

ctgatcgaac tggtt 615

<210> 14

<211> 618

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 14

ggttctcaca tggtttctgg taaaatcgtt gttatcggtt cttctaccgg tggtccgcgt 60

tctctggaca tgatcatccc gaacctgccg aaaaacttcc cggctccgat cgttgttgtt 120

cagcacggag gtctggacaa cggttcttac accggcggga ccaaatctct ggctcagcgt 180

ctggactcta cctctgaact gaccgttaaa gaagctgaag acggtgaaga agttaaaccg 240

ggtttcgttt acatcgctcc gggtgacttc cacctgggtc tgaaagctca gaacggtaaa 300

gttttcttct tcctggacaa atctgacaaa atcaacaacg ttcgtccggc tgttgacttc 360

accctggaca aagctgctga aatctacaaa gaaaaaacca tcgctgttat cctgaccggt 420

ggactggttg acggtcgtga agctggtggt gacggtacta agggcgcgtt caaagttaaa 480

ttttacggtg gtactgttat cgctgaagac aaagaaacct ctgttgtttt cggtatgccg 540

aaatctgtta tcgaagaagg ttacgctgac tacgttctgc cggcttacaa aatcccggaa 600

aaactgatcg aactggtt 618

<210> 15

<211> 636

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 15

ggttctcaca tggtttctgg taaaatcgtt gttatcggtt cttctaccgg tggtccgcgt 60

tctctggaca tgatcatccc gaacctgccg aaaaacttcc cggctccgat cgttgttgtt 120

cagcacggag gtctggacaa cggttcttac accggcggga ccaaatctct ggctcagcgt 180

ctggactcta cctctgaact gaccgttaaa gaagctgaag acggtgaaga agttaaaccg 240

ggtttcgttt acatcgctcc gggtgacttc cacctgggtc tgaaagctca gaacggtaaa 300

gttttcttct tcctggacaa atctggtggc gaccgtaacg gttactctgc tgggggggtt 360

cgtccggctg ttgacttcac cctggacaaa gctgctgaaa tctacaaaga aaaaaccatc 420

gctgttatcc tgaccggtgg actggttgac ggtcgtgaag ctggtggtga cggtactaag 480

ggcgcgttca aagttaaatt ttacggtggt actgttatcg ctgaagacaa agaaacctct 540

gttgttttcg gtatgccgaa atctgttatc gaagaaggtt acgctgacta cgttctgccg 600

gcttacaaaa tcccggaaaa actgatcgaa ctggtt 636

<210> 16

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> modified_base

<222> (29)..(31)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (32)..(34)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (35)..(37)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (38)..(40)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (44)..(46)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (47)..(49)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (50)..(52)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (53)..(55)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<400> 16

ggctccgatc gttgttgttc agcacggann nnnnnnnnnn ggtnnnnnnn nnnnngggac 60

caaatctctg gctcagcgtc tgg 83

<210> 17

<211> 95

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> modified_base

<222> (40)..(42)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (43)..(45)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (46)..(48)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (49)..(51)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (55)..(57)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (58)..(60)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (61)..(63)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (64)..(66)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<400> 17

cagaacggta aagttttctt cttcctggac aaatctggtn nnnnnnnnnn nggtnnnnnn 60

nnnnnngggg ttcgtccggc tgttgacttc accct 95

<210> 18

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> modified_base

<222> (29)..(31)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (32)..(34)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (35)..(37)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (41)..(43)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (44)..(46)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<220>

<221> modified_base

<222> (47)..(49)

<223> 表示编码选自以下的组的氨基酸残基的密码子: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu,Thr, Asn, Trp, Gly, Glu, Val和Tyr

<400> 18

aaccatcgct gttatcctga ccggtggann nnnnnnnggt nnnnnnnnng gtggtgacgg 60

tactaagggc gcgttcaaa 79

<210> 19

<211> 86

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> modified_base

<222> (32)..(33)

<223> a, c, g或t

<220>

<221> modified_base

<222> (35)..(36)

<223> a, c, g或t

<220>

<221> modified_base

<222> (38)..(39)

<223> a, c, g或t

<220>

<221> modified_base

<222> (44)..(45)

<223> a, c, g或t

<220>

<221> modified_base

<222> (47)..(48)

<223> a, c, g或t

<220>

<221> modified_base

<222> (50)..(51)

<223> a, c, g或t

<220>

<221> modified_base

<222> (53)..(54)

