一种区分血液样本来源的方法及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种区分血液样本来源的方法，具体涉及一种使用Y染色体短串联重复序列区分血液制品样本来源的方法及其应用。

背景技术

自2015年7月原国家食品药品监督管理总局发布《关于开展药物临床试验数据自查核查工作的公告(2015年第117号)》以后，药物临床试验数据完整性问题越来越受到重视，临床试验质量的控制措施进一步被细化

I期临床试验是药物有效性和安全性评价的重要环节，从受试者采集的生物样本是后续检测分析的基础，因生物样本是有限而宝贵的样本资源，所以对生物样本进行有效管理是临床试验质量控制的重要环节

研究报道，Y染色体短串联重复序列(Y-chromosomal short tandem repeat,Y-STR)是位于男性Y染色体上的人类多态性短串联重复序列(short tandem repeats,STR)位点。一般情况下，只有男性个体才有Y染色体，因此，Y-STR具有男性遗传，男性特异性的特点，Y-STR可作为性别鉴定的依据，在标准常染色体DNA谱分析不能提供信息的情况下常被用于法医DNA分析

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种区分血液样本来源的方法及其应用。

与本发明相关的参考文献有：

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发明内容

本发明的目的是基于现有技术的现状，为了避免I期临床试验项目中因混淆生物样本而导致的生物样本数据缺失、保证临床试验数据的完整性，提供一种区分血液样本来源的方法，具体涉及一种使用Y染色体短串联重复序列区分血液制品样本来源的方法及其应用。本发明首次将Y-STR(Y-chromosomal short tandem repeat,Y-STR)检测方法运用于I期临床试验中，目的在于运用该方法在鉴别混淆的来自2个不同性别个体的生物样本。

具体的，

本发明提供了一种区分血液样本来源的方法，该方法使用Y染色体短串联重复序列区分血液制品样本来源，其包括步骤：

从待测血液样本中提取待测样本的DNA；

以已知男性和已知女性血细胞样本中抽提DNA，分别作为阳性和阴性对照；

体外扩增待测样本、阳性对照和阴性对照的DNA样本的三个Y-STR基因座片段DYS460、DYS513和DYS570；

检测扩增产物的含量。

较好的，该方法还包括将待测样本的扩增产物与阳性对照和阴性对照比对，从而确定待测样本源的来源。

较好的，所述的根据扩增产物判断血液样本来源是指区分血液样本源自男性还是源自女性。

较好的，所述的根据扩增产物判断血液样本来源是指，扩增出大小正确的三个Y-STR基因座DNA片段的样本源自男性，三个Y-STR基因座DNA片段均不能扩增的样本源自女性。

较好的，分别从待测血液样本的血浆和/或血细胞样本中抽提DNA。例如，将缺失标签的两支血液样本重新编号为A和B，分别从其血浆和血细胞样本中抽提DNA，同时从已知男性(P)和已知女性(N)血细胞样本中抽提DNA，分别作为阳性和阴性对照。随后利用PCR技术体外扩增三个Y-STR基因座片段(DYS460、DYS513和DYS570)，最后利用2％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。

本发明中，扩增DYS460、DYS513和DYS570的引物序列如表1所示。

表1DYS460、DYS513和DYS570的引物序列表

更好的，DYS460、DYS513和DYS570的扩增产物大小分别为：124bp、149-169bp、242-279bp。

另一方面，本发明提供了所述方法的应用，所述方法在制备用于区别血液样本的来源或者作为生物样本检测指控的步骤的制品中的用途。

本发明中，所述方法用作区别血液样本的来源或者作为生物样本检测指控的一个步骤。

在实践中，可以使用该方法对生物样本标识缺失或者有疑问的血液样本进行检测，并帮助确定血液样本的来源。例如在，I期临床试验项目中确定血液样本源自男性还是女性。

电泳条带显示，从P、N、A和B的血细胞样本中成功抽提到DNA。与对照相比，A的血细胞样本均扩增出大小正确的三个Y-STR基因座DNA片段，而B的血细胞样本均不能扩增出DNA片段。Y-STR基因座检测方法成功鉴定出男性受试者的样本为A，女性受试者的样本为B。可见，Y-STR基因座检测方法可以鉴别混淆的2个不同性别个体的生物样本。本发明的方法操作简便，快捷有效，成本低廉，适于在临床检测以及药理实验中推广，不仅可以作为区分样本来源的性别差异，而且可以作为生物样本存储、检测、运输等过程中的质检步骤。

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

附图说明

图1是血细胞和血浆的DNA电泳结果，

其中显示，Lane M为D15000 DNA标记；Lane 1为从P的血细胞样本中提取的DNA；Lane 2为从N的血细胞样本中提取的DNA；Lane 3和Lane 4分别为从A和B的血细胞样本中提取的DNA；Lane 5和Lane 6分别为从A和B的血浆样本中提取的DNA。

