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一种载神经生长因子的可降解镁神经导管及其制备方法

文献发布时间:2023-06-19 18:37:28


一种载神经生长因子的可降解镁神经导管及其制备方法

技术领域

本发明属于医学器材技术领域,具体涉及一种载神经生长因子的可降解神经导管及其制备方法,尤指一种可缓释神经生长因子、以羟基磷灰石/石墨烯复合涂层包覆镁为主体支架的神经导管及其制备方法。

背景技术

周围神经缺损是一种严重的周围神经损伤类型,常发生于四肢骨折与创伤中。据报道,在全球每年新增四肢外伤的患者里,周围神经损伤病人约占1.5%-4.0%。而在我国,周围神经损伤每年新增大约60-90万例,其中约30-45万患者需要接受手术治疗。根据缺损距离的大小可以选择不同的治疗方式。对于短距离的缺损,在无感染的情况下,可进行端端无张力吻合。而对于长距离的缺损,自体或异体神经移植则是临床上最常用的治疗方法,然而,此种手术方式存在移植物来源不足、供区神经功能丧失、神经瘤形成以及免疫排除等诸多弊端。因此,开发神经导管替代自(异)体神经移植物,用于周围神经缺损的治疗具有重要的临床意义。

现有神经修复导管的材料包括镁丝及多孔镁合金、多孔不锈钢、硅胶管、水凝胶、聚乙烯、聚丙烯酸、聚乳酸、胶原等。专利CN103598927A公开了一种可降解多孔镁合金神经导管,以及CN204106255U公开了一种镁丝材编织而成的可弯曲全降解镁合金神经导管,表明了镁及镁合金应用于神经修复的可行性,然而上述两项发明具有以下缺点:(1)镁及镁合金在生理环境下会发生快速腐蚀,产生大量的气泡,容易造成局部高碱性微环境,不利于细胞生长;(2)多孔的镁导管无法完全保证神经修复过程中的径向生长,体内的蠕动和镁管的降解均会导致神经同周围组织粘结,使得神经生长受阻;(3)表面光滑的神经导管往往不利于神经细胞的粘附和迁移。此外,专利CN114129770A公开了一种载生物活性因子的PLA(聚乳酸(PLA)是一种新型的生物基及可再生生物降解材料,使用可再生的植物资源(如玉米、木薯等)所提出的淀粉原料制成)神经导管及其制备方法,采用静电喷雾法在PLA管内部填充载生物活性因子的复合凝胶,该发明虽然能够通过药物释放为神经修复提供稳定的生物环境,但依然存在术后易变形、管壁易塌陷、导电性差等弊端,严重影响神经的生长和修复,甚至导致手术失败。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此,本发明的主要目的在于提供一种载神经生长因子的可降解镁神经导管,旨在解决现有神经导管术后易变形、管壁易塌陷、导电性弱、无法提供神经生长所需要的微量元素及生长因子等弊端,从而不能提供稳定的神经生长微环境,严重影响神经的生长和修复,甚至导致手术失败等的问题。本发明还提供了该载神经生长因子的可降解镁神经导管的制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的:

第一方面,一种载神经生长因子的可降解镁神经导管,其包括镁管,所述镁管的内外表面均设置有复合涂层,所述复合涂层的外表面设置有载神经生长因子的PLGA纳米微球。

在某些具体实施例中,所述镁管为纯度等于/大于99.99%的高纯镁。

在某些具体实施例中,所述镁管为合金元素总含量低于/等于10%的镁合金,所述合金元素为钙、锌、锰、铁、锡、铜中的一种或任意两种以上的混合物。

在某些具体实施例中,所述镁管为镁圆管,所述镁圆管的内径为1-3mm、壁厚为0.3-0.5mm,在镁圆管的两端对称设置有多个通孔。

在某些具体实施例中,所述复合涂层的表面粗糙度为0.2-5μm。

在某些具体实施例中,所述复合涂层为纳米尺寸的羟基磷灰石/石墨烯复合材料,其厚度为1-20μm。

在某些具体实施例中,所述载神经生长因子的PLGA纳米微球的直径为200-600nm。

第二方面,一种前述载神经生长因子的可降解镁神经导管的制备方法,包括如下步骤:

S1,镁管的制备;

S2,将镁管置于乙二胺四乙酸二钠钙、磷酸二氢钾、石墨烯的混合溶液中进行液相沉积,得到包覆有羟基磷灰石/石墨烯复合涂层的镁管;

S3,用神经生长因子,溶于BSA溶液中配制内水相;将PLGA、丙酮和二氯甲烷配制油相,混合内水相和油相,超声乳化得油包水型初乳,然后将PVA溶液加入初乳中,超声乳化形成复乳;

