基于光敏DNA的图形模版及图形制备方法

技术领域

本发明涉及纳米图形制备领域，特别是涉及一种基于光敏DNA的图形模版及图形制备方法。

背景技术

以亚微米级精度在表面上操作功能材料是表面工程中的一项关键挑战，影响着从生物学到光学和材料科学的应用。生物材料和微纳结构的表面图案化在构建防润湿表面、细胞迁移研究、生成表面等离子共振传感器以及微流体研究等方面有起着至关重要的作用。各种光刻技术的发明极大加速了生物材料和微纳结构的表面图案化方法的发展。然而，复杂表面结构具有多种功能并且包含从分子到纳米粒子多种材料，发展一种多样的刻蚀图案化策略用以构建这样的复杂表面结构是极具挑战的。最近的图案化策略过程变得越来越复杂，且需要众多大型昂贵设备，一般的科研人员无法轻易使用。一方面，用于材料图案化的方法包括扫描探针光刻、电子束和光刻和纳米压印等技术，这些技术通常涉以侵入性的形式将热能、机械能、电子和电能传递到基板，特别依赖于破坏基底表面以实现材料图案化，这就限制了可以与其一起使用的材料和基底的类型和数量，同时又反过来限制了这些图案化方法的应用范围。另一方面，这些自上而下的材料图案化的方法需要洁净室环境，过程耗时，需要昂贵的耗材，并且不可避免地涉及需要专业人员操作或需要接受专业培训才能使用，增加了实用的门槛。此外，对于基于掩模的光刻，对图案设计的任何轻微修改都需要整个过程从头再来，从而导致基于材料图案化的器件迭代之间的显着延迟。

进一步，高真空和高能辐射会导致生物分子失活，这一点也已经被用来实现材料图案化，例如通过在电子束照射下选择性消融生物分子来形成图案。相比之下，在表面上实现对功能性生物分子(如抗体或DNA适体)的图案护化，在高通量生物传感器和生物诊断中的具有广泛应用前景。这种微阵列越来越多地用于构建生物医学和环境研究中的蛋白质和小分子传感器，其进一步的发展将使系统范围的蛋白质组和相互作用组研究，以及其在活细胞和组织的动态分子分析中得到更广泛的采用。这就需要图案化的生物分子仍具有活性，可进一步作为模板，对例诸如核酸或蛋白质、生物分子以及纳米级颗粒等各种分析物进行二次固定。此外，在胶体领域，通过精准调控等离子体纳米组装体的结构，发展出一系列不同物理性质的等离子体传感器，应用于从制造中的机械压力测量到检测生物医学样品中的蛋白质浓度等不同领域，但与分子系统相比，纳米组装体因其大的尺寸和质量，通常不能很好地转移到指定的表面。尽管基于尖端的纳米光刻技术取得了进展，但由于纳米粒子转移系统的困难，纳米组装体的受控图案化仍然是一项重大挑战。

为了避免这些缺点，特定的界面修饰，包括化学接头和寡核苷酸，在基于表面纳米组装的生物传感器工程学方面受到了相当大的关注。表面上自组装的多功能性可用于形成不同的纳米粒子系统，进一步推动了纳米粒子系统的发展。具体来说，由于其可预测和可编程的杂交相互作用，DNA已被用作各种亚微米结构的通用工程模板。最近，研究人员已经投入了大量精力来设计具有复杂表面结构的DNA修饰表面，这些表面既包括诸如蛋白质的非核酸化合物，也包括功能性DNA器件及结构DNA纳米技术。重要的是，由于寡核苷酸易于修饰的特性，DNA已被广泛用于引导各种纳米粒子的自组装，包括碳纳米管、等离子体纳米粒子和各种生物分子，形成所需的几何形状。此外，DNA生物芯片的进步创建了人造材料和生命系统之间功能连接的接口。

尽管在基于DNA的表面改性领域取得了这些显着进步，但发展仅使用非侵入性和最少的额外输入且不产生环境污染物的无掩模策略，生成具有亚微米分辨率的几何复杂多组分图案的需求尚未得到满足。

应该注意，上面对技术背景的介绍只是为了方便对本申请的技术方案进行清楚、完整的说明，并方便本领域技术人员的理解而阐述的。不能仅仅因为这些方案在本申请的背景技术部分进行了阐述而认为上述技术方案为本领域技术人员所公知。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于光敏DNA的图形模版及图形制备方法，以实现一种不破坏生物分子活性的图形制备方法。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种基于光敏DNA的图形制备方法，所述图形制备方法包括步骤：提供一基底，对所述基底表面进行钝化处理；于所述基底表面修饰锚定-DNA链、偶氮苯-DNA链和引导组装DNA链，其中，所述偶氮苯-DNA链的第一端与所述锚定-DNA链具有第一杂交片段，所述偶氮苯-DNA链的第二端与所述引导组装DNA链具有第二杂交片段；对所述偶氮苯-DNA链与所述引导组装DNA链的第二杂交片段按设定图形进行光照，基于光照使所述偶氮苯-DNA链与所述引导组装DNA链解链，以将光照区域的所述引导组装DNA链从所述偶氮苯-DNA链上去除；在保留有所述引导组装DNA链的区域组装修饰材料，以获得所述设定图形。

可选地，所述光照为波长介于300nm～400nm的单光子紫外光或波长介于650nm～800nm之间的双光子，在单光子紫外光或双光子光照下的偶氮苯由平面反式结构转变为非平面顺式结构，从而使所述偶氮苯-DNA链与所述引导组装DNA链解链。

可选地，所述光照的方式包括双光子扫描照射模式、带掩模的宽场照射模式以及数字镜设备照射模式中的一种。

可选地，所述基底为玻璃基底，对所述基底表面进行钝化处理的材料包括聚乙二醇-硅烷与生物素-聚乙二醇-硅烷，以使锚定DNA链可特异连接修饰在所述玻璃基底上。

可选地，在所述玻璃基底上修饰聚乙二醇-硅烷和生物素-聚乙二醇-硅烷包括步骤：利用浓度为40％以上的HNO

可选地，所述偶氮苯-DNA链包含第一片段和第二片段，所述第一片段为天然DNA片段，该第一片段序列与基底上的所述锚定DNA链互补，用于将所述偶氮苯-DNA链锚定在所述基底上，所述第二片段包括多个寡核苷酸组成的光敏片段，其中若干个偶氮苯修饰的碱基作为结构转换域，该结构转换域中的偶氮苯在光照下由平面反式结构转变为非平面顺式结构，从而使所述偶氮苯-DNA链与所述引导组装DNA链解链。