<223> a, c, g或t

<400> 19

ggctccgatc gttgttgttc agcacggagg annknnknnk ggtnnknnkn nknnkggcgg 60

gaccaaatct ctggctcagc gtctgg 86

<210> 20

<211> 98

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> modified_base

<222> (43)..(44)

<223> a, c, g或t

<220>

<221> modified_base

<222> (46)..(47)

<223> a, c, g或t

<220>

<221> modified_base

<222> (49)..(50)

<223> a, c, g或t

<220>

<221> modified_base

<222> (52)..(53)

<223> a, c, g或t

<220>

<221> modified_base

<222> (58)..(59)

<223> a, c, g或t

<220>

<221> modified_base

<222> (61)..(62)

<223> a, c, g或t

<220>

<221> modified_base

<222> (64)..(65)

<223> a, c, g或t

<400> 20

cagaacggta aagttttctt cttcctggac aaatctggtg gtnnknnknn knnkggtnnk 60

nnknnkggag gggttcgtcc ggctgttgac ttcaccct 98

<210> 21

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 21

atagggaatt ctggttctca catggtttct ggtaaaatcg ttg 43

<210> 22

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 22

ggttctcaca tggtttctgg taaaatcgtt g 31

<210> 23

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 23

tccgtgctga acaacaacga tcggagcc 28

<210> 24

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 24

gggaccaaat ctctggctca gcgtctgg 28

<210> 25

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 25

accagatttg tccaggaaga agaaaacttt accgttctg 39

<210> 26

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 26

ggggttcgtc cggctgttga cttcaccct 29

<210> 27

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 27

tccaccggtc aggataacag cgatggtt 28

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 28

ggtggtgacg gtactaaggg cgcgttcaaa 30

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 29

aaccagttcg atcagttttt ccgg 24

<210> 30

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 30

atcatggcgc gccaaccagt tcgatcagtt tttccgg 37

<210> 31

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 31

ggctccgatc gttgttgttc agcacgga 28

<210> 32

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 32

ccagacgctg agccagagat ttggtccc 28

<210> 33

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 33

cagaacggta aagttttctt cttcctggac aaatctggt 39

<210> 34

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 34

agggtgaagt caacagccgg acgaacccc 29

<210> 35

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 35

aaccatcgct gttatcctga ccggtgga 28

<210> 36

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 36

tttgaacgcg cccttagtac cgtcaccacc 30

<210> 37

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 37

ggctccgatc gttgttgttc agcacggagg tctggacaac ggttcttaca ccggcgggac 60

caaatctctg gctcagcgtc tgg 83

<210> 38

<211> 95

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 38

cagaacggta aagttttctt cttcctggac aaatctggtg gcgaccgtaa cggttactct 60

gctggagggg ttcgtccggc tgttgacttc accct 95

<210> 39

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 39

aaccatcgct gttatcctga ccggtggact ggttgacggt cgtgaagctg gtggtgacgg 60

tactaagggc gcgttcaaa 79

<210> 40

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 40

Gly Ser His Met Val Ser Gly Lys Ile Val Val Ile Gly Ser Ser Thr

1 5 1015

Gly Gly Pro Arg Ser Leu Asp Met Ile Ile Pro Asn Leu Pro Lys Asn

202530

Phe Pro Ala Pro Ile Val Val Val Gln His

3540

<210> 41

<211> 55

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 41

Thr Lys Ser Leu Ala Gln Arg Leu Asp Ser Thr Ser Glu Leu Thr Val

1 5 1015

Lys Glu Ala Glu Asp Gly Glu Glu Val Lys Pro Gly Phe Val Tyr Ile

202530

Ala Pro Gly Asp Phe His Leu Gly Leu Lys Ala Gln Asn Gly Lys Val

354045

Phe Phe Phe Leu Asp Lys Ser

5055

<210> 42

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 42

Val Arg Pro Ala Val Asp Phe Thr Leu Asp Lys Ala Ala Glu Ile Tyr

1 5 1015

Lys Glu Lys Thr Ile Ala Val Ile Leu Thr Gly

2025

<210> 43

<211> 56

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 43

Asp Gly Thr Lys Gly Ala Phe Lys Val Lys Phe Tyr Gly Gly Thr Val

1 5 1015

Ile Ala Glu Asp Lys Glu Thr Ser Val Val Phe Gly Met Pro Lys Ser

202530

Val Ile Glu Glu Gly Tyr Ala Asp Tyr Val Leu Pro Ala Tyr Lys Ile

354045

Pro Glu Lys Leu Ile Glu Leu Val

5055

<210> 44

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(5)