S4,将复乳缓慢加入到PVA中,室温下磁力搅拌,挥发溶剂,离心收集载神经生长因子的PLGA纳米微球,灭菌、冷冻干燥,备用;

S5,采用静电喷雾法将载神经生长因子的PLGA纳米微球喷到包覆有羟基磷灰石/石墨烯复合涂层的镁管表面。

进一步,S2步骤所述混合溶液中的乙二胺四乙酸二钠钙和磷酸二氢钾浓度均为0.05~0.30mol/L,石墨烯浓度为10~20g/L。

进一步,S3步骤所述PLGA的浓度是1.5~2.5g/L,神经生长因子与PLGA的质量比为0.01~0.1%,丙酮与二氯甲烷的体积比为1:3。

与现有技术相比,本发明至少具有以下优点:

1)本发明所提供的载神经生长因子的可降解镁神经导管,具有良好的耐腐蚀性、导电性、力学性能和径向引导功能,具体为,其在37℃下的PBS溶液中的腐蚀电流密度为1.0×10

2)本发明所提供的镁神经导管,通过采用纯镁或镁合金作为神经导管的主体材料,既可以提供良好的径向引导和机械支撑作用,防止管内再狭窄等情况出现,同时材料在降解过程中又可以释放神经生长所需的镁、钙等微量元素,促进神经修复;且通过在镁神经导管的两端对称设置多个圆孔增加了固定神经导管的位点,防止其体内发生移动,有效保证神经修复过程中的径向生长;此外镁管的相对密闭空间,可以防止神经再生过程中与周围组织发生黏连,使得神经生长受阻;

3)本发明所提供神经导管,通过在其外表面设置羟基磷灰石/石墨烯的复合涂层,调控神经导管的降解速率为0.05~0.80mm/y,使其能够在最佳周期内完全降解,可以较好的实现神经修复生长与材料降解同步;同时通过控制镁离子的释放缓解继发损伤即氧化应激诱导的雪旺细胞凋亡,从而发挥保护神经元的作用;另一方面,该复合涂层中的石墨烯能够有效改善神经导管的导电性,使其电导率处在1.0×10

4)本发明所提供神经导管,在复合涂层的外表面设置载神经生长因子的PLGA纳米微球,可以作为神经修复生长微环境的营养层,载神经生长因子的PLGA纳米微球可以持续性释放神经生长因子,为神经元细胞的生长提供营养支持,促进神经元细胞的增殖和轴突的生长,从而修复神经缺损。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明所提供的可降解镁神经导管的剖面结构示意图;

图2为本发明所提供的可降解镁神经导管的产品示意图;

图3为本发明所提供的可降解镁神经导管的使用状态示意图;

图4本发明所述可降解镁神经导管中羟基磷灰石/石墨烯复合涂层的电镜扫描图;

图5为本发明所述可降解镁神经导管中载神经生长因子的PLGA纳米微球的电镜扫描图;

图6为本发明实施例1中可降解镁神经导管在对雪旺细胞的增殖与生长的影响;

图7为本发明实施例1中可降解镁神经导管对巨噬细胞极化过程的影响;

图8为本发明实施例1中可降解镁神经导管在大鼠体内中的降解情况。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详述,以下实施例只是描述性的,不是限定性的,不能以此限定本发明的保护范围。

当以范围、优选范围、或者优选的数值上限以及下限的形式表述某个量、浓度或其它值或参数的时候,应当理解相当于具体揭示了通过将任意一对范围上限或优选数值与任意范围下限或优选数值结合起来的任何范围,而不考虑该范围是否具体揭示。除非另外指出,本文所列出的数值范围值在包括范围的端点,和该范围之内的所有整数和分数。

除非另外说明,本文中所有的百分比、份数、比值等均是按重量计。

本文的材料、方法和实施例均是示例性的,并且除非特别说明,不应理解为限制性的。

本申请中的神经生长因子为NGF神经生长因子。

本发明所提供的一种载神经生长因子的可降解镁神经导管,如图1所示,其包括镁管1,镁管1的内外表面均设置有复合涂层2,复合涂层2的外表面设置有载神经生长因子的PLGA纳米微球3;其中图2和图3为本申请载神经生长因子的可降解镁神经导管的产品图和使用状态图。

