一种破壁灵芝孢子粉电化学振荡指纹图谱的构建方法

技术领域

本发明属于中药质量分析检测技术领域，具体涉及一种破壁灵芝孢子粉电化学振荡指纹图谱的建立方法。

背景技术

灵芝(Ganoderma lucidum(Curtis:Fr.)P.Karst.)是一种隶属于担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、灵芝科、灵芝属的植物子实体，又被称为“瑞草”、“仙草”，是我国一种名贵的药用真菌，其具有补气安神、益肺活血、固本扶正等多种药理和保健功效。近年来，国内外大量的研究验证了灵芝具有多种药理作用，如抗癌、抗氧化、抗炎、保护心脏、抗肝毒性等。灵芝孢子粉是成熟灵芝的菌褶中弹射出来的生殖细胞，其中含有灵芝子实体内的几乎所有生物活性物质，主要包括三萜类、多糖类、核苷类、甾醇类、生物碱和有机酸等。其呈卵形双壁结构，最外层是能够阻碍人体消化吸收的几丁质纤维素，随着近年来孢子收集技术和破壁技术的发展，破壁灵芝孢子粉的活性成分开始被人们重视，成为当前研究和开发的热点。

近年来，市场上的破壁灵芝孢子粉产品逐年增加，为打击孢子粉市场以劣充优、以假乱真等现象，开发和建立孢子粉安全使用、质量保障及科学鉴别技术成为重要课题。目前文献报道的中药鉴别分析方法主要有：色谱指纹图谱及其联用技术、DNA分子标记技术、光谱指纹图谱技术，这些方法虽然已经相对成熟，都存在样品预处理繁琐、操作要求苛刻、仪器设备昂贵、应用范围有限等缺点。化学振荡反应是一种非线性平衡周期性现象，当反应物在特定的浓度范围时，体系溶液的颜色、物理化学参数等会随着时间呈周期性变化，由Belousov发现、Zhabotinsky改进的B-Z振荡作为经典的振荡现象，一般指溴酸盐在酸性介质中氧化有机酸、酮或酯等一类含有活泼亚甲基化合物的振荡反应。

中药中含有的化学成分复杂多样，成分的种类、含量不同，导致不同药材对电化学振荡体系的抑制作用不同，以此判别药材的种类与浓度。该技术应用于中药的产地或真伪鉴别，无需预处理提取、分离纯化等操作，不会造成样品成分损失，可以最大限度保护中药的“整体性”不被破坏，对不同中药体系具有普适性，设备成本低、操作简便、对化学组分灵敏度高、特征参数直观易读，指纹图谱重现性好，具有很好的应用前景。

本发明通过电化学振荡指纹图谱的建立，为评价破壁灵芝孢子粉及其产品的质量提供了更加快捷灵敏的科学方法，对有效控制其质量的优劣与产地溯源具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种破壁灵芝孢子粉电化学振荡指纹图谱的建立方法，能够克服现有破壁灵芝孢子粉质量监测方法的片面性，提供一种适用范围广、检测准确、操作便捷、成本低廉的检测方法，该方法为破壁灵芝孢子粉系列产品的质量控制、质量标准的制定提供了有力支持。

本发明提供以下技术方案：

一种破壁灵芝孢子粉电化学振荡指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：

(1)震荡体系溶液配制步骤：以超纯水为溶剂，分别配制硫酸溶液、丙二酸溶液、硫酸铈铵溶液和溴酸钾溶液，备用；

(2)破壁灵芝孢子粉的预处理步骤：将破壁灵芝孢子粉放入烘箱，除去样品中含有的水分，制得破壁灵芝孢子粉样品；

(3)电化学振荡指纹图谱检测步骤：将待测破壁灵芝孢子粉样品和震荡体系溶液加入夹套反应器中，体系在磁力搅拌器匀速搅拌下充分混合，恒温35℃水浴槽，反应体系处于恒温条件下保持5min；将铂电极和甘汞电极放入夹套反应器中，分别连接电位仪的工作电极和参比电极，开始记录开路电压随时间变化的E-T曲线，当体系电位保持5min稳定不变后，加入溴酸钾溶液，记录整个反应过程的E-T曲线，直到电位振荡消失；