<223> 选自以下的组的氨基酸: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu, Thr, Asn, Trp, Gly,Glu, Val和Tyr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(10)

<223> 选自以下的组的氨基酸: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu, Thr, Asn, Trp, Gly,Glu, Val和Tyr

<400> 44

Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Gly

1 5 10

<210> 45

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(5)

<223> 可变氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(10)

<223> 可变氨基酸

<400> 45

Gly Gly Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Gly

1 5 10

<210> 46

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(6)

<223> 可变氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(10)

<223> 可变氨基酸

<400> 46

Gly Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Gly Gly

1 5 10

<210> 47

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(4)

<223> 选自以下的组的氨基酸: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu, Thr, Asn, Trp, Gly,Glu, Val和Tyr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(8)

<223> 选自以下的组的氨基酸: Ser, Asp, Arg, Ala, Leu, Thr, Asn, Trp, Gly,Glu, Val和Tyr

<400> 47

Gly Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Gly Gly

1 5 10

<210> 48

<211> 191

<212> PRT

<213> 多节闪烁杆菌(Fervidobacterium pennivorans)

<400> 48

Ile Val Ser Gly Lys Val Val Val Ile Gly Ser Ser Thr Gly Gly Pro

1 5 1015

Arg Ser Leu Asp Leu Val Ile Pro Pro Leu Pro Lys Asp Phe Pro Ala

202530

Pro Ile Leu Leu Val Gln His Met Pro Pro Gly Phe Thr Lys Ser Leu

354045

Ala Gln Arg Leu Asp Arg Ile Ser Asn Leu Ser Val Lys Glu Ala Glu

505560

Glu Gly Asp Val Leu Lys Pro Gly Trp Val Tyr Val Ala Pro Gly Asp

65707580

Tyr His Met Gly Ile Lys Tyr Gln Asp Lys Lys Gly Ile Ile Tyr Leu

859095

Asp Lys Asn Thr Glu Lys Ile Asn Asn Val Arg Pro Ala Val Asp Tyr

100 105 110

Thr Leu Asp Lys Val Ala Glu Ile Tyr Lys Glu Asn Thr Ile Ala Val

115 120 125

Ile Leu Thr Gly Met Gly Lys Asp Gly Thr Lys Gly Ala Phe Lys Val

130 135 140

Lys Phe Phe Lys Gly Val Val Ile Ala Glu Ser Gln Glu Thr Cys Val

145 150 155 160

Val Phe Gly Met Pro Lys Ser Val Ile Glu Glu Gly Tyr Ala Asp Tyr

165 170 175

Val Leu Pro Ala Asp Lys Ile Pro Glu Lys Leu Val Glu Leu Val

180 185 190

<210> 49

<211> 209

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 49

Ile Val Ser Gly Lys Val Val Val Ile Gly Ser Ser Thr Gly Gly Pro

1 5 1015

Arg Ser Leu Asp Leu Val Ile Pro Pro Leu Pro Lys Asp Phe Pro Ala

202530

Pro Ile Leu Leu Val Gln His Gly Gly Leu Asp Asn Gly Ser Tyr Thr

354045

Gly Gly Thr Lys Ser Leu Ala Gln Arg Leu Asp Arg Ile Ser Asn Leu

505560

Ser Val Lys Glu Ala Glu Glu Gly Asp Val Leu Lys Pro Gly Trp Val

65707580

Tyr Val Ala Pro Gly Asp Tyr His Met Gly Ile Lys Tyr Gln Asp Lys

859095

Lys Gly Ile Ile Tyr Leu Asp Lys Ser Gly Gly Asp Arg Asn Gly Tyr

100 105 110

Ser Ala Gly Gly Val Arg Pro Ala Val Asp Tyr Thr Leu Asp Lys Val

115 120 125

Ala Glu Ile Tyr Lys Glu Asn Thr Ile Ala Val Ile Leu Thr Gly Gly

130 135 140

Leu Val Asp Gly Arg Glu Ala Gly Gly Asp Gly Thr Lys Gly Ala Phe

145 150 155 160

Lys Val Lys Phe Phe Lys Gly Val Val Ile Ala Glu Ser Gln Glu Thr

165 170 175

Ser Val Val Phe Gly Met Pro Lys Ser Val Ile Glu Glu Gly Tyr Ala

180 185 190

