一种同时检测槲皮素和山奈酚的传感器及直接电化学方法

技术领域

本发明属于化合物定量检测技术领域，具体涉及一种同时检测槲皮素和山奈酚的传感器及直接电化学方法。

背景技术

银杏叶具有抗炎、抗氧化、活血养心、敛肺涩肠等多种生物活性，广泛存在于自然界中，而槲皮素和山奈酚是银杏叶中的两大有效成分，其结构式如下所示：

槲皮素(Quercetin)是一种具有丰富药理活性和药物学功效的多羟基黄酮类化合物，可作为抗氧化剂，清除人体内的自由基，此外，还有抗菌、抗病毒、改善心血管功能、增强毛细血管抵抗力等作用；山奈酚(Kaempferol)也是一种天然黄酮类化合物，广泛存在于多种蔬菜水果及传统中草药中，具有抗炎、抗菌的作用，并且山奈酚还具有较强的抗氧化能力，可以保护人体细胞免受自由基损害。因此，建立一种可以同时检测山奈酚和槲皮素的电化学传感器至关重要。目前已经报道了多种分析方法检测生物样品中的槲皮素和山奈酚，如高效液相色谱法(HPLC)、紫外分光光度法(UV)、液相色谱-质谱串联法(HPLC-MS/MS)、毛细管电泳法(CE)、荧光法等。然而，这些方法普遍成本较高，对仪器和药物纯度以及操作技术的要求较高，在检测中存在一定的局限性。

发明内容

本发明的目的是提供一种同时检测槲皮素和山奈酚的传感器，至少可以解决现有技术中存在的缺陷。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种同时检测槲皮素和山奈酚的传感器，该传感器采用AuNPs和AgNPs通过电沉积修饰碳纤维电极形成的AuNPs/AgNPs/CFME电极作为工作电极。

进一步的，所述AuNPs/AgNPs/CFME电极是AgNPs先通过电沉积法修饰至碳纤维电极表面，得到AgNPs/CFME，再将AuNPs通过电沉积法修饰至AgNPs/CFME表面而制备得到。

本发明还提供了一种同时检测槲皮素和山奈酚的直接电化学方法，使用AuNPs和AgNPs通过电沉积修饰碳纤维电极形成的AuNPs/AgNPs/CFME电极作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，通过差分脉冲伏安法对样品进行检测。

进一步的，所述AuNPs/AgNPs/CFME电极制备过程如下：首先依次用乙醇和去离子水清洗CFME，然后在+1.5V的条件下，将CFME和参比电极Ag/AgCl浸入AgNPs溶胶中进行电化学沉积，使得AgNPs修饰在CFME表面，获得AgNPs/CFME；再依次用乙醇和去离子水清洗AgNPs/CFME，在+1.5V条件下，在AuNPs溶胶中电化学沉积，使得AuNPs修饰在AgNPs/CFME表面，制备得到AuNPs/AgNPs/CFME。

进一步的，所述CFME在AgNPs溶胶中电化学沉积时间为20min，所述AgNPs/CFME在AuNPs溶胶中电化学沉积时间为20min。

进一步的，所述AuNPs溶胶制备过程如下：将氯金酸溶液加入蒸馏水中加热搅拌，待溶液沸腾后加入柠檬酸三钠溶液并回流，直至溶液呈酒红色，冷却至室温后，置于4℃冰箱保存，即得AuNPs溶胶。

进一步的，通过差分脉冲伏安法对样品进行检测时，山奈酚氧化峰电位E

进一步的，山奈酚的氧化峰电流I

进一步的，山奈酚氧化峰电位E

进一步的，山奈酚和槲皮素的浓度在5×10

在本发明中，碳纤维电极(CFME)是以碳纤维为载体，以电化学反应为基本原理，通过测量电化学过程中的电流、电压等参数来检测待测物浓度的一种电化学传感器。它具有高灵敏度、快速响应、稳定性好、电化学窗口宽等优点，可应用于测定多种电化学活性物质，其检测性能非常依赖于电极表面的修饰材料。本发明使用CFM E先经过纳米银(AgNPs)进行表面修饰，再经过纳米金(AuNPs)进行表面修饰；AuNPs具有高比表面积和优异的导电性能，可以实现对特定目标物的高选择性检测，显著提高电极氧化还原过程中电子传递效率和反应速率，AgNPs具有良好的稳定性和导电性，可以降低背景信号的干扰，拓宽电化学检测的应用范围，提高电化学检测的准确性。同时Au-Ag双金属纳米颗粒间存在的协同效应，可以进一步增大比表面积，增加电化学活性位点，提高电极的电荷转移能力，增强电流响应，从而能够准确测定样品中槲皮素和山奈酚的含量。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明通过一种新型的电化学传感器AuNPs/AgNPs/CFME对样品中的槲皮素和山奈酚进行直接电化学检测，两组分均具有良好的电化学响应，并且在有其他杂质干扰的样品中，同样能够实现对槲皮素和山奈酚的同时检测，检测结果准确，检测限低，表现出良好的稳定性和抗干扰能力，能够在复杂的生物基质中提高检测的灵敏度和选择性。