可选地，所述光敏片段序列中，每隔两个碱基修饰一个偶氮苯分子。

可选地，所述引导组装DNA链包含第一片段和第二片段，所述第一片段与所述光敏片段互补，用于通过所述光敏片段的结构转换域控制所述引导组装DNA链与锚定在基底上的偶氮苯-DNA链的杂交或解链，从而实现所述引导组装DNA链的图案化。

可选地，将所述第二片段作为结合位点，通过与所述修饰材料的互补DNA链杂交，引导所述修饰材料的组装，以实现所述修饰材料的再次图案化。

可选地，所述修饰材料包括DNA修饰的纳米级颗粒、生物分子及DNA修饰的荧光基团中的一种。

可选地，所述修饰材料包括依次相连的多层DNA修饰层，相邻的所述DNA修饰层之间通过互补DNA形成连接，其中，多层DNA修饰层的材料包括DNA修饰的纳米级颗粒、DNA修饰的荧光基团和生物分子中的一种或多种。

可选地，多层所述DNA修饰层为依次孵育或同时孵育。

可选地，所述制备方法还包括步骤：通过可见光照射，使所述偶氮苯-DNA链从非平面顺式结构转变为平面反式结构，并恢复与所述引导组装DNA链的杂交，使得所述偶氮苯-DNA链具有的重写能力。

本发明还提供一种基于光敏DNA的图形模版，包括：基底，所述基底表面具有钝化层；锚定DNA链、偶氮苯-DNA链和引导组装DNA链，依次修饰于所述钝化层表面，所述偶氮苯-DNA链的第一端与所述锚定DNA链具有第一杂交片段，所述偶氮苯-DNA链的第二端与所述引导组装DNA链具有第二杂交片段，其中，所述偶氮苯-DNA链与所述引导组装DNA链的第二杂交片段可在光照下解链，以将光照区域的所述引导组装DNA链从所述偶氮苯-DNA链上去除。

可选地，所述基底为玻璃基底，所述钝化层的材料包括聚乙二醇-硅烷和生物素-聚乙二醇-硅烷，以使锚定DNA可特异连接修饰在所述玻璃基底上。

可选地，所述偶氮苯-DNA链包含第一片段和第二片段，所述第一片段为天然DNA片段，该第一片段序列与基底上的所述锚定DNA链互补，用于将所述偶氮苯-DNA链锚定在所述基底上，所述第二片段包括多个寡核苷酸组成的光敏片段，其中若干个偶氮苯修饰的碱基作为结构转换域，该结构转换域中的偶氮苯在光照下由平面反式结构转变为非平面顺式结构，从而使所述偶氮苯-DNA链与所述引导组装DNA链解链。

可选地，所述光敏片段序列中，每隔两个碱基修饰一个偶氮苯分子。

可选地，所述引导组装DNA链包含第一片段和第二片段，所述第一片段与所述光敏片段互补，用于通过所述光敏片段的结构转换域控制所述引导组装DNA链与锚定在基底上的偶氮苯-DNA链的杂交或解链，从而实现所述引导组装DNA链的图案化，所述第二片段作为结合位点，用于与修饰材料的互补DNA链杂交，引导所述修饰材料的组装，以实现二次图案化。

可选地，所述修饰材料包括DNA修饰的纳米级颗粒、生物分子及DNA修饰的荧光基团中的一种。

可选地，所述修饰材料包括依次相连的多层DNA修饰层，相邻的所述DNA修饰层之间通过互补DNA形成连接，其中，多层DNA修饰层的材料包括DNA修饰的纳米级颗粒、DNA修饰的荧光基团和生物分子中的一种或多种。

可选地，所述偶氮苯-DNA链与所述引导组装DNA链的第二杂交片段在光照下解链后，通过可见光照射可使所述偶氮苯-DNA链从非平面顺式结构转变为平面反式结构，并恢复与所述引导组装DNA链的杂交，使得所述偶氮苯-DNA链具有的重写能力。

如上所述，本发明的基于光敏DNA的图形模版及图形制备方法，具有以下有益效果：

本发明通过采用波长较大的双光子光照实现偶氮苯-DNA链与引导组装DNA链解链，双光子光照可通过较大波长的光照满足偶氮苯-DNA链与引导组装DNA链解链，即使用非常低功率的双光子激光器便可以实现最佳的DNA链光开关调控效率，从而有效避免了使用波长较短的紫外光对DNA链或生物分子活性造成失活的影响，防止了生物分子受到的热损伤，大大提高了本发明的应用范围。

本发明通过光照使偶氮苯-DNA链从平面反式结构转变为非平面顺式结构，实现与引导组装DNA链解链，之后可通过可见光照射可使偶氮苯-DNA链从非平面顺式结构转变为平面反式结构，并恢复与所述引导组装DNA链的杂交，使得所述偶氮苯-DNA链具有的重写能力。

本发明可通过双光子扫描模式形成所需图形，为多功能、无掩模、无需洁净室和环保的光刻方法提供了一种可行性方案。

附图说明

所包括的附图用来提供对本申请实施例的进一步的理解，其构成了说明书的一部分，用于说明本申请的实施方式，并与文字描述一起来阐释本申请的原理。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例。

图1A显示为本发明实施例的基于光敏DNA的图形制备方法(DNA-POINT)各步骤所呈现的结构示意图，图1B显示为JHU图案作为金纳米颗粒(AuNPs)自组装的模板，放大图像中的点代表单个AuNP。

图2显示为本发明界面上可转换DNA的光调节的示意图，其中，图2A显示为界面处单光子驱动的DNA双螺旋杂交切换示意图，暗场图像显示在紫外线照射10分钟之前和之后表面上连接的AuNPs，AuNP散射强度的分析揭示了开关效率；图2B显示为表面上双光子驱动DNA双螺旋杂交的切换示意图，暗场图像分别展示了在0％、0.2％、0.5％、1％、2％和3％的激光功率下，界面上连接的AuNPs，AuNP散射强度的分析给出了开关效率作为不同激光功率的函数。