Asp Tyr Val Leu Pro Ala Asp Lys Ile Pro Glu Lys Leu Val Glu Leu

195 200 205

Val

<210> 50

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 50

Gly Asn Ser Gly Ser Ile Val Ser Gly Lys Val Val Val Ile Gly Ser

1 5 1015

Ser Thr Gly Gly Pro Arg Ser Leu Asp Leu Val Ile Pro Pro Leu Pro

202530

Lys Asp Phe Pro Ala Pro Ile Leu Leu Val Gln His Gly Gly Leu Asp

354045

Asn Gly Ser Tyr Thr Gly Gly Thr Lys Ser Leu Ala Gln Arg Leu Asp

505560

Arg Ile Ser Asn Leu Ser Val Lys Glu Ala Glu Glu Gly Asp Val Leu

65707580

Lys Pro Gly Trp Val Tyr Val Ala Pro Gly Asp Tyr His Met Gly Ile

859095

Lys Tyr Gln Asp Lys Lys Gly Ile Ile Tyr Leu Asp Lys Ser Gly Gly

100 105 110

Asp Arg Asn Gly Tyr Ser Ala Gly Gly Val Arg Pro Ala Val Asp Tyr

115 120 125

Thr Leu Asp Lys Val Ala Glu Ile Tyr Lys Glu Asn Thr Ile Ala Val

130 135 140

Ile Leu Thr Gly Gly Leu Val Asp Gly Arg Glu Ala Gly Gly Asp Gly

145 150 155 160

Thr Lys Gly Ala Phe Lys Val Lys Phe Phe Lys Gly Val Val Ile Ala

165 170 175

Glu Ser Gln Glu Thr Ser Val Val Phe Gly Met Pro Lys Ser Val Ile

180 185 190

Glu Glu Gly Tyr Ala Asp Tyr Val Leu Pro Ala Asp Lys Ile Pro Glu

195 200 205

Lys Leu Val Glu Leu Val Gly Ala Pro

210 215

<210> 51

<211> 651

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 51

gggaattctg gttctatcgt ttctggtaaa gttgttgtta tcggttcttc taccggtggt 60

ccgcgttctc tggacctggt tatcccgccg ctgccgaaag acttcccggc tccgatcctg 120

ctggttcagc acggtggtct ggacaacggt tcttacaccg gtggtaccaa atctctggct 180

cagcgtctgg accgtatctc taacctgtct gttaaagaag ctgaagaagg tgacgttctg 240

aaaccgggtt gggtttacgt tgctccgggt gactaccaca tgggtatcaa ataccaggac 300

aaaaaaggta tcatctacct ggacaaatct ggtggtgacc gtaacggtta ctctgctggt 360

ggtgttcgtc cggctgttga ctacaccctg gacaaagttg ctgaaatcta caaagaaaac 420

accatcgctg ttatcctgac cggtggtctg gttgacggtc gtgaagctgg tggtgacggt 480

accaagggcg cgttcaaagt taaatttttc aaaggtgttg ttatcgctga atctcaggaa 540

acctctgttg ttttcggtat gccgaaatct gttatcgaag aaggttacgc tgactacgtt 600

ctgccggctg acaaaatccc ggaaaaactg gttgaactgg ttggcgcgcc a 651

<210> 52

<211> 212

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 52

Gly Ser His Met Val Ser Gly Lys Ile Val Val Ile Gly Ser Ser Thr

1 5 1015

Gly Gly Pro Arg Ser Leu Asp Met Ile Ile Pro Asn Leu Pro Lys Asn

202530

Phe Pro Ala Pro Ile Val Val Val Gln His Gly Val Ser Trp Trp Gly

354045

Gly Gly Ser Trp Gly Thr Lys Ser Leu Ala Gln Arg Leu Asp Ser Thr

505560

Ser Glu Leu Thr Val Lys Glu Ala Glu Asp Gly Glu Glu Val Lys Pro

65707580

Gly Phe Val Tyr Ile Ala Pro Gly Asp Phe His Leu Gly Leu Lys Ala

859095

Gln Asn Gly Lys Val Phe Phe Phe Leu Asp Lys Ser Gly Arg Thr Tyr

100 105 110

Tyr Gly Leu Ala Ala Trp Gly Val Arg Pro Ala Val Asp Phe Thr Leu

115 120 125

Asp Lys Ala Ala Glu Ile Tyr Lys Glu Lys Thr Ile Ala Val Ile Leu

130 135 140

Thr Gly Gly Asp Ala Glu Gly Trp Tyr Leu Gly Gly Asp Gly Thr Lys

145 150 155 160

Gly Ala Phe Lys Val Lys Phe Tyr Gly Gly Thr Val Ile Ala Glu Asp

165 170 175

Lys Glu Thr Ser Val Val Phe Gly Met Pro Lys Ser Val Ile Glu Glu

180 185 190

Gly Tyr Ala Asp Tyr Val Leu Pro Ala Tyr Lys Ile Pro Glu Lys Leu

195 200 205

Ile Glu Leu Val

210

<210> 53

<211> 212

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 53