图2是体外扩增DYS460、DYS513和DYS570基因座的电泳结果，

其中显示，Lane M为Trans2K Plus DNA标记；Lane 1、7、13为以样品P的血细胞DNA为模板，分别以DYS470、DYS513、DYS570为引物的扩增结果；Lane2、8、14为以样品N的血细胞DNA为模板，以DYS470、DYS513、DYS570为引物的扩增结果，第3、9、15道分别是以样品A的血细胞DNA为模板，DYS470、DYS513、DYS570为引物的扩增结果；第4、10、16道分别是以样品B的血细胞DNA为模板，DYS470、DYS513、DYS570为引物的扩增结果；第5、11道，17是以样品A的血浆DNA为模板，分别以DYS470、DYS513、DYS570为引物的扩增结果；6、12、18是以样品B的血浆DNA为模板，分别以DYS470、DYS513、DYS570为引物的扩增结果。

具体实施方式

基于I期临床试验常涉及密集采血，血液采集数量多、时间短、要求高，涉及环节也比较多，加之操作人员的熟练程度、受试者的静脉条件、采血管压力等原因，会出现临床样本标识不清、标签脱落等情况，导致无法辨别样本来自何个体。

本发明通过以血细胞DNA为模板，选取Y染色体的3个基因座(DYS460、DYS513和DYS570)，成功鉴别出2个不同性别受试者的血液样本。针对不同性别受试者的血液样本混淆的情况，本方法可作为生物样本质量控制中的一种应急措施，建议将其纳入生物样本质量控制的标准操作程序中。然而，本发明探讨的案例限于两位异性受试者样本的鉴别，至于多位男性受试者的样本的鉴别方法，因Y-STR的基因多样性和单倍型多样性

下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，均属于本申请保护的范围。

实施例1

材料和方法：

样本来源：某生物等效性试验空腹试验部分第一周期第13个采血点因标签标识不清而无法辨别的10号和22号受试者全血样本(6mL EDTA抗凝采血管)2管，实验时分别编号为：A和B。已知男性全血样本1管，作为阳性对照，编号为P。已知女性全血样本1管，作为阴性对照，编号为N。

仪器与试剂：

血基因组DNA小量试剂盒和D15000 Marker(美国Axygen公司)，Trans2K Plus DNAMarker(北京全式金生物技术有限公司)，琼脂糖和6×Loading Buffer(美国Genview公司)，2×PCR buffer Mix、Ex Taq HS和ddH

DNA抽提：将P、N、A和B四支采血管放于低温离心机中，4℃、1200g离心10min，分别分离血浆和血细胞沉淀，留作备用，离心操作在采血后2小时内完成。按照血基因组DNA小量试剂盒说明书分别提取200μL血浆和200μL血细胞沉淀中的DNA。

基因座选择和引物设计：根据Y-STR基因座DYS460

PCR扩增基因片段：将引物稀释成浓度10mol/L，每对正反引物取各10μL混合，形成PCR引物混合液。DNA模板分别吸取A和B的血浆和血细胞样本中提取的DNA。制备25μL的PCR反应液为：12.5μL 2×PCR buffer Mix、2μL Ex Taq HS、6μLddH

表2DYS460、DYS513和DYS570的正反引物序列和产物片段大小

表3体外扩增Y-STR基因座片段(DYS460、DYS 513和DYS 570)的反应条件

DNA检测：各取5μL DNA模板，加入1μL 6×Loading Buffer混匀。制备1％琼脂糖凝胶，将混合液加入凝胶孔中，D15000 Marker作为参照，于120V电压下电泳15min。电泳结束后，于紫外凝胶成像仪中拍照观察。

PCR产物检测：各取5μL PCR产物模板，加入1μL 6×Loading Buffer混匀。制备2％琼脂糖凝胶，将混合液加入凝胶孔中，Trans2K Plus DNA Marker作为参照，于120V电压下电泳20min。电泳结束后，于紫外凝胶成像仪中拍照观察。

P、N、A和B的血细胞中均抽提到DNA P和N样本的血细胞DNA、A和B样本的血浆和血细胞DNA分别用1％琼脂糖凝胶电泳分离，结果如图1所示，A和B血浆DNA样本均无主条带，而P、N、A和B血细胞样本有清晰的DNA主条带，表明A和B的血浆中DNA含量可能非常少而无法用琼脂糖凝胶电泳分离出，而P、N、A和B的血细胞中均成功抽提到了DNA。

实施例2

A样本的血细胞DNA均扩增出3个Y-STR基因座P和N样本的血细胞DNA、A和B样本的血浆和血细胞DNA均分别用3个Y-STR基因座(DYS460、DYS513和DYS570)的引物进行扩增，产物用2％琼脂糖凝胶电泳分离，结果如图2所示，作为阴性对照的N样本血细胞DNA以及B样本的血细胞DNA和血浆DNA都无法扩增出Y-STR基因座条带，而作为阳性对照的P样本血细胞DNA以及A的血细胞DNA样本中均扩增出3个Y-STR基因座，且产物条带大小与理论值(见表1)相符，说明A样本为20号男性受试者的样本，B样本为10号女性受试者的样本。因A样本的血浆几乎不含Y染色体DNA，因此也无法扩增出产物。

以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本申请公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。