以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1：A和B分别是AuNPs和AgNPs的TEM图，C和E分别是裸CFME和AuNPs/AgNPs/CFME的SEM图，D是AuNPs和AgNPs溶胶的紫外-可见吸收光谱图(a:AuNPs，b:AgNPs)；

图2：A是五种不同电极的DPV图，B是五种不同电极的电化学阻抗谱图，C是AgNPs电沉积时间与氧化峰电流的关系，D是AuNPs电沉积时间与氧化峰电流的关系，E是AuNPs/AgNPs/CFME在不同pH值的槲皮素和山奈酚溶液中的DPV图，F是山奈酚和槲皮素氧化峰电位与pH值的线性关系图，G是AuNPs/AgNPs/CFME在不同扫描速率下检测山奈酚和槲皮素的CV扫描曲线叠加图，H是山奈酚和槲皮素氧化还原峰电流与扫描速率的线性关系图，I是山奈酚和槲皮素氧化还原峰电位与扫描速率对数的线性关系图；

图3：A是AuNPs/AgNPs/CFME在槲皮素浓度保持不变的前提下，检测不同浓度的山奈酚的DPV图，B是氧化峰电流与山奈酚浓度的线性关系图，C是AuNPs/AgNPs/CFME在山奈酚浓度保持不变的前提下，检测不同浓度的槲皮素的DPV图，D是氧化峰电流与槲皮素浓度的线性关系图，E是AuNPs/AgNPs/CFME对不同浓度的槲皮素和山奈酚进行同时检测的DPV图，F是氧化峰电流与山奈酚和槲皮素浓度的线性关系图；

图4：A是AuNPs/AgNPs/CFME在槲皮素和山奈酚溶液中氧化峰电流值与扫描圈数的关系图，B是氧化峰电流与电极贮存时间的关系图，C是加入不同干扰物质后的氧化峰电流值图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明实施例中，除非特别指明，否则所用技术术语为本领域中的普通技术人员常用术语；本本发明实施例未注明具体条件的实验方法是按常规实验方法；本本发明实施例中所用的试验材料如无特别说明均为市售购买产品，各种试剂的成分和配制方法可参见常规实验手册中的操作。

表1：实验仪器

表2：实验试剂

实施例1：

本实施例提供了AuNPs/AgNPs/CFME的制备方法，具体过程如下：

1、AuNPs的制备

将柠檬酸钠作为还原剂还原金粒子，制备颗粒大小均匀的纳米金。将2.5×10

2、AuNPs/AgNPs/CFME的制备

采用碳粉导电胶将碳纤维与用砂纸打磨过的铜丝粘在一起，静置待胶全干；将粘有碳纤维的铜丝精准地穿入用火焰拉制过的玻璃毛细管中，确保碳纤维在毛细管尖端露出约2mm，用AB胶将铜丝与玻璃毛细管末端粘连固定；室温下静置一天，用酒精灯外焰将玻璃毛细管尖端熔封，即制得碳纤维微电极(CFME)。

将CFME和参比电极(Ag/AgCl)浸入装有AgNPs溶胶的小烧杯中，此过程确保电极尖端浸没至溶液中且不触碰烧杯壁，采用电沉积法，设置恒定电位+1.5V，将AgNPs修饰至CFME表面，即得AgNPs/CFME；再采用相同技术和实验参数，在所得AgNPs/CFME上复合构建AuNPs修饰层，将修饰电极采用超纯水清洗并室温晾干，即制得本实验所需的AuNPs/AgNPs/CFME。

3、AuNPs、AgNPs以及AuNPs/AgNPs/CFME的表征

采用透射电子显微镜(TEM)对AuNPs和AgNPs形貌进行表征，由图1中A可知，AuNPs呈球形，轮廓清晰且形状均匀，直径约为20nm，未出现团聚现象，分散性良好，由图1中B可知，AgNPs的粒径约10nm，具有较大的比表面积。此外，通过紫外-可见吸收光谱法验证了AuNPs溶胶的合成，如图1中D所示，在519nm(曲线a)处AuNPs的特征吸收峰，此外，图1中D还显示了AgNPs溶胶的特征吸收峰420nm(曲线b)。