(4)分别提取感应时间(tind)、峰值时间(tpet)、振荡峰值电位(Epet)、振荡起始电位(Euns)、最大振幅(ΔEmax)、振荡寿命(tund)、振荡结束时间(tune)和振荡周期(τund)电化学特征参数数值，并计算相对标准偏差RSD。

进一步的，所述步骤(1)中震荡体系各溶液浓度为硫酸溶液3.0mol/L、丙二酸溶液0.4mol/L、硫酸铈铵溶液0.016mol/L，步骤(2)中破壁灵芝孢子粉样品配置浓度为0.01g/mL，步骤(3)中，磁力搅拌器转速为400rad/s。

利用破壁灵芝孢子粉电化学振荡指纹图谱的构建方法检测破壁灵芝孢子粉浓度的方法，由电化学特征参数与样品浓度拟合方程计算破壁灵芝孢子粉浓度，线性方程如下：

进一步的，还包括步骤(5)HPLC指纹图谱建立步骤：将破壁灵芝孢子粉加入浓度为60％的乙醇溶液中进行提取，加热回流60分钟，料液比为1:5～1:20，取上清液，抽滤，得到的滤液减压浓缩后制为待测样品溶液，对待测样品溶液进行超高效液相色谱检测，记录出峰时间和峰面积，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对待测样品溶液的HPLC色谱图进行相似度计算，获得共有特征峰。

进一步的，HPLC条件为：色谱柱为XB-C18色谱柱，检测波长为252nm，进样量为10μL，流速为1.0mL/min；流动相溶液成分为乙腈-甲酸水溶液梯度洗脱，其中甲酸水溶液浓度为0.00％～0.02％，柱温为20～40℃；流动相(A)乙腈+(B)甲酸水溶液(v/v)＝100％；洗脱梯度为：0～5min：22％(A)；5～10min：22～35％(A)；10～30min：35～40％

(A)；30～32min：40～42％(A)；32～37min：42～45％(A)；37～40min：

45～22％(A)；40～43min：22％(A)；破壁灵芝孢子粉的指纹图谱中包含15个共有特征峰，保留时间如下表：

利用破壁灵芝孢子粉电化学振荡指纹图谱的构建方法区分破壁灵芝孢子粉产地的方法，利用主成分分析法和正交偏最小二乘分析法通过电化学指纹图谱对不同地区破壁灵芝孢子粉样品进行区分。

利用破壁灵芝孢子粉电化学振荡指纹图谱的构建方法，采用正交偏最小二乘分析法，电化学特征参数数值振荡峰值电位Epet、最大振幅ΔEmax、振荡寿命tund、振荡结束时间tune作为区分产地的标志物。

利用破壁灵芝孢子粉电化学振荡指纹图谱建立特征参数与HPLC总峰面积关联关系的方法，在液相色谱252nm检测波长下破壁灵芝孢子粉样品HPLC总峰面积与振荡峰值电位之间线性方程为y＝1.046-1.008E-5x，R

采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明构建的方法中电化学指纹图谱中8项特征参数RSD值均小于5.00％，重复性好，结果稳定可靠，可用于样本的指纹分析；

(2)电化学指纹图谱能够利用特征参数快速检测样品中破壁灵芝孢子粉浓度，其中振荡结束时间和振荡周期与样品浓度之间的P系数都大于0.95，两种参数的线性方程都能够准确计算破壁灵芝孢子粉浓度；

(3)电化学指纹图谱通过主成分分析与OPLS-DA分析，将未知样品归类到具体产地，且分析结果与HPLC图谱分析结果一致，两种方法能够相互印证；

(4)皮尔逊特征参数分析得出HPLC总峰面积与Epet呈显著负相关性，建立线性方程后，可通过Epet值计算灵芝孢子粉样品在252nm下的HPLC总峰面积，相较于传统HPLC分析，耗时短，成本低，数据处理简便。

附图说明

图1是本发明各组预实验条件下电化学振荡图谱图；

图2是电化学指纹图谱(ECFP)参数示意图；

图3是样品浓度与电化学特征参数Person系数图；

图4是本发明15批样品电化学振荡指纹图谱图；

图5是本发明15批样品的PCA得分图；

图6是本发明15批样品的电化学特征参数OPLS-DA分析结果图；

图7是本发明15批不同产地破壁灵芝孢子粉样品HPLC指纹图谱图；

图8是本发明15批样品的HPLC共有峰PCA得分图；

图9是本发明15批样品的HPLC指纹图谱共有峰OPLS-DA分析结果图；

图10是HPLC指纹峰面积与电化学特征参数Person系数图

图11是本发明HPLC总峰面积与Epet拟合方程的结果示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的结构图及具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