图3显示本发明扫描模式下实现的无掩模亚微米图案，其中，图3A显示为利用DNA-POINT形成的AuNP虚线图案，宽度分别为1μm、2μm和10μm。线截面的强度分布是通过高斯拟合来分析的；图3B显示为连有AuNPs的线型网格和方块阵列的对称图案及卷线不对称图案。

图4显示为本发明不同材料和多层的自组装示意图，其中，图4A作为互补的第二层的DNA层，在原始光驱动形成的DNA修饰图案上，利用互补的第二层的DNA层实现进一步图案化。荧光(FL)图像显示没有Cy3荧光分子标记的DNA区域形成负的JHU图案；图4B显示为由图案化的光驱动DNA的原始层、其上自组装的AuNPs层(第二层)和以AuNPs层为模板组装的DNA层(第三层)组成的三层图案，相关暗场(DF)、荧光(FL)和叠加图像分别显示了AuNP的绿色散射、Cy3标记的DNA的伪红色荧光和共定位。

图5显示为本发明通过DNA-POINT控制的RGD簇调节细胞粘附和扩散，其中，图5A显示为用于细胞接种的高密度自组装AuNPs层示意图，随附的明场图像显示孵育6小时后的小圆形细胞；图5B显示为添加与金纳米粒子连接的RGD修饰DNA后形成的RGD簇，相应的明场图像清楚地显示了孵育6小时后的贴壁(伸长)细胞。图5C限位显示使用光控RGD簇密度动态调节细胞粘附和扩散的插图，图5D和图5E分别显示为明场图像分别显示光照前后的细胞大小和形状。图5F显示为细胞大小的统计分析表明，光照前后细胞的平均大小分别为3680±175μm

图6A显示为偶氮苯修饰的DNA的结构，图6B显示为Cy3修饰的DNA的结构。

图7显示为DNA分子在本发明的DNA-POINT表面的特异性结合示意图，其中，图7A显示为Cy5-DNA与用互补的锚定DNA修饰的表面一起孵育示意图，图7B显示为Cy5-DNA与没有用互补的锚定DNA修饰的表面一起孵育示意图。

图8显示为金纳米粒子在本发明的DNA-POINT表面的特异性结合示意图，其中，图8A将DNA修饰的40nm金纳米粒子与用生物素标记的互补DNA修饰的表面一起孵育示意图，图8B显示为将DNA修饰的40nm金纳米粒子与没有生物素标记的互补DNA修饰的表面一起孵育示意图。

图9显示为金纳米粒子在不同结合位点和孵育时间的表面上的结合动力学示意图，其中，图9A显示为暗场图像显示不同比例的PEG和生物素-PEG改性表面在孵育3小时后金纳米粒子的结合密度；图9B显示为将Track Mate软件整合到Image J中，用作粒子计数的点检测器示意图，图9C及图9D分别显示为在10分钟和3小时的不同结合位点的表面上的金纳米粒子密度示意图。

图10显示为将JHU图案在黑盒子内的选择性非照明区域中的形成的示意图。

图11显示为DNA结构的光转换的电泳分析，每个DNA结构在15％PAGE凝胶上以100V运行60分钟，以及SybrGold染色凝胶的倒置照片，左侧泳道包含可见(VIS)光照射后的偶氮苯修饰DNA和组装引导DNA，右侧泳道包含经紫外光照射后的偶氮苯修饰DNA和组装引导DNA，开关效率确定为85±2.8％。

图12显示为本发明DNA-POINT的重写能力示意图，用可见光-紫外-可见光照射循环依次处理基板，并且在每次照射处理后孵育金纳米粒子，表面通过暗场显微镜成像，AuNPs密度用于计算结合效率。

图13显示为暗场显微镜显示表面上有高密度的AuNP，从而在双光子扫描后确认PEG和DNA层的功能性保留，其中，图13A显示为通过双光子激发系统扫描生物素-PEG-硅烷修饰的表面，然后按顺序与中性亲和素、锚定DNA、偶氮苯-DNA、引导组装DNA和互补DNA修饰的AuNPs一起孵育。暗场图像显示了AuNP修饰到玻璃基底表面，表明PEG层没有被双光子扫描损坏；图13B显示为本发明设计的对照DNA，替代偶氮苯-DNA和引导组装DNA，与锚定DNA和DNA修饰的AuNPs杂交示意图。将生物素-PEG-硅烷、中性亲和素、锚定DNA和对照DNA对玻璃表面进行修饰，然后用双光子激光扫描，然后将DNA修饰的AuNPs在此玻璃基底进行孵育，暗场图像显示了AuNPs成功的修饰到了玻璃基底表面，表明DNA层没有被双光子扫描损坏。

图14显示为明场图像的细胞大小分析示意图，该过程与二进制和轮廓测量一致。

元件标号说明

101基底

102钝化层

103锚定DNA链

104偶氮苯-DNA链

105引导组装DNA链

106修饰材料

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

应该强调，术语“包括/包含”在本文使用时指特征、整件、步骤或组件的存在，但并不排除一个或更多个其它特征、整件、步骤或组件的存在或附加。

针对一种实施方式描述和/或示出的特征可以以相同或类似的方式在一个或更多个其它实施方式中使用，与其它实施方式中的特征相组合，或替代其它实施方式中的特征。

如在详述本发明实施例时，为便于说明，表示器件结构的剖面图会不依一般比例作局部放大，而且所述示意图只是示例，其在此不应限制本发明保护的范围。此外，在实际制作中应包含长度、宽度及深度的三维空间尺寸。

为了方便描述，此处可能使用诸如“之下”、“下方”、“低于”、“下面”、“上方”、“上”等的空间关系词语来描述附图中所示的一个元件或特征与其他元件或特征的关系。将理解到，这些空间关系词语意图包含使用中或操作中的器件的、除了附图中描绘的方向之外的其他方向。此外，当一层被称为在两层“之间”时，它可以是所述两层之间仅有的层，或者也可以存在一个或多个介于其间的层。

在本申请的上下文中，所描述的第一特征在第二特征“之上”的结构可以包括第一和第二特征形成为直接接触的实施例，也可以包括另外的特征形成在第一和第二特征之间的实施例，这样第一和第二特征可能不是直接接触。

需要说明的是，本实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，遂图示中仅显示与本发明中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制，其实际实施时各组件的型态、数量及比例可为一种随意的改变，且其组件布局型态也可能更为复杂。

