一种多聚酶标抗体组合物的制备方法

技术领域

本发明涉及免疫组化检测技术领域，具体涉及一种多聚酶标抗体组合物的制备方法。

技术背景

病理诊断作为肿瘤诊断的“金标准”，可通过对人体组织或细胞进行一系列处理和观察，研究疾病病因、发病机制、形态结构、功能和代谢方面的改变，揭示疾病的发生发展规律，从而阐明疾病本质。组织病理和细胞病理是病理诊断的两类基本方式，主要进行的是形态学观察。通过免疫诊断或分子诊断相结合，病理诊断形成了另外两个重要分支：免疫组化病理和分子病理，将病理诊断从组织、细胞水平的形态学观察深入到蛋白与分子水平。其中免疫组化技术具有检测速度快、成本低、可对石蜡包埋样本和冰冻切片进行分析等优势，在临床上应用最为广泛。免疫组化可提供蛋白质表达层面的客观证据，在肿瘤良恶性判断、确定肿瘤细胞来源、鉴别诊断肿瘤类型或亚型、肿瘤分化方向、预后判断、靶向治疗、微小转移灶的发现和确定等方面有广泛应用。

在免疫组化检测技术中，抗体与酶的组合物(二抗)对免疫分析的特异性与灵敏度具有极其重要的作用。酶标记抗体的传统方法是过碘酸钠氧化法和戊二醛氧化法，此类方法得到的酶标产物只带有较少的酶分子(图1A)，不能满足灵敏度需求，在病理免疫组化检测中难以应用。为了满足检测灵敏度的需求，多种二抗检测系统被开发和应用。例如，早期的酶标链霉卵白素-生物素染色法(SABC法)，检测原理如图1B所示，该方法基于“生物素-链霉卵白素之间的高度亲和力”原理，通过“生物素标记二抗”和“链霉卵白素-生物素-酶组合物”的结合，形成多聚物，使得检测的灵敏度大幅提升。该方法的主要缺陷在于，核心的ABC组合物会和细胞组织中普遍存在的生物素结合，从而产生严重的非特异性染色，很大程度上干扰了结果的判读。因此，该方法目前在临床免疫分析中已被逐步淘汰。目前，Polymer-酶标二抗法即酶标多聚物染色法使用较为广泛(图1C)。该法是将酶标记在以惰性葡聚糖为骨架的主链上，形成葡聚糖酶组合物，每一条葡聚糖主链上可连接多个酶分子及抗体分子，该系统可同时连接不同抗性的二抗，从而特异性结合兔或鼠来源的一抗。有效避免了内源性生物素引起的非特异性染色，且其灵敏度可与酶标链霉卵白素-物素染色法相媲美，故此方法是目前临床应用的主流方法。但此类二抗所使用的葡聚糖骨架分子量较大，虽然同时连接了多个酶和抗体分子，但其结构松散，流体动力学体积较大，从而形成较大的空间位阻，使得该聚合物对于细胞核膜的穿透力低下，核染效果差。

为改善此类问题，中国专利CN112305222A和CN113391059A分别采用体积更小的多聚体酶-抗体片段和多聚酶标纳米抗体，较普通多聚酶标抗体产品而言，该类产品提高了分子运动能力和穿透能力，核染色效果更好。过小体积的多聚体意味着分子运动更快且敏感性更差，针对胞染和膜染等免疫组化染色情形，过小体积的多聚体与目标物(一抗)有效结合率下降，导致该产品普适性较差、对不同类型抗原检测的效果参差不齐。此外中国发明专利CN105566499A则对骨架材料进行了优化，采用紧凑的树枝状聚合物作为骨架，克服目前使用链状高分子(比如以葡聚糖或多肽)为载体的多聚体酶标方法的主要缺陷，缩小了多聚体酶的体积，提高单位体积内连接到二抗上的酶的数目和分子穿透力。但是，此技术在制备过程中多次使用剧毒的二乙烯基砜(DVS)做偶联试剂，危害环境和人体健康。