采用扫描电子显微镜(SEM)观察了裸CFME和AuNPs/AgNPs/CFME的形貌特征。由图1中C可知，裸CFME的表面光滑平整，而经AuNPs和AgNPs修饰后，可以观察到CFME表面附着了大量的球形团簇(图1中E)，表明纳米颗粒(AuNPs和AgNPs)已成功修饰在CFME电极表面，并与CFME紧密结合。Au-Ag双金属纳米复合材料的协同作用极大提高了修饰电极的比表面积，有助于对槲皮素和山奈酚进行吸附，提高传感器的电化学性能。

实施例2：

本实施例考察了五种不同电极的电化学性能，即裸CFME电极、单层AuNPs修饰CFME的AuNPs/CFME电极、单层AgNPs修饰CFME的AgNPs/CFME电极、先AuNPs电沉积修饰CFME再电沉积AgNPs的AgNPs/AuNPs/CFME电极以及本发明制备的AuNPs/AgNPs/CFME电极。

上述五种不同电极在相同实验条件下检测槲皮素和山奈酚的差分脉冲曲线(DPV)如图2中A所示。在pH为4.0的含山奈酚和槲皮素的PBS缓冲溶液中，裸CFME仅表现出微弱的电流响应(山奈酚I

另外，本实施例还通过电化学阻抗(EIS)研究了上述五种不同电极表面的电子转移能力。在含10mmol/L[Fe(CN)

实验结果表明，AgNPs/CFME电极及AuNPs/CFME电极的电荷转移电阻均小于裸CFME电极(1.602×10

实施例3：

为了优化AuNPs/AgNPs/CFME的电化学性能，本实施例考察了AuNPs和AgNPs修饰CFME的电沉积时间对槲皮素和山奈酚电化学响应的影响，如图2中C和D分别为AgNPs和AuNPs经不同电沉积时间(5、10、15、20、25、30min)修饰后对浓度为1μmol/L槲皮素和山奈酚的检测结果。

由图2中C、D可以看出，电沉积初始，修饰电极的电流信号均随电沉积修饰时间的增大而呈上升趋势，当电沉积时间t＝20min时，峰电流值达到最大，之后电流随电沉积修饰时间的增大而下降；可能由于随电沉积修饰时间的增加，部分修饰材料脱落，电极的导电性能随之下降，因此，本实验选择AgNPs与AuNPs的最佳电沉积时间均为20min。

实施例4：

本实施例研究了AuNPs/AgNPs/CFME对样品中槲皮素和山奈酚的检测效果。采用双电极体系，将CHI660D型电化学工作站的白色、红色接线与Ag/AgCl参比电极相连，绿色接线与AuNPs/AgNPs/CFME工作电极相连；采用循环伏安法(CV)优化扫速、pH等实验条件，通过差分脉冲伏安法(DPV)记录扫描曲线的氧化峰电流值，对山奈酚和槲皮素进行分析测定。

1、pH值对槲皮素和山奈酚氧化峰电流的影响

如图2中E所示为pH在4.0-7.0范围内，AuNPs/AgNPs/CFME电极对两种检测物质扫描的DPV响应曲线。由图2中E可以看出，山奈酚和槲皮素的响应峰电流在pH4.0-7.0范围内随pH的增大而不断减小，pH为4.0时，山奈酚和槲皮素的氧化峰电流均为最大值，因此，选择pH为4.0的PBS缓冲液进行后续实验。同时，随着PBS缓冲液pH的增大，山奈酚和槲皮素的氧化峰电位逐渐负移，表明电极反应中有质子参与，且均为脱质子过程。

此外，研究了山奈酚和槲皮素反应过程中的氧化峰电位(E

根据能斯特方程E

结果表明，山奈酚和槲皮素的氧化峰电位E

2、扫描速率v对槲皮素和山奈酚氧化峰电流的影响

如图2中G所示为含1μmol/L的槲皮素与和山奈酚的PBS缓冲液在扫描速率10-500mV/s范围内的CV响应曲线；由图2中G可知，山奈酚和槲皮素的氧化还原峰电流均随扫描速率的增大而增加。