尽管在基于DNA的表面改性领域取得了显著的进步，但发展仅使用非侵入性和最少的额外输入且不产生环境污染物的无掩模策略，生成具有亚微米分辨率的几何复杂多组分图案的需求尚未得到满足。因此，为了解决这些紧迫的需求，本发明提出了一种光敏DNA表面，它可以连接纳米材料自下而上自组装和自上而下的工程系统，为实现两种制造之间规模集成提供理想的平台。偶氮苯可以掺入DNA链中以实现DNA杂交的可逆调控，含有偶氮苯部分的光响应寡核苷酸可以作为有效的单分子开关。值得注意的是，该过程不会分解或诱导不良副反应，光是各种能源中能够提供清洁无废物的激发源，具有内在生物相容性且极易获得。本发明通过自上而下的光驱动DNA模式提供了分子和纳米粒子在轴向平面上的精确位置控制，以及沿垂直平面自下而上自组装多层的模板。这种DNA表面图案化的方法开辟了自下而上的DNA纳米技术与自上而下的光刻工艺集成的可能性。

基于以上所述，本发明提供了一种用于纳米材料形貌光学印记的DNA图案化(DNAPatterning of Optical Imprint for Nanomaterials Topography，简称DNA-POINT)技术，其利用光诱导的生物识别DNA图案，可在短时间内构建纳米材料表面结构。在这项研究中，本发明制定了一种基于偶氮苯的光驱动分子运动的合成策略，并将其整合到DNA双螺旋中，能够在商业扫描显微镜下对玻璃表面上的DNA杂交进行光开关调控。因此，利用模板化各种分子或纳米粒子自组装的DNA修饰表面，本发明展示了在DNA模板上由分子和纳米粒子通过自组装构建的多层混合结构。最后，本发明还展示了带有偶氮苯修饰的DNA杂交的多光子转换，并开发了DNA-POINT的扫描模式，为发展多功能、无掩模、无需洁净室和环保的光刻方法铺平了道路。

如图1所示，本发明提供一种基于光敏DNA的图形制备方法，所述图形制备方法包括步骤：提供一基底101，对所述基底101表面进行钝化处理，以形成钝化层102；于所述基底101表面修饰锚定DNA链103、偶氮苯-DNA链104和引导组装DNA链105，其中，所述偶氮苯-DNA链104的第一端与所述锚定DNA链103具有第一杂交片段，所述偶氮苯-DNA链104的第二端与所述引导组装DNA链105具有第二杂交片段；对所述偶氮苯-DNA链104与所述引导组装DNA链105的第二杂交片段按设定图形进行光照，基于光照使所述偶氮苯-DNA链104与所述引导组装DNA链105解链，以将光照区域的所述引导组装DNA链105从所述偶氮苯-DNA链104上去除；在保留有所述引导组装DNA链105的区域组装修饰材料106，以获得所述设定图形。

在一个实施例中，所述光照为波长介于650nm～800nm之间的双光子，在双光子光照下的偶氮苯由平面反式结构转变为非平面顺式结构，从而使所述偶氮苯-DNA链104与所述引导组装DNA链105解链。

在一个实施例中，所述光照为波长为365nm的单光子紫外光，在365nm紫外光照下的偶氮苯由平面反式结构转变为非平面顺式结构，从而使所述偶氮苯-DNA链104与所述引导组装DNA链105解链。

在一个实施例中，所述光照的方式包括双光子扫描照射模式、带掩模的宽场照射模式以及数字镜设备照射模式中的一种。

在一个实施例中，所述基底101为玻璃基底，对所述基底表面进行钝化处理的材料包括聚乙二醇-硅烷和生物素-聚乙二醇-硅烷，以使锚定DNA可特异连接修饰在所述玻璃基底上。

在一个实施例中，在所述玻璃基底上修饰聚乙二醇-硅烷和生物素-聚乙二醇-硅烷包括步骤：利用浓度为40％以上的HNO

在一个实施例中，所述锚定DNA链103可以为：

5`-GAGCTGCACGCTGCCGTCAAAAAAAAAA-biotin-3`，其中，biotin代表DNA链端修饰的生物素分子。

在一个实施例中，所述偶氮苯-DNA链104包含第一片段和第二片段，所述第一片段为天然DNA片段，该第一片段序列与基底上的所述锚定DNA链103互补，用于将所述偶氮苯-DNA链104锚定在所述基底上，所述第二片段包括多个寡核苷酸组成的光敏片段，其中若干个偶氮苯修饰的碱基作为结构转换域，该结构转换域中的偶氮苯在光照下由平面反式结构转变为非平面顺式结构，从而使所述偶氮苯-DNA链104与所述引导组装DNA链105解链。在一个具体示例中，所述偶氮苯-DNA链104的序列为5`-GACGGCAGCGTGCAGCTCTGXAAXCTXAAXCG-3`，其中，X为修饰在DNA链上的偶氮苯分子，序列GACGGCAGCGTGCAGCTC为天然DNA片段，其可与锚定DNA链103杂交连接，序列TGXAAXCTXAAXCG为光敏片段。一个具体的偶氮苯-DNA链104结构如图6A所示。

在一个实施例中，所述光敏片段序列中，每隔两个碱基修饰一个偶氮苯分子。

在一个实施例中，所述引导组装DNA链105包含第一片段和第二片段，所述第一片段与所述光敏片段互补，用于通过所述光敏片段的结构转换域控制所述引导组装DNA链105与锚定在基底上的偶氮苯-DNA链104的杂交或解链，从而实现所述引导组装DNA链105的图案化。

在一个实施例中，将所述第二片段作为结合位点，通过与所述修饰材料106的互补DNA链杂交，引导所述修饰材料106的组装，以实现所述修饰材料的再次图案化。在一个具体示例中，第一种引导组装DNA链105的序列可以为：

5`-ATGATATAGACGTTGTGGCCGTTAGTTCA-3`；

其中，序列CGTTAGTTCA为光敏互补片段，其可与偶氮苯-DNA链104的光敏片段形成杂交，序列ATGATATAGACGTTGTGGC为组装片段。第二种引导组装DNA链105的序列可以为：