其中镁管为纯度不低于99.99%的高纯镁。

其中镁管为合金元素总含量不高于10%的镁合金,所述合金元素为钙、锌、锰、铁、锡、铜中的一种或任意两种以上的混合物。

其中镁管为镁圆管,该镁圆管的内径为1-3mm、壁厚为0.3-0.5mm,在镁圆管的两端对称设置有多个通孔4。

其中复合涂层的表面粗糙度为0.2-5μm,本申请将复合涂层的表面粗糙度设置成0.2-5μm,能够满足细胞粘附、生长的基本要求。

其中复合涂层为纳米尺寸的羟基磷灰石/石墨烯复合材料,其厚度为1-20μm,进一步优选为5-15μm,进一步优选为10μm。

在某些具体实施例中,所述载神经生长因子的PLGA纳米微球的直径为200-600nm。

实施例1:神经导管(纯镁)的制备

本实施案例展示一种载神经生长因子的可降解镁神经导管的制备方法,该神经导管由镁圆管、羟基磷灰石/石墨烯复合涂层、载神经生长因子的PLGA纳米微球三部分组成,其制备工艺流程如下:

S1,纯镁锭(纯度不低于99.99%(重量百分数))在320℃的挤压温度下形成直径6mm的纯镁棒,纯镁棒通过机械加工、热处理等方式制备成内径1.5mm、壁厚0.5mm的镁圆管,距镁圆管两端0.5mm处分别钻2个直径0.8mm的通孔,且这些通孔均匀分布于同一横截面圆周;

S2,用浓度均为0.2mol/L的Ca-EDTA(乙二胺四乙酸二钠钙)、KH

S3,称量0.225mg的神经生长因子,溶于0.1%BSA中,作为内水相(W1);称量22.5mgPLGA于15ml离心管中,加入体积比为1:3的丙酮和二氯甲烷组成的有机溶剂中,作为油相(O);

S4,将内水相(W1)加入油相(O),冰上进行超声乳化,形成油包水型(W1/O)初乳,将1mL 1%PVA溶液加入初乳中,超声乳化形成复乳(W1/O/W2),将复乳缓慢加入到25ml的0.3%PVA中,室温下磁力搅拌(800rpm)搅拌4h,挥发有机溶剂;

S5,4℃条件下,5000rpm离心10min收集沉淀,随后用10mL灭菌水重悬载神经生长因子的PLGA纳米微球沉淀,重复洗涤离心2次,弃去液体,最后将收集到的粒径为200-600nm的载神经生长因子的PLGA纳米微球,灭菌、冷冻干燥48h,储存于-20℃冰箱备用;

S6,采用静电喷雾法将载神经生长因子的PLGA纳米微球喷到包覆有羟基磷灰石/石墨烯复合涂层的镁圆管表面,即得载神经生长因子的可降解镁神经导管。

实施例2:神经导管(镁合金)的制备

本实施案例展示一种载神经生长因子的可降解镁神经导管的制备方法,该神经导管由镁圆管、羟基磷灰石/石墨烯复合涂层、载神经生长因子的PLGA纳米微球三部分组成,其制备工艺流程如下:

S1,镁合金锭(Mg-Zn-Ca,其中锌和钙元素的总含量为8%(重量百分数))在320℃的挤压温度下形成直径6mm的镁合金棒材,镁合金棒材通过机械加工、热处理等方式制备内径1mm、壁厚0.3mm的镁合金圆管,距镁合金圆管两端0.5mm处分别钻2个直径0.8mm的通孔,且这些通孔均匀分布于同一横截面圆周;

S2,用浓度均为0.2mol/L的Ca-EDTA(乙二胺四乙酸二钠钙)、KH

S3,称量0.225mg的神经生长因子,溶于0.1%BSA中,作为内水相(W1);称量22.5mgPLGA于15ml离心管中,加入体积比为1:3的丙酮和二氯甲烷组成的有机溶剂中,作为油相(O);

S4,将内水相(W1)加入油相(O),冰上进行超声乳化,形成油包水型(W1/O)初乳,将1mL 1%PVA溶液加入初乳中,超声乳化形成复乳(W1/O/W2),将复乳缓慢加入到25ml的0.3%PVA中,室温下磁力搅拌(800rpm)搅拌4h,挥发有机溶剂;

S5,4℃条件下,5000rpm离心10min收集沉淀,随后用10mL灭菌水重悬载神经生长因子的PLGA纳米微球沉淀,重复洗涤离心2次,弃去液体,最后将收集到的粒径为200-600nm的载神经生长因子的PLGA纳米微球,灭菌、冷冻干燥48h,储存于-20℃冰箱备用;

S6,采用静电喷雾法将载神经生长因子的PLGA纳米微球喷到包覆有羟基磷灰石/石墨烯复合涂层的镁圆管表面,即得载神经生长因子的可降解镁神经导管。

实施例3-实施例5

本实施3-5展示一种载神经生长因子的可降解镁神经导管的制备方法,其制备方法同实施例1,区别仅在于步骤S1中镁圆管的内径发生改变,依次为1mm、2mm和3mm。

实施例6-实施例9

本实施例6-9展示一种载神经生长因子的可降解镁神经导管的制备方法,其制备工艺流程同实施例1,区别仅在于步骤S2中混合溶液的浓度发生变化。其中Ca-EDTA、KH

实施例10-实施例11

本实施例10-11展示一种载神经生长因子的可降解镁神经导管的制备方法,其制备工艺流程同实施例1,区别仅在于步骤S3中PLGA的浓度发生变化,分别为2mg/mL、2.5mg/mL。