本实施例提供了一种破壁灵芝孢子粉电化学振荡指纹图谱的构建方法，包括：取破壁灵芝孢子粉为样品，配制硫酸溶液、丙二酸溶液、硫酸铈铵溶液、溴酸钾溶液混合为振荡体系，将样品加入振荡体系后，根据电位仪记录的E-T曲线得出破壁灵芝孢子粉的电化学振荡指纹图谱。

1.破壁灵芝孢子粉的前处理：

将15批不同产地破壁灵芝孢子粉放入烘箱内，至每份样品中的水分完全烘干。本发明中所采用的15批破壁灵芝孢子粉样品产地信息如表1所示：

表1

2.振荡体系溶液配制：

电化学振荡反应体系中，各离子浓度和样品浓度对反应平衡的影响很大，因此需要对参与反应的各物质浓度进行优化，本实施例中对硫酸、丙二酸、硫酸铈铵溶液以及样品浓度进行了优化，溴酸钾溶液所用浓度为0.3mol/L；各溶液的预实验浓度范围为：硫酸溶液1.0～5.0mol/L，丙二酸溶液0.1～0.8mol/L，硫酸铈铵溶液0.004～0.064mol/L，样品浓度0.002～0.013g/mL；根据各条件下所得电化学图谱的振荡时间以及振荡频率综合分析，优化得出各溶液浓度为：硫酸溶液3.0mol/L、丙二酸溶液0.4mol/L、硫酸铈铵溶液0.016mol/L、样品浓度0.01g/mL。各预实验条件下的电化学图谱见图1。

3.电化学振荡指纹图谱检测：

将15批待测破壁灵芝孢子粉样品和震荡体系溶液分别加入夹套反应器中，体系在磁力搅拌器匀速搅拌下充分混合，同时开启恒温水浴槽，让反应体系处于恒温条件下保持5min。接着将铂电极和甘汞电极放入夹套反应器中，分别连接电位仪的工作电极和参比电极，开始记录开路电压随时间变化的E-T曲线，当观察到体系电位保持5min稳定不变后，加入溴酸钾溶液。记录整个反应过程的E-T曲线，直到电位振荡消失；

4.方法学考察：

在确定的最佳反应条件下，平行测量6个S1样品以验证重复性。计算了8个电化学特征参数的相对标准偏差(RSD)，如图2所示。结果表明，感应时间(tind)、峰值时间(tpet)、振荡峰值电位(Epet)、振荡起始电位(Euns)、最大振幅(ΔEmax)、振荡寿命(tund)、振荡结束时间(tune)和振荡周期(τund)的RSD分别为3.46％、1.28％、0.48％、2.19％、0.95％、1.46％、2.13％和2.53％，平均RSD为1.81％，RSD值均小于5.00％，重复性好。总之，本研究建立的电化学指纹图谱稳定可靠，可用于样本的指纹分析。

实施例2

电化学指纹图谱中特征参数较多，为探究特征参数与样品量之间的关系，对样品浓度与8个电化学特征参数进行皮尔逊(Pearson)相关系数分析。8个电化学特征参数与样品浓度之间的Person系数如表2所示。

表2

相关性系数是介于[-1，+1]之间的实数，当相关性系数介于-1～0之间时，表明变量之间存在负相关关系；当相关性系数介于0～1之间时，表明变量之间存在正相关关系；当相关性系数为0时，二者之间不存在相关性。相关性系数越接近1，表明变量之间的相关性越强，当相关系数越接近0，表明变量之间的相关性越弱。所有参与B-Z振荡反应的组分对整个E-T曲线都有不同程度的贡献，抑制程度与样品中电活性成分的组成和分布有关。

如图3所示，随着样品添加量的增加，在8个特征参数中，tpet、Epet、Euns、tund和tune的Person值均接近1，与样品浓度具有显著相关性，且tpet呈正相关，Epet、Euns、tund和tune呈负相关，这种趋势归因于电活性成分浓度增加对B-Z电化学振荡反应的抑制作用。