5`-CCACAACGTCTATATCATCGTTAGTTCA-3`；

其中，序列CGTTAGTTCA为光敏互补片段，其可与偶氮苯-DNA链104的光敏片段形成杂交，序列CCACAACGTCTATATCAT为组装片段。

在一个实施例中，所述修饰材料106包括DNA修饰的纳米级颗粒、生物分子及DNA修饰的荧光基团中的一种。所述纳米级颗粒及生物分子例如可以为蛋白质、碳水化合物、银金纳米级颗粒和纳米级颗粒等，且并不限于此处所列举的示例。在一个具体示例中，第一种DNA修饰的金纳米颗粒可以为：

5`-GCCACAACGTCTATATCATAAAAAAAA-thiol-3`；

其中，序列GCCACAACGTCTATATCAT为互补片段，其可与上述的第一种引导组装DNA链105的组装片段杂交；

或者，第二种DNA修饰的金纳米颗粒可以为：

5`-ATGATATAGACGTTGTGGCAAAAAAAA-thiol-3`；

其中，序列ATGATATAGACGTTGTGG为互补片段，其可与上述的第二种引导组装DNA链105的组装片段杂交；

其中，thiol代表DNA链3端修饰的巯基分子，通过巯基与纳米金表面形成Au-S化学键将DNA分子修饰到纳米金表面，实现纳米金颗粒的图案化。

在一个具体示例中，DNA修饰的金纳米颗粒制备包括以下步骤：

(1)修饰DNA之前，将40nm的AuNPs(BBI)胶体溶液通过离心浓缩10倍(40nm的AuNPs：以8000rpm的转速离心10分钟)。

(2)利用TCEP(20mM,1h)将巯基修饰的DNA链中的二硫键还原为单巯基，以便与纳米金表面形成Au-S化学键将DNA分子修饰到纳米金表面。之后使用尺寸排阻柱(G-25，GEHealthcare)纯化还原后的DNA以去除多余的TCEP及反应产生的其他小分子。

(3)将800μL浓缩的AuNPs胶体溶液与步骤(2)中新鲜还原的巯基修饰的DNA(100μM)以1:10,000的比例在水中混合，并将混合物在室温(300rpm)下孵育2小时。

(4)然后将100μL的PB缓冲液(100mM,pH＝7.4)添加到步骤(3)混合物中。

(5)30分钟后，我们每20分钟加入10μL的NaCl溶液(浓度2M)，共4次，然后每30分钟加入20μL的NaCl溶液(2M)，共3次。逐渐增加NaCl浓度以确保巯基修饰DNA完全覆盖AuNP。NaCl的最终浓度为200mM，混合物在室温(300rpm)下孵育过夜。

(6)过夜孵育后，通过离心的方法纯化AuNP-DNA。

(7)新鲜制备的、完全被DNA覆盖的40nm的AuNP在PBS缓冲液(100mM，pH8.0)中没有沉淀。DNA完全覆盖的AuNP的这种高耐盐性使其可以通过DNA杂交在界面组装。

在一个实施例中，所述修饰材料106包括依次相连的多层DNA修饰层，相邻的所述DNA修饰层之间通过互补DNA形成连接，其中，多层DNA修饰层的材料包括DNA修饰的纳米级颗粒、DNA修饰的荧光基团和生物分子中的一种或多种。所述DNA修饰的荧光基团，例如可以为Cy3-DNA链及Cy5-DNA链等。其中，Cy3-DNA链的序列可以为：

5`-GCCACAACGTCTATATCAT-Cy3-3`；

其中，Cy3代表DNA链端修饰的Cy3荧光分子。Cy3-DNA链与第一种引导组装DNA链105的组装片段杂交，将Cy3荧光分子固定在基底上，实现Cy3荧光分子的图案化。一个具体的Cy3荧光分子结构如图6B所示

Cy5-DNA链的序列可以为：

5`-GACGGCAGCGTGCAGCTC-Cy5-3`

Cy5代表DNA链端修饰的Cy5荧光分子。Cy5-DNA链可锚定DNA链103杂交，以将其固定在基底上。

在一个实施例中，多层所述DNA修饰层为依次孵育或同时孵育。

在一个实施例中，所述制备方法还包括步骤：通过可见光照射，使所述偶氮苯-DNA链104从非平面顺式结构转变为平面反式结构，并恢复与所述引导组装DNA链105的杂交，使得所述偶氮苯-DNA链104具有的重写能力。

如图1所示，本实施例还提供一种基于光敏DNA的图形模版，包括：基底，所述基底表面具有钝化层102；锚定DNA链103、偶氮苯-DNA链104和引导组装DNA链105，依次修饰于所述钝化层102表面，所述偶氮苯-DNA链104的第一端与所述锚定DNA链103具有第一杂交片段，所述偶氮苯-DNA链104的第二端与所述引导组装DNA链105具有第二杂交片段，其中，所述偶氮苯-DNA链104与所述引导组装DNA链105的第二杂交片段可在光照下解链，以将光照区域的所述引导组装DNA链105从所述偶氮苯-DNA链104上去除。

在一个实施例中，所述基底为玻璃基底，所述钝化层102的材料包括聚乙二醇-硅烷和生物素-聚乙二醇-硅烷，以使锚定DNA可特异连接修饰在所述玻璃基底上。

在一个实施例中，所述偶氮苯-DNA链104包含第一片段和第二片段，所述第一片段为天然DNA片段，该第一片段序列与基底上的所述锚定DNA链103互补，用于将所述偶氮苯-DNA链104锚定在所述基底上，所述第二片段包括多个寡核苷酸组成的光敏片段，其中若干个偶氮苯修饰的碱基作为结构转换域，该结构转换域中的偶氮苯在光照下由平面反式结构转变为非平面顺式结构，从而使所述偶氮苯-DNA链104与所述引导组装DNA链105解链。

在一个实施例中，所述光敏片段序列中，每隔两个碱基修饰一个偶氮苯分子。

在一个实施例中，所述引导组装DNA链105包含第一片段和第二片段，所述第一片段与所述光敏片段互补，用于通过所述光敏片段的结构转换域控制所述引导组装DNA链105与锚定在基底上的偶氮苯-DNA链104的杂交或解链，从而实现所述引导组装DNA链105的图案化，所述第二片段作为结合位点，用于与修饰材料106的互补DNA链杂交，引导所述修饰材料106的组装，以实现二次图案化。