实施例12-实施例15

本实施案例展示一种载神经生长因子的可降解镁神经导管的制备方法,其制备工艺流程同实施例2,区别仅在于步骤S2中混合溶液的浓度发生变化。其中Ca-EDTA、KH

实施例16-实施例17

本实施案例展示一种载神经生长因子的可降解镁神经导管的制备方法,其制备工艺流程同实施例2,区别仅在于步骤S3中PLGA的浓度发生改变,分别为2mg/mL、2.5mg/mL。

实施例18:神经导管的性能测试

1)神经导管的形貌特征;

本测试以实施例1制备所得的载神经生长因子的可降解镁神经导管为例,采用环境扫描电子显微镜对步骤S2得到的包覆有羟基磷灰石/石墨烯复合涂层的镁圆管进行电镜扫描,结果如图4所示,从图4中可以看出复合涂层表面具有较高的致密性,致密的羟基磷灰石/石墨烯复合涂层能够起到防腐蚀的功能;以及对步骤S5得到的载神经生长因子的PLGA纳米微球进行电镜扫描,结果如图5所示,从图5中可以看出具有一定尺寸范围的纳米微球成功涂覆到包覆有羟基磷灰石/石墨烯复合涂层的镁圆管表面。

2)神经导管的耐腐蚀电流密度、腐蚀电位、腐蚀速率、电导率和拉伸强度的测试结果;本测试以实施例1、实施例7、实施例12和实施例15制备所得的载神经生长因子的可降解镁神经导管为例,参照ASTMF3268-18a标准,利用电化学测试方法测量神经导管在37℃下的PBS标准溶液中的腐蚀电流密度、腐蚀电位和腐蚀速率;此外,运用电导率测量仪和万能拉伸强度试验机(参照标准GB/T 228.1-2021)分别测试神经导管的电导率和拉伸强度。测试结果如下表所示:

从上表可知,该神经导管具有较高的耐腐蚀性能、优异的信号传输功能,以及适宜的力学性能,能够较好地满足神经修复过程中所需的微环境和支撑力。

3)神经导管对雪旺细胞的影响

本测试以实施例1制备所得的载神经生长因子的可降解镁神经导管为例,采用荧光显微镜通过Live/Dead方法对神经导管在雪旺细胞中的生物相容性进行检测,具体为神经导管浸提液与雪旺细胞直接培养1天、3天、5天和7天后表现出来的细胞毒性。其中,图6B、6E、6F、6G和6H中显示的是活细胞,图6C中显示的是细胞核,图6D中显示的是Merge图,从图6中可以看出,该神经导管对雪旺细胞具有较好的生物相容性。随着培养时间的增加,雪旺细胞的活细胞数量逐渐增加,表明该神经导管能够促进雪旺细胞的增殖。

4)不同镁离子浓度对巨噬细胞极化过程的影响

本测试以实施例1中的高纯镁材料为例,制备了不同镁离子浓度的浸提液,采用流式细胞仪通过检测巨噬细胞M1/M2极化的标志物来检测不同镁离子浓度对巨噬细胞极化过程的影响。如图7所示,CD86、CD80均代表巨噬细胞M1极化的标志物,CD206代表巨噬细胞M2极化的标记物,Control为空白对照组,LPS和IL-4为阳性对照组,Low dose代表低镁离子浓度组(20~25mg/L),Moderate dose代表中度镁离子浓度组(25~30mg/L),High dose代表高镁离子浓度组(30mg/L以上)。从图中可以看出,相比于空白对照组,不同镁离子浓度下测得的CD86值和CD80值显著增加,数值与阳性对照组相接近,表明不同镁离子浓度的释放可以抑制巨噬细胞M1极化;另外,相比于阳性对照组,不同镁离子浓度下测得的CD206值表现出显著的差异,表明不同镁离子浓度的释放可以促进巨噬细胞M2极化。总的来看,不同程度的镁离子释放可以抑制炎症,同时可促进神经组织的修复。

5)载神经生长因子PLGA在体内的降解情况

本测试以实施例1制备所得的载神经生长因子的可降解镁神经导管为例,采用小动物活体成像系统通过检测DiR-PLGA体内荧光的衰减过程判断载神经生长因子PLGA的体内降解过程,结果如图8所示,从图8中可以看出载神经生长因子PLGA在体内的降解周期大致为12周左右,它可以为周围神经的生长持续提供营养支持。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围,其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

技术分类

06120115638034