一种基于高密度荧光标记法的细胞微管膨胀显微成像方法
文献发布时间:2023-06-19 11:11:32
技术领域
本发明涉及免疫荧光与超分辨显微成像领域,特别涉及一种基于高密度荧光标记法的细胞微管膨胀显微成像方法。
背景技术
膨胀显微镜是一种较新的超分辨率成像方法,它使用可膨胀水凝胶各向同性地增加生物样品(如细胞培养物或组织切片)中荧光团之间的物理距离,从而提高生物样品的放大倍数。2015年Chen等首次发表一种应用可膨胀聚合物扩大细胞和脑组织的方法,并将其称为“膨胀显微技术”(Expansion Microscopy,ExM),此方法使细胞和小鼠脑组织在光学显微镜下达到了70nm的分辨率,这使得普通的光学显微镜就能够实现纳米级成像。膨胀显微技术将生物样本溶解在亲水性单体中,经过自由基引发聚合制备成交联的电解质水凝胶,水凝胶吸水溶胀2-3个数量级,通过物理放大生物体本身来提高最终图像的分辨率。但在样品被放大的同时,荧光团之间的距离被增大,导致膨胀样本标记稀疏,尤其是在超分辨显微镜中成像时,成像效果不理想,可能导致样品结构荧光图像的不连续。
为了提升荧光标记的密度,本发明公开了一种基于高密度荧光标记法的细胞微管膨胀显微成像技术,通过使用高标记密度的荧光标记方法,极大改善了微管膨胀显微技术的成像质量。
发明内容
发明目的:本发明为了改善传统膨胀显微技术的成像质量,提供了一种高标记密度的荧光标记方法,将其应用于细胞微管膨胀显微技术中。
技术方案:为实现上述目的,本发明提供一种基于高密度荧光标记法的细胞微管膨胀显微成像方法,其包括如下步骤:(1)制备高密度微管荧光标记的细胞样品;(2)锚定:使用6-丙烯氨基乙酸琥珀酸酯对所述高密度微管荧光标记的细胞样品中蛋白质进行锚定;(3)凝胶化:将步骤(2)中获得的锚定后的生物细胞置于冰面上,快速混合384μL凝胶单体溶液与8μL加速剂,再迅速混合8μL的引发剂并摇匀,快速加入到生物细胞的玻底皿中,再放入细胞培养箱中孵育1h形成凝胶;(4)消化:将步骤(3)所得凝胶加入4.5mL消化缓冲液,锡纸封装后置于摇床上过夜反应;(5)膨胀:将步骤(4)获得消化后的凝胶加入去离子水置于摇床上透析,每隔1h换一次去离子水,重复3-5次,直至膨胀至样本体积不再变化;(6)成像:在吸水膨胀后的凝胶样品加入成像缓冲液后,置于超分辨显微镜下成像,得到基于高密度标记法的细胞微管膨胀显微图像。
优选的,步骤(1)中所述制备高密度微管荧光标记的细胞样品,其包括如下步骤,使用PBS缓冲液清洗细胞,使用0.01%的Triton X-100溶液对细胞进行透膜处理,反应时间为12-13分钟;使用PBS缓冲液清洗细胞,加入固定液对细胞进行固定,静置20分钟;将细胞置于摇床上,使用PBS缓冲液清洗3次,每次5分钟;使用1mg/mL的NaBH
优选的,所述的凝胶单体溶液为0.38g/mL丙烯酸钠溶液、0.5g/mL丙烯酰胺溶液、0.02g/mLN,N-二甲基丙烯酰胺溶液、0.292g/mL氯化钠溶液、0.1mol/LPBS、去离子水按照体积比45:10:15:80:20:18配制而成。
优选的,所述成像缓冲液为10μL/mL巯基乙醇、50μg/mL葡萄糖氧化酶、50μg/mL过氧化氢酶、100mg/mL葡萄糖按照体积比45:10:15:80:20:18配制成,共计2mL。
优选的,所述的消化缓冲液为0.05mol/L Tris溶液、0.001mol/L EDTA溶液、0.5%Triton X-100、0.8mol/L guanidine HCl溶液按照体积比45:10:15:80:20:18混合得到初混液,取4.5mL初混液加入占所述初混液体积比1:1500的K蛋白酶混合而成。
优选的,所述的加速剂为质量比为10%的TEMED溶液;所述的引发剂为质量比为10%的APS溶液。
优选的,步骤(6)中,所述成像采用的激发光波长为488nm,收集495-575nm之间的荧光信号进行超分辨成像。
优选的,所述成像,其时间为60分钟以内。
有益效果:
本发明通过一种先对细胞进行透膜处理,后对细胞进行固定、标记荧光的方法,大大提高了微管的荧光标记密度,解决了样品结构荧光图像的不连续的问题,改善了微管膨胀显微技术的成像质量。
附图说明
图1为经过高密度标记的Hela细胞微管在100倍物镜下的荧光图像(标记荧光染料为Alexa Flour 488,激光激发波长为488nm),标尺为1微米;
图2为经过高密度标记的Hela细胞又经过凝胶膨胀后在100倍物镜下的成像(标记荧光染料为Alexa Flour 488,激光激发波长为488nm),标尺为1微米;