在一个实施例中，所述修饰材料106包括DNA修饰的纳米级颗粒、生物分子及DNA修饰的荧光基团中的一种。

在一个实施例中，所述修饰材料106包括依次相连的多层DNA修饰层，相邻的所述DNA修饰层之间通过互补DNA形成连接，其中，多层DNA修饰层的材料包括DNA修饰的纳米级颗粒、DNA修饰的荧光基团和生物分子中的一种或多种。

在一个实施例中，所述偶氮苯-DNA链104与所述引导组装DNA链105的第二杂交片段在光照下解链后，通过可见光照射可使所述偶氮苯-DNA链104从非平面顺式结构转变为平面反式结构，并恢复与所述引导组装DNA链105的杂交，使得所述偶氮苯-DNA链104具有的重写能力。

如图1所示，在一个具体的实施过程中，基于光敏DNA的图形制备方法包括如下步骤：

步骤1)，钝化玻璃基底，包括：

(1)玻璃基底表面先用丙酮和等离子清洁5分钟，接着在浓硝酸中活化10分钟，之后用水和甲醇彻底冲洗两次。

(2)制备浓度为10mg/mL生物素-mPEG-硅烷与mPEG-硅烷混合液：混合液中含有80％mPEG-硅烷(浓度8mg/mL)和20％生物素-mPEG-硅烷(浓度为2mg/mL)，溶剂是甲醇。

(3)然后用生物素-mPEG-硅烷对玻璃基底表面进行改性，将其表面在(2)中新鲜制备的生物素-mPEG-硅烷与mPEG-硅烷混合液中孵育2小时。2小时孵育后，用甲醇冲洗盖玻片表面两次，然后用水洗涤3次，为之后修饰DNA涂层做准备。

步骤2)，制备DNA涂层，包括：

(1)将钝化的玻璃基底表面在PBS缓冲液中与500nM中性亲和素一起孵育20分钟，然后用PBS洗涤玻璃基底表面3次，每次洗涤5分钟，以除去没有修饰上的多余的中性亲和素。

(2)接下来，将玻璃基底表面在PBS缓冲液与制备的100nM锚定DNA链103孵育20分钟，然后用PBS洗涤玻璃基底表面3次，每次洗涤5分钟，以除去没有修饰上的多余的锚定DNA链103。

(3)最后，将预混合的50nM偶氮苯修饰DNA及其互补DNA链与表面孵育20分钟，然后在PBS中洗涤3次，每次洗涤5分钟。

步骤3)，利用双光子实现DNA层图案化，包括：

双光子光刻是在商用多光子激光扫描显微镜ZeissLSM510上进行的。它是一种用于非侵入性光刻的倒置显微镜，并配备了用于温度控制的腔室。本发明使用了40xNA1.0的水浸物镜和变色龙飞秒激光器(CoherentInc.)的750nm激光器来实现DNA层图案化。其中，利用偶氮苯结构转变从而实现DNA层图案化的双光子激光的波长范围是650nm-800nm。

当然，在不考虑生物分子活性及是否需要掩膜的情况下，也可以利用单光子实现DNA层图案化，包括：

将步骤2)中得到的PBS缓冲液覆盖的修饰有DNA层的玻璃基底表面暴露于5WUVLED二极管(365nm)照射10分钟，同时将加热板置于玻璃基板下进行37℃温度控制，UV灯与表面之间的距离保持在小于10mm，从而实现DNA层图案化。

步骤4)，第二层和第三层纳米功能材料的自组装，包括：

(1)用PBS缓冲液洗涤步骤3)或4)步骤中通过光子驱动得到的DNA图案两次，每次洗涤5分钟。

(2)然后，将作为第二层组分的0.1nMDNA修饰的AuNPs或100nMCy3标记的DNA与(1)中带有图案化DNA层的玻璃基底表面一起在室温下孵育20分钟，之后用PBS缓冲液洗涤两次以除去没有结合到表面的多余的AuNPs或Cy3-DNA，每次洗涤5分钟。

(3)重复上面(2)中的孵育和洗涤步骤以组装第三层。

光驱动DNA-POINT技术是基于DNA链上修饰的偶氮苯可以调控DNA杂交和去杂交，具体来讲，在300nm～400nm单光子或～750nm双光子(2P)光照射下，偶氮苯由平面反式结构转变为非平面顺式结构，从而导致DNA双螺旋解链。在平面反式结构中，插层平面偶氮苯通过堆积相互作用可以稳定DNA螺旋。相反，非平面顺式结构偶氮苯由于空间位阻使DNA螺旋不稳定，并有利于DNA双螺旋解链。基于此原理，本发明利用偶氮苯修饰的DNA设计了界面上的DNA光开关，如图1A所示，主要包括三根DNA链：偶氮苯-DNA链104(theazobenzene-modified-DNA)，锚定DNA链103(thebiotin-DNA)和引导组装DNA链(theassemblyguide-DNA)，下面对此DNA光开关进行具体的介绍。首先偶氮苯-DNA链104包含两个DNA片段，如图6A所示。第一个是由十个寡核苷酸组成的光敏片段，其中四个偶氮苯修饰的碱基作为结构转换域。这样的设计遵循先前的研究结果，通过两个偶氮苯修饰残基可以分离两个未修饰寡核苷酸的序列。第二个是一个天然DNA片段，该片段序列与基底上修饰锚定DNA链103互补，用于将偶氮苯-DNA链104锚定在基底上。如图1A所示，引导组装DNA链也包含两个DNA片段。一个与光敏片段互补，因而可用通过光敏片段的结构转换域控制引导组装DNA链与锚定在基底上的偶氮苯-DNA链104的杂交或解链，从而实现对引导组装DNA链的图案化。另一个DNA片段作为一个结合位点，通过与纳米材料表面修饰的互补DNA链杂交，引导纳米材料的组装，从而实现其的二次图案化。

本发明使用广泛用于生物医学传感和成像应用的透光玻璃盖玻片作为光刻表面作为示例。这里利用生物素-中性亲和素-生物素三明治组装策略制备DNA修饰的玻璃表面。将生物素-mPEG-硅烷(biotin-PEG-silane)、中性亲和素(neutravidin)和锚定DNA链103依次连接到玻璃基底上，这样被PEG分子钝化玻璃基底对其余分子和纳米级颗粒都呈现出超低的非特异性吸附，但锚定DNA却特异连接修饰在玻璃基底，在其上形成一层DNA层，如图7和图8所示。整个的修饰过程简单的如下所述，将玻璃表面在浓HNO