在扫描速率10-500mV/s范围内，山奈酚和槲皮素的响应峰电流与扫描速率呈良好的线性关系，如图2中H所示，山奈酚的氧化峰电流I

考虑到扫描速率过快会使基线噪音变大且氧化还原的可逆性变差，因此后续实验均采用100mV/s的扫描速率进行测量。

山奈酚和槲皮素的氧化还原峰电位(E

根据Laviron's方程

3、AuNPs/AgNPs/CFME上山奈酚和槲皮素的同时定量测定

探究AuNPs/AgNPs/CFME同时检测不同浓度的山奈酚和槲皮素。先采用DPV分别对山奈酚和槲皮素进行单独的定量检测，电位范围在0.1-1.1V，探究两种物质在AuNPs/AgNPs/CFME表面催化氧化的线性范围。

图3中A所示为在1μmol/L槲皮素共存的PBS溶液(pH＝4.0)中，检测不同浓度山奈酚的DPV曲线；由图3中A可知，在5×10

图3中C所示为在1μmol/L山奈酚共存的PBS溶液(pH＝4.0)中，检测不同浓度槲皮素的DPV曲线；由图3中C可知，在5×10

图3中E所示为同时改变山奈酚和槲皮素浓度进行DPV测定；由图3中E可知，当山奈酚和槲皮素的浓度在5×10

实施例5：

本实施例考察了AuNPs/AgNPs/CFME对山奈酚和槲皮素检测的稳定性和抗干扰性。

将AuNPs/AgNPs/CFME在含1μmol/L槲皮素和山奈酚的PBS缓冲液中进行DPV检测，将AuNPs/AgNPs/CFME连续扫描10圈，测量结果如图4中A所示，其响应电流值的变化较小。此外，在相同实验条件下连续10天每天重复一次实验，实验结果如图4中B所示，10天后的峰电流值为初始电流的95.2％(山奈酚)和95.8％(槲皮素)。实验结果表明，该AuNPs/AgNPs/CFME电极具有良好的稳定性。

在山奈酚和槲皮素溶液中分别加入1mmol/L浓度的Cl

实施例6：

本实施例将本发明的AuNPs/AgNPs/CFME传感器与已有报道的其他检测山奈酚或槲皮素的传感器的性能进行比较，其结果如表3所示。

表3：不同传感器检测槲皮素或山奈酚的性能对比

其中，GCE：玻碳电极，Fe

文献：

[1]ARVAND M,CHAIBAKHSH N,DANESHVAR S.Amperometric determination ofquercetin in some foods by magnetic core/shell Fe

[2]LIN X-Q,HE J-B,ZHA Z-G.Simultaneous determination of quercetin andrutin at a multi-wall carbon-nanotube paste electrodes by reversingdifferential pulse voltammetry[J].Sensors and Actuators B:Chemical,2006,119(2):608-14。

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[4]PIOVESAN J V,JOST C L,SPINELLI A.Electroanalytical determinationof total phenolic compounds by square-wave voltammetry using a poly(vinylpyrrolidone)-modified carbon-paste electrode[J].Sensors and ActuatorsB:Chemical,2015,216:192-7。

[5]孙月新,蒋丽萍,陈波,等.石墨烯电化学传感器对药物中山奈酚含量的检测[J].山东化工,2023,52(16):151-3。

在本实施例中，与已有报道的检测山奈酚或槲皮素的传感器相比，本发明制备的AuNPs/AgNPs/CFME传感器表现出优越的电化学性能，且能实现对槲皮素和山奈酚的同时检测。

实施例7：

本实施例采用AuNPs/AgNPs/CFME在人血清样品中同时检测山奈酚和槲皮素。首先对实际样品进行预处理，用pH值4.0的PBS缓冲液稀释人血清，然后在稀释后的溶液中加入不同浓度的标准品，检测并记录其电流响应，通过3次平行实验在人血清样品中检测山奈酚和槲皮素，其结果如表4所示。

表4：人血清中槲皮素和山奈酚的测量(n＝3)

由表4可知，实际样品中槲皮素和山奈酚的加标回收率在95.6-103.3％之间，表明AuNPs/AgNPs/CFME具有良好的准确度和可靠性，可应用于实际生物样品中槲皮素和山奈酚的同时定量分析。

综上所述，本发明通过一种新型的电化学传感器AuNPs/AgNPs/CFME对样品中的槲皮素和山奈酚进行直接电化学检测，两组分均具有良好的电化学响应，并且在有其他杂质干扰的样品中，同样能够实现对槲皮素和山奈酚的同时检测，检测结果准确，检测限低，表现出良好的稳定性和抗干扰能力，能够在复杂的生物基质中提高检测的灵敏度和选择性。

以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。