Gly Ser His Met Val Ser Gly Lys Ile Val Val Ile Gly Ser Ser Thr

1 5 1015

Gly Gly Pro Arg Ser Leu Asp Met Ile Ile Pro Asn Leu Pro Lys Asn

202530

Phe Pro Ala Pro Ile Val Val Val Gln His Gly Trp Gly Glu Val Gly

354045

Glu Thr Glu Val Gly Thr Lys Ser Leu Ala Gln Arg Leu Asp Ser Thr

505560

Ser Glu Leu Thr Val Lys Glu Ala Glu Asp Gly Glu Glu Val Lys Pro

65707580

Gly Phe Val Tyr Ile Ala Pro Gly Asp Phe His Leu Gly Leu Lys Ala

859095

Gln Asn Gly Lys Val Phe Phe Phe Leu Asp Lys Ser Gly Tyr Ser Tyr

100 105 110

Ala Gly Glu Leu Trp Arg Gly Val Arg Pro Ala Val Asp Phe Thr Leu

115 120 125

Asp Lys Ala Ala Glu Ile Tyr Lys Glu Lys Thr Ile Ala Val Ile Leu

130 135 140

Thr Gly Gly Ser Trp Trp Gly Asp Leu Trp Gly Gly Asp Gly Thr Lys

145 150 155 160

Gly Ala Phe Lys Val Lys Phe Tyr Gly Gly Thr Val Ile Ala Glu Asp

165 170 175

Lys Glu Thr Ser Val Val Phe Gly Met Pro Lys Ser Val Ile Glu Glu

180 185 190

Gly Tyr Ala Asp Tyr Val Leu Pro Ala Tyr Lys Ile Pro Glu Lys Leu

195 200 205

Ile Glu Leu Val

210

<210> 54

<211> 212

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 54

Gly Ser His Met Val Ser Gly Lys Ile Val Val Ile Gly Ser Ser Thr

1 5 1015

Gly Gly Pro Arg Ser Leu Asp Met Ile Ile Pro Asn Leu Pro Lys Asn

202530

Phe Pro Ala Pro Ile Val Val Val Gln His Gly Tyr Asp Thr Leu Gly

354045

Trp Trp Gly Asp Gly Thr Lys Ser Leu Ala Gln Arg Leu Asp Ser Thr

505560

Ser Glu Leu Thr Val Lys Glu Ala Glu Asp Gly Glu Glu Val Lys Pro

65707580

Gly Phe Val Tyr Ile Ala Pro Gly Asp Phe His Leu Gly Leu Lys Ala

859095

Gln Asn Gly Lys Val Phe Phe Phe Leu Asp Lys Ser Gly Asp Asp Tyr

100 105 110

Val Gly Tyr Gly Tyr Leu Gly Val Arg Pro Ala Val Asp Phe Thr Leu

115 120 125

Asp Lys Ala Ala Glu Ile Tyr Lys Glu Lys Thr Ile Ala Val Ile Leu

130 135 140

Thr Gly Gly Asp Trp Arg Gly Val Trp Gly Gly Gly Asp Gly Thr Lys

145 150 155 160

Gly Ala Phe Lys Val Lys Phe Tyr Gly Gly Thr Val Ile Ala Glu Asp

165 170 175

Lys Glu Thr Ser Val Val Phe Gly Met Pro Lys Ser Val Ile Glu Glu

180 185 190

Gly Tyr Ala Asp Tyr Val Leu Pro Ala Tyr Lys Ile Pro Glu Lys Leu

195 200 205

Ile Glu Leu Val

210

<210> 55

<211> 212

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 55

Gly Ser His Met Val Ser Gly Lys Ile Val Val Ile Gly Ser Ser Thr

1 5 1015

Gly Gly Pro Arg Ser Leu Asp Met Ile Ile Pro Asn Leu Pro Lys Asn

202530

Phe Pro Ala Pro Ile Val Val Val Gln His Gly Ala Gly Trp Trp Gly

354045

Gly Gly Ala Arg Gly Thr Lys Ser Leu Ala Gln Arg Leu Asp Ser Thr

505560

Ser Glu Leu Thr Val Lys Glu Ala Glu Asp Gly Glu Glu Val Lys Pro

65707580

Gly Phe Val Tyr Ile Ala Pro Gly Asp Phe His Leu Gly Leu Lys Ala

859095

Gln Asn Gly Lys Val Phe Phe Phe Leu Asp Lys Ser Gly Arg Val Trp

100 105 110

Ala Gly Ala Glu Ala Trp Gly Val Arg Pro Ala Val Asp Phe Thr Leu

115 120 125

Asp Lys Ala Ala Glu Ile Tyr Lys Glu Lys Thr Ile Ala Val Ile Leu

130 135 140

Thr Gly Gly Ser Glu Thr Gly Ser Trp Gly Gly Gly Asp Gly Thr Lys

145 150 155 160

Gly Ala Phe Lys Val Lys Phe Tyr Gly Gly Thr Val Ile Ala Glu Asp

165 170 175

Lys Glu Thr Ser Val Val Phe Gly Met Pro Lys Ser Val Ile Glu Glu

180 185 190

Gly Tyr Ala Asp Tyr Val Leu Pro Ala Tyr Lys Ile Pro Glu Lys Leu