由于偶氮苯-DNA的光开关特性，本发明的设计策略可以广泛地与多光子扫描模式操作、带掩模的宽场以及数字镜设备(digital mirror devices，DMD)结合使用，以构建DNA修饰的表面复杂几何图案。以DNA-POINT技术的扫描模式作为特定实例，如图1B和图10所示，本发明首先在商用双光子显微镜(ZeissLSM510Meta)上通过扫描激光平版手写JHU图案10分钟。随后，DNA修饰的金纳米颗粒(AuNPs)在30分钟的孵育过程中自组装在DNA图案上作为二级图案。然后，利用40nmAuNPs的绿色比色散射，通过暗场显微镜对AuNPs投射的JHU图案进行成像。放大图像中显示的代表单个AuNP的单个绿点表示高图案分辨率。值得强调的是，本发明展示的扫描模式的DNA-POINT技术是一种无掩模光刻，包括基板制备、光扫描和二次图案化，都是在不使用洁净室和产生危险化学品的情况下完成的。

如图1～图14所示，下面对本发明的方案和效果进一步进行阐述。

1)关于表面上开关DNA的光调节：

溶液相中基于偶氮苯的DNA杂交的光驱动转换效率受DNA链、光照射时间和温度等几个因素的共同影响。然而，在界面上基于偶氮苯的DNA杂交的光调节效率仍没有被系统研究，同时DNA-POINT技术能否作为可行的表面微图案化方法，量化基于偶氮苯的DNA杂交光调节效率是评估其潜力的关键因素之一。因此，在溶液中成功实现DNA开关的光转换后，本发明首先研究了DNA-POINT在玻璃表面上的转换能力，其开关效率确定为85±2.8％，如图11所示。在光照期间，玻璃基底表面修饰的DNA光开关孵育在温度为37℃的PBS缓冲液中以确保高的光转换效率，同时避免温度过高造成DNA双螺旋解旋。如图2A所示，这里本发明用DNA修饰的AuNP作为探针来显示偶氮苯-DNA链104与引导组装DNA链杂交状态；DNA修饰的AuNP可以与界面上的引导组装DNA链杂交，从而被锚定在界面上，之后用暗场显微镜来观察其锚定的区域。实验结果展示，在没有紫外光照射的对照实验中，暗场显微镜下，界面上有高密度的AuNPs。这表明界面上组装了大量的引导组装DNA链。相比之下，在5W紫外光(365nm)照射10分钟后，界面上AuNPs的密度显著降低，这表面界面上组装的引导组装DNA链密度降低。通过使用界面上AuNPs的散射强度来对DNA开关效率进行定量分析，本发明计算出光照射后表面上仅保留20.4±8％的AuNP散射强度(n＝5次重复)。结果证实了表面上基于偶氮苯的DNA杂交光转换的高效性。此外，偶氮苯能够在可见光照射后从顺式结构转换回反式结构并恢复DNA杂交。因此，与基于光裂解的DNA图案化(导致DNA永久裂解)相比，偶氮苯修饰的DNA具有的重写能力是其一个独特特征。为了证明这一独特特征，本发明对DNA光开关修饰的界面进行了可见光-紫外线-可见光照射循环处理，然后在每次处理后将AuNPs与表面一起孵育。量化分析结果显示，两种可见光照射处理之间AuNPs的结合没有差异，如图12所示，从而证明了DNA-POINT的重写能力。

除了上面讲述的光驱动光刻之外，要充分发挥出基于偶氮苯的光电开关的全部潜力，本发明还解决的一个关键的问题，即除了实用相应的紫外光，能否使用近红外激光进行多光子扫描技术，如果成功，就实现亚微米分辨率的无掩模图案化。先前的研究证明了使用具有近红外波长的双光子激发实现了对偶氮苯进行光切换。然而，探索在表面上多光子激发驱动的偶氮苯修饰DNA杂交切换对于发展扫描模式至关重要。为了解决这个问题，本发明使用带有钛蓝宝石激光器(150fs、80MHz、相干变色龙)的商用共聚焦显微镜(LSM510，蔡司)进行DNA-POINT操作，如图2B所示。为了确定在40X水浸物镜(NA1.0)下高效DNA双螺旋切换的最佳激光功率，激光功率最初保持在最小0.2％(～4mW)，扫描面积为22.5μmx22.5μm。与0％激光功率控制下的高密度AuNPs相比，通过观察，分别在0.2％、0.5％、1％、2％和3％激光功率下，这些方形图案中AuNPs的密度显着降低。本发明还观察到随着激光功率增加超过4mW(高达60mW)，开关效率值没有显着变化，这暗示了与能量无关的开关过程。尽管基于多光子激光的飞秒非线性光刻已被用于在玻璃表面上制造结构，但所需的激光功率通常比本发明的DNA-POINT方法(4mW，80MHz重复率)使用的激光功率高几个数量级(1～100W，1kHz重复率)。

为了确定在60mW飞秒激光(150fs，80MHz)功率下PEG和天然DNA的完整性，本发明也进行对照实验。在水性介质中扫描生物素-PEG或天然DNA修饰表面，然后依次与生物识别DNA和AuNPs一起孵育。图像显示扫描区域和非扫描区域之间的AuNPs结合效率没有显着差异，如图13所示，这证实了生物素-PEG和天然DNA在激光扫描后在表面上保留了它们的生物识别活性。总之，这些结果表明，即使使用非常低功率的多光子激光器也可以实现最佳开关效率，这对于防止生物分子受到热损伤至关重要。

2)关于扫描模式下DNA-POINT的无掩模亚微米图案化技术：

由于本发明的DNA-POINT的扫描方式不需要掩膜，并且激光光斑的大小受衍射极限限制的，这意味着DNA-POINT的有效分辨率是数百纳米的数量级。因此，在共聚焦系统上进行的DNA-POINT扫描模式可以实现构建具有亚微米分辨率的特征图案。本发明用NA＝1.0的物镜对750nm双光子激光(150fs，80MHz，CoherentChameleon)进行聚焦，理论上应该可以实现～400nm的光学分辨率。利用AuNPs在玻璃表面上的图案化，本发明进一步确定DNA-POINT的打印能力，包括特征尺寸控制和制作任意图案的能力。如图3A所示，本发明设计了宽度分别为1μm、2μm和10μm的线条图案，随后通过暗场显微镜观察了附着有AuNP的微型图案。结果显示AuNPs分布在设计的线宽区域内。此外，利用最佳高斯曲线拟合来分析横截面的强度分布，揭示了高斯拟合的半峰全宽(FWHM)与设计线宽之间的密切对应关系。总的来说，这些结果证实了DNA-POINT的亚微米图案化能力。