基于上述5个特征参数与样品浓度之间显著的相关性，对5组参数进行线性拟合，拟合方程如下(表3)，根据线性方程可知，由电化学指纹图谱中的特征参数能够得出未知样品中破壁灵芝孢子粉浓度，比起传统方法，电化学检测简单快捷，且准确性高，能够成为新型检测方法。

表3

实施例3

基于电化学指纹图谱的不同产地破壁灵芝孢子粉产地溯源分析：

15批样品电化学振荡指纹图谱见附图4，从15张图谱中各提取8个电化学特征参数，包括感应时间tind、峰值时间tpet、峰值电位Epet、震荡起始电位Euns、最大振幅△Emax、振荡寿命tund、振荡结束时间tune、振荡周期τund，具体数据如表4所示。

表4

主成分分析(PCA)法：

PCA是一种线性降维技术，用于将多因素转移到低维空间，以保留最大程度的因素信息。PCA用于生成具有线性相关性的色谱图的更直观的比较，这些色谱图被整合到一组新的不相关的聚集指标中。在本研究中，使用PCA提取了15个样本特征值大于1的前三个主成分，计算出前三个主成分的累计贡献率为80.9％，t[1]：第一主成分；t[2]：第二主成分，其中t[1]的累计贡献率为56.5％，t[2]的累计贡献率为24.4％，满足主成分分析的累积方差百分比(CPV，>70-85％)要求。主成分分析结果显示在一个分数图中，结果如图5所示，它显示了指纹的区分峰面积，不同产区间主成分方向变化趋势明显。结果证实，主成分分析法能够完全区分吉林和其他两个地区的样品。吉林样品位于得分图的右下侧，安徽和福建样品位于得分图的左上侧，说明中国东南地区与东北地区破壁灵芝孢子粉样品的化学成分存在一定的差异。其中安徽产地样品得分点比其他产地更加集中，说明安徽产地样品质量更加稳定。

正交偏最小二乘分析法(OPLS-DA)：

OPLS-DA可以增强数据中的相关信息，同时降低数据中的不相关噪声。利用OPLS-DA分析不同样品的差异，检测对15组化学性状影响最大的特征成分。OPLS-DA得到(2+0)分量，其中R2(X)为80.3％，R2(Y)为53.5％，Q2为37.3％，表明模型质量良好(图6b.)。如图6a.所示，根据OPLS-DA模型，不同来源的样品明显分为两组。吉林样品位于得分图的左侧，其他样品位于得分图的右侧，说明不同地区样品的化学成分存在一定差异。

在OPLS-DA的加载变量散点图中(附图6c.)，离原点较远的变量对这些样品的分离起着重要作用。从图中可以看出，振荡峰值电位(Epet)和振荡周期(τund)两个变量对样本分类的影响较大。另一方面，投影变量重要性值(VIP)>1.0的样本，通常与样本分类更相关。附图6d.显示了所有变量的VIP值，显示了不同区域之间最相关的变量。在OPLS-DA的VIP图中，变量Epet、τund、ΔEmax、tune对不同产地间的区分影响最大，可作为区分三种产地的潜在标志参数。

实施例4

本发明的构建方法还包括HPLC指纹图谱的建立步骤，取破壁灵芝孢子粉为原料制备供试液，将供试品溶液注入超高效液相色谱仪中检测，根据液相色谱图得出破壁灵芝孢子粉的指纹图谱。以下提供了具体的构建方法。

1.液相色谱法条件优化：

取S1乙醇加热回流提取液为样品，以XB-C18柱为色谱柱，以乙腈为流动相A，以含0.01％体积浓度的甲酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱。

初步尝试液相洗脱方法为：色谱柱为XB-C18色谱柱(4.6×250mm，5μm，上海Welch公司)，柱温为30℃，流速为1.0mL/min，洗脱程序为：0～5min：22％A；10min：35％A；30min：40％A；32min：42％A；37min：45％A；45min：65％A；55～60min：100％A。在此洗脱条件下，部分峰未能基线分离。

基于实际实验结果，优化得出洗脱方法为：0～5min：22％A；5～10min：22～35％A；10～30min：35～40％A；30～32min：40～42％A；32～37min：42～45％A；37～40min：45～22％A；40～43min：22％A。在此洗脱条件下，供试品共有峰的峰形与分离度都较为理想。