195 200 205

Ile Glu Leu Val

210

<210> 56

<211> 212

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 56

Gly Ser His Met Val Ser Gly Lys Ile Val Val Ile Gly Ser Ser Thr

1 5 1015

Gly Gly Pro Arg Ser Leu Asp Met Ile Ile Pro Asn Leu Pro Lys Asn

202530

Phe Pro Ala Pro Ile Val Val Val Gln His Gly Asp Ala Trp Trp Gly

354045

Gly Gly Trp Arg Gly Thr Lys Ser Leu Ala Gln Arg Leu Asp Ser Thr

505560

Ser Glu Leu Thr Val Lys Glu Ala Glu Asp Gly Glu Glu Val Lys Pro

65707580

Gly Phe Val Tyr Ile Ala Pro Gly Asp Phe His Leu Gly Leu Lys Ala

859095

Gln Asn Gly Lys Val Phe Phe Phe Leu Asp Lys Ser Gly Asp Ser Tyr

100 105 110

Thr Gly Asn Trp Ala Trp Gly Val Arg Pro Ala Val Asp Phe Thr Leu

115 120 125

Asp Lys Ala Ala Glu Ile Tyr Lys Glu Lys Thr Ile Ala Val Ile Leu

130 135 140

Thr Gly Gly Ala Ser Thr Gly Tyr Asn Gly Gly Gly Asp Gly Thr Lys

145 150 155 160

Gly Ala Phe Lys Val Lys Phe Tyr Gly Gly Thr Val Ile Ala Glu Asp

165 170 175

Lys Glu Thr Ser Val Val Phe Gly Met Pro Lys Ser Val Ile Glu Glu

180 185 190

Gly Tyr Ala Asp Tyr Val Leu Pro Ala Tyr Lys Ile Pro Glu Lys Leu

195 200 205

Ile Glu Leu Val

210

<210> 57

<211> 212

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 57

Gly Ser His Met Val Ser Gly Lys Ile Val Val Ile Gly Ser Ser Thr

1 5 1015

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Gly Ala Phe Lys Val Lys Phe Tyr Gly Gly Thr Val Ile Ala Glu Asp

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<213> 人工序列

<220>

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

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100 105 110

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Thr Lys Gly Ala Phe Lys Val Lys Phe Tyr Gly Gly Thr Val Ile Ala

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180 185 190

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Lys Leu Ile Glu Leu Val

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 79

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Gly Ala Phe Lys Val Lys Phe Tyr Gly Gly Thr Val Ile Ala Glu Asp

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195 200 205

Ile Glu Leu Val

210

<210> 80

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 80

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Val

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tctctggaca tgatcatccc gaacctgccg aaaaacttcc cggctccgat cgttgttgtt 120

cagcac 126

<210> 82

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 82

accaaatctc tggctcagcg tctggactct acctctgaac tgaccgttaa agaagctgaa 60

gacggtgaag aagttaaacc gggtttcgtt tacatcgctc cgggtgactt ccacctgggt 120

ctgaaagctc agaacggtaa agttttcttc ttcctggaca aatct 165

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<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

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atcgctgtta tcctgaccgg t 81

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成构建体

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 85

Gly Gly Leu Asp Asn Gly Ser Tyr Thr Gly Gly

1 5 10

<210> 86

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

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1 5 10

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1 5 10