图3为本发明所述基于高密度荧光标记法的细胞微管膨胀显微成像方法的原理图。
图4为按照常规标记法标记Hela细胞,经过膨胀后的成像,图(a)沿红线部分的强度如图(b)所示。该图可以反映标记密度,可以看到标记不连续。
图5为按照高密度荧光标记法标记Hela细胞,经过膨胀后的成像,图(a)沿红线部分的强度如图(b)所示,该图可以反映标记密度,可以看到标记连续,相较于常规标记法标记密度得到了极大提高。
具体实施方式
本发明涉及的关键因素为使用Triton X-100透膜时的浓度及透膜的反应时间,需要十分严格,多一点或少一点将严重影响实验效果。透膜不足会导致标记不到微管,透膜过度会导致微管结构被破坏。因此在实验过程中,首先采用对照实验的方法,使用不同浓度的溶液、不同的反应时间,确定了对于标记最佳的反应浓度以及时间。在确定了实验条件后再对标记好的样品进行膨胀放大实验。
下面对本发明作更进一步的说明。
本发明涉及的原料来源如下:
1、PBS缓冲液为pH=7.4,浓度为10mM的PBS缓冲液;
2、荧光染料为Alexa Flour 488;
3、一抗为Mouse Anti-beta-Tubulin;
4、其余材料均为市售所得。
实施例1:
使用PBS缓冲液将Hela细胞清洗3次,加入0.01%的Triton X-100溶液静置12分钟后,使用PBS缓冲液将细胞清洗1次。加入固定液(4%多聚甲醛与戊二醛以500:1体积比配制)静置20分钟;使用PBS缓冲液将细胞置于摇床上清洗3次,每次5分钟;加入1mg/mL的NaBH
实施例2:
将标记好的Hela细胞中加入6-丙烯氨基乙酸琥珀酸酯(AcX)对生物组织中蛋白质进行锚定;将锚定后的Hela细胞置于冰面上完成以下操作:快速混合384μL凝胶单体溶液与8μL加速剂,再迅速混合8μL引发剂并摇匀,快速加入到生物细胞的玻底皿中。放入细胞培养箱中孵育1h形成凝胶;将所得凝胶加入4.5mL消化缓冲液,锡纸封装后置于摇床上过夜反应;从凝胶上取下小块凝胶,加入去离子水置于摇床上透析,每隔1h换一次去离子水,重复3-5次,直至膨胀至样本体积不再变化。
其中,凝胶单体溶液为0.38g/mL丙烯酸钠溶液、0.5g/mL丙烯酰胺溶液、0.02g/mLN,N-二甲基丙烯酰胺溶液、0.292g/mL氯化钠溶液、0.1mol/LPBS、去离子水按照体积比45:10:15:80:20:18配制成;加速剂为质量比为10%的TEMED溶液;引发剂为质量比为10%的APS溶液。消化缓冲液为0.05mol/L Tris溶液、0.001mol/L EDTA溶液、0.5%Triton X-100、0.8mol/L guanidine HCl溶液混合,并加入体积比为1:1500的K蛋白酶。
实施例3:
先将玻底皿中的水彻底吸干,后用2%的琼脂糖溶液将凝胶固定在玻底皿底部,在玻底皿中加入成像缓冲液以用于基于单分子定位的超分辨成像。成像缓冲液的配方为巯基乙醇(10μL/mL)、葡萄糖氧化酶(50μg/mL)、过氧化氢酶(50μg/mL)、葡萄糖(100mg/mL)。激发光波长为488nm,收集495-575nm之间的荧光信号进行超分辨成像。
本发明使用高密度的荧光标记方法对细胞样品的微管进行标记,之后经过6-丙烯氨基乙酸琥珀酸酯(AcX)处理,将细胞样品包埋在凝胶溶液中,孵育成吸水凝胶,再经过消化、膨胀,形成膨胀凝胶样品,从而使用超分辨显微镜进行成像。
本发明公开了一种基于高密度荧光标记法的细胞微管膨胀显微成像技术,具体步骤:直接对待观测的细胞使用Triton X-100进行透膜,然后对细胞进行固定处理;使用硼氢化钠溶液除去非特异性荧光,使用山羊血清进行封闭,并用荧光微管抗体进行特异性标记,形成高密度荧光标记的样品;使用6-丙烯氨基乙酸琥珀酸酯(AcX)进行锚定,使用凝胶单体溶液,通过引发剂和加速剂,将生物样品包埋在致密交联电解质的凝胶溶液中,孵育成吸水凝胶;胶凝胶样品置于消化液中进行消化处理;使用去离子水透析膨胀形成膨胀凝胶样品;使用超分辨显微镜进行成像。该成像方法通过使用高标记密度的微管荧光标记方法,极大改善了细胞微管膨胀显微技术的成像质量,确保了膨胀之后微管结构的连续性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
- 一种基于高密度荧光标记法的细胞微管膨胀显微成像方法
- 一种海水鲆鲽鱼类受精卵微管骨架和细胞核的荧光双标记的显微观察方法