2.供试品溶液的制备：

破壁灵芝孢子粉含油率较高，其经过提取浓缩后会析出一定比例的孢子油，油脂会对色谱柱和检测器造成污染，影响样品溶液的检测，因此在前处理过程中要将孢子油除去，同时需要对各提取步骤进行条件优化，使孢子粉中的化合物尽可能被提取。综合考虑三萜提取率、油脂溶出量和实验安全性，选择60％乙醇加热回流提取90min，提取温度80℃，料液比1:10为反应条件。

3.HPLC指纹图谱建立：

相似度评价：收集15批不同产地破壁灵芝孢子粉提取溶液的HPLC检测结果，导入中药指纹图谱相似度评价系统(2.0版)软件，以S1样品为参照谱图，设置时间窗宽度为0.5min，利用中位数法生成对照指纹图谱，生成的对照图谱及样品图谱见附图7，可以确定15个共有特征峰，各共有峰的保留时间见表5，15批样品对应的峰面积见表6。

表5

表6

15批破壁灵芝孢子粉样品的HPLC图谱与生成的参照图谱之间相似度大于0.9，表明15批样品质量稳定，化学成分没有明显波动。指纹图谱可作为共性质量特征，用于破壁灵芝孢子粉的鉴别和质量控制。

主成分分析：

对样品的多项指标进行主成分分析，能将多个相关指标化为少数几个综合指标，以反映大量的原始变量，从而使数据简化，提高分析效率。以3个产地15批灵芝孢子粉HPLC指纹图谱的15个共有峰面积为变量，导入SPSS27.0软件进行无监督模式主成分分析(PCA)，Bartlett球形检验结果显著(<0.01)，说明分析的变量存在共线性关系，适合进行主成分分析。特征值大于1的前三个主成分贡献率分别为：t[1]61.7％、t[2]16.1％、t[3]7.11％，满足主成分分析的累积方差百分比(CPV，>70-85％)要求。主成分分析结果显示在一个分数图中(图8)，结果证实，主成分分析法能够完全区分吉林和其他两个地区的样品。吉林样品位于得分图的右侧，安徽和福建样品位于得分图的左侧，说明中国东南地区与东北地区破壁灵芝孢子粉样品的化学成分存在一定的差异。并且该分类结果与电化学指纹图谱PCA分类结果相似，说明两种分类方法具有一致性，同时也说明本发明的指纹图谱的构建可靠性。

正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)：

为了更好地体现三个产地样品在成分含量上的组间差异，进一步做了有监督模式的OPLS-DA识别，筛选出对产地差异贡献较大的成分。选取15批次样品的15个共有峰面积数据导入SIMCA软件中，建立偏最小二乘分析模型，如图9所示，该模型中R2(X)＝80.6％，R2(Y)＝75.7％，Q2＝52.1％，表明模型质量良好(图9b.)，根据OPLS-DA模型，不同来源的样品明显分为两组。吉林样品位于得分图的右侧，其他样品位于得分图的左侧，说明不同地区样品的化学成分存在一定差异。并且安徽产地样品分布更为集中，说明安徽产地样品质量稳定。

实施例5

电化学振荡指纹图谱原理是从电活性这一宏观层面对药品进行整体分析，而HPLC指纹图谱则是从药品中含有的化学成分这一微观层面出发，同时电化学图谱操作更加便捷，而HPLC指纹图谱虽然操作繁琐耗时，但目前仍是国际公认的中药检测手段。因此，将电化学结果与HPLC结果相互比对，能够进一步验证电化学图谱对于药品评价分类的科学性和准确性。

为了研究电化学特征参数与样品活性成分之间的关系，对HPLC指纹峰面积-电化学参数进行Person相关分析，结果见图10，根据B-Z电化学振荡反应的原理，样品中氧化还原活性成分越高，对反应的抑制作用越强，在相关系数的分析结果中也展现了这一趋势，HPLC总峰面积与Epet呈显著负相关性，说明有效成分含量越高的样品，其对B-Z振荡反应的抑制越强，因此电化学震荡指纹图谱Epet值越低。

选取与HPLC峰面积最相关的参数Epet进行线性拟合，得出线性方程见图11，方程为y＝1.046-1.008E-5x，R

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。