此外，DNA-POINT的扫描模式能够实现用户任意设计的图案。为了展示扫描模式DNA-POINT实现任意图案的能力，利用上面相同的方式，本发明成功的利用AuNP分别生成对称和不对称图案，如图3B展示了线宽为4μm、间距为14μm的基于线的网络、面积为12.5μmx12.5μm和间距为5μm的方形阵列以及总体尺寸分别为200μmx200μm的手绘线圈图案。这些图案展示了DNA-POINT技术构建图案的复杂性，此外，还展示了在共焦扫描模式下，DNA-POINT技术对纳米级颗粒进行微尺度分辨率的图案化的能力。

3)关于DNA-POINT的多层自组装：

以微米级精度对多层功能材料进行图案化对于从分子系统合成到高通量/高含量筛选等众多应用都非常重要。例如，小型化生物分子嵌入等离子体纳米粒子阵列对于开发快速和高灵敏的诊断分析方法和生物传感器非常有价值。为了研究DNA-POINT技术构建不同材料第二层图案的能力，使用Cy3荧光团标记的DNA链(即小分子而不是如上所示的DNA修饰的AuNP)作为光驱动DNA原始图案上的第二层材料层。与AuNP图案类似，设计了一个手写的JHU图案，线条宽度约为10μm，整体尺寸为60μmx120μm，并通过聚焦激光进行扫描。然后，只有非光照区域可以与Cy3标记的DNA杂交，从而产生阴性模式。图4A显示了荧光显微镜成像的负JHU图案。

此外，通过共价键表面修饰了密集DNA的AuNPs，也可以作为自组装的模板。因此，本发明在DNA-POINT系统中发展了三层材料光刻技术，该系统由图案为间距5μm、面积为12.5μmx12.5μm正方形阵列的光驱动DNA的原始层、其上自组装的AuNPs层和以AuNPs层为模板组装的DNA层。按照前面使用的组装方法，将AuNPs与具有图案化的DNA原始层的表面一起孵育，之后再与Cy3修饰的DNA一起孵育进行第三层的组装。本发明通过暗场和荧光显微镜原位成像的方法来研究AuNPs和Cy3标记的DNA之间的共定位。如图4B所示，AuNPs的绿色散射和Cy3标记的DNA的伪红色荧光之间高度共定位，证明本发明实现了三层不同材料的自组装。这种模式也非常容易的用于生成生物活性表面，来研究有关生物分子相互作用的基本问题。

4)关于DNA-POINT用于调节细胞粘附和扩散：

粘着斑(Focaladhesions,FA)是在细胞基底表面生成的大型蛋白质复合物，它将细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)物理连接到细胞骨架，长期以来一直被推测其介导了细胞生长和迁移。已有研究表明，在与如RGD序列等的特定粘附性ECM表位结合后，细胞内几种锚蛋白被招募到粘附位点，最终诱导FA复合物和相关细胞骨架的组装。在这里，通过表征粘合剂RGD簇之间间距的纳米级变化对细胞扩散和粘着斑动力学的影响，本发明研究了整合素横向聚类作为控制整合素功能的机制。

为了评估在PEG修饰的DNA表面上的细胞粘附和扩散，DNA表面附着有高密度的40nmAuNPs，如图5A所示，RGD修饰的DNA(简称RGD-DNA)用作AuNPs的第二层如图5B所示。最初，本发明试图将HeLa细胞接种在仅修饰有高密度的AuNPs的DNA表面(AuNPs表面上没有RGD-DNA)。通过孵育6小时后，如预期的那样，本发明发现HeLa细胞仍然是圆形，并没有附着在基底表面，这表明PEG修饰的DNA表面不支持细胞粘附和扩散，如图5A所示。之后，当添加序列与40nmAuNPs表面DNA序列互补的RGD-DNA后，通过杂交形成40nmRGD簇。如图5B所示，HeLa细胞在修饰有RGD簇的表面孵育6小时后，细胞很好的粘附和扩散，证明了高密度的RGD簇可以支持细胞粘附和扩散。

本发明已经表明，在紫外光照射10分钟之后，DNA表面上的AuNPs的密度显着降低。因此，除了利用光调控RGD簇的d密度外，DNA-POINT的擦除过程可以降低RGD簇密度从而控制细胞的扩散行为如图5C所示。结果显示，接种在高密度RGD簇上的细胞在孵育6小时后可以完全扩散如图5D所示，然后在紫外灯光照10分钟后，细胞的大小和形状急剧变化为小而圆。细胞尺寸分析，如图5F和图14所示，进一步证明了在光照后细胞尺寸显着减小。这些结果表明DNA-POINT方法是一种动态调节细胞粘附和扩散的有效方法。

如上所述，本发明的基于光敏DNA的图形模版及图形制备方法，具有以下有益效果：

本发明通过采用波长较大的双光子光照实现偶氮苯-DNA链104与引导组装DNA链105解链，双光子光照可通过较大波长的光照满足偶氮苯-DNA链104与引导组装DNA链105解链，即使用非常低功率的双光子激光器便可以实现最佳的DNA链光开关调控效率，从而有效避免了使用波长较短的紫外光对DNA链或生物分子活性造成失活的影响，防止了生物分子受到的热损伤，大大提高了本发明的应用范围。

本发明通过光照使偶氮苯-DNA链104从平面反式结构转变为非平面顺式结构，实现与引导组装DNA链105解链，之后可通过可见光照射可使偶氮苯-DNA链104从非平面顺式结构转变为平面反式结构，并恢复与所述引导组装DNA链105的杂交，使得所述偶氮苯-DNA链104具有的重写能力。

本发明可通过双光子扫描模式形成所需图形，为多功能、无掩模、无需洁净室和环保的光刻方法提供了一种可行性方案。

所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。