发明内容

基于现存的技术问题和难点，本发明提出了一种新型的紧凑型多聚酶标抗体的制备方法。本发明通过骨架材料种类、偶联剂种类和制备方法的优化，避免了在生产制备过程中剧毒原料的使用，提升了产品生产的安全性；通过本发明所制备的多聚酶标抗体组合物采用了多抗和纳米抗体搭配的形式，针对不同定位抗原匹配了不同尺寸的多聚酶标抗体组合物，提高二抗对于细胞核膜的穿透力，同时克服了不同类型抗原检测表现出的参差不齐以及普适性问题。进一步地，本发明所述多聚酶标抗体的骨架改善了多聚酶标抗体的亲水性，有效降低了背景染色；同时减小了免疫组化二抗的体积，进一步提高了其分子运动能力和穿透能力。

因此，本发明的一方面在于提供了一种多聚酶标抗体组合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)分别制备得到第一多聚酶标抗体和第二多聚酶标抗体；

(2)将第一多聚酶标抗体和第二多聚酶标抗体混合，得到多聚酶组合物；

其中，所述第一多聚酶标抗体包含多抗、第一高分子骨架以及第一酶；

所述第二多酶标抗体包含纳米抗体、第二高分子骨架以及第二酶。

进一步地，所述第一多聚酶标抗体和第二多聚酶标抗体的制备方法包括以下步骤：

a.多酶聚合物制备；

b.多酶聚合物活化；

c.标记抗体活化；

d.多酶聚合物标记抗体。

进一步地，所述多酶聚合物的制备步骤包括：

a1制备带有活性官能团的活化酶；任选地，通过戊二醛交联法或高碘酸钠氧化法制备活化酶；

a2将高分子骨架化合物加入含有活化酶的溶液中反应；其中，反应pH值9-10，反应温度20-30℃，反应时间2-6h；

a3将适量还原剂加入反应体系中，然后使用缓冲液调节pH并透析过夜，得到多酶聚合物溶液；

优选地，所述还原剂为硼氢化钠，所述缓冲液为含有PBS的缓冲液。

进一步地，所述多酶聚合物活化的制备步骤包括：

b1称取适量偶联剂，将其溶解后加入步骤a3制备的酶聚合物溶液中，混匀后反应；其中，反应温度20-30℃，反应时间0.5-2h；

任选地，偶联剂为异双官能团偶联剂，优选为分子量小于1000，例如4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-SMCC)；

b2将活化后的多酶聚合物溶液过脱盐柱，即可得修饰的多酶聚合物。

进一步地，所述标记抗体活化的制备步骤包括：

c1将抗体溶解于缓冲溶液中；

c2将蛋白修饰剂加入上述多抗反应液中，反应一段时间后，将反应后的溶液过脱盐柱，即得修饰的抗体；

优选地，所述蛋白修饰剂选为异型双功能偶联剂，例如2-亚氨基硫烷盐酸盐；所述缓冲液为含有PBS的缓冲液。

进一步地，所述多酶聚合物标记抗体的制备步骤包括：

将修饰的多酶聚合物与修饰的抗体混合均匀后反应一段时间，反应液过蛋白纯化柱纯化，收集第一个主峰，即得多聚酶标抗体；其中，抗体分别为多抗和纳米抗体时，则分别制备得到第一多聚酶标抗体(多聚酶标多抗IgG)和第二多聚酶标抗体(多聚酶标纳米抗体)。

不受举例限制，对于脱盐柱和蛋白纯化柱的选择，本领域技术人员具备能力从市售产品中进行选择或自行配制；其中脱盐柱可选为市售产品，如填料为G-25M的PD-10脱盐柱；蛋白纯化柱为Sephacryl S-200。

所述第一酶和第二酶分别选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-糖苷酶。

进一步地，所述多抗选自羊抗鼠IgG、兔抗鼠IgG、马抗鼠IgG、羊抗兔IgG、马抗兔IgG、鼠抗兔IgG、驴抗羊IgG、马抗羊IgG、鼠抗羊IgG、兔抗羊IgG及以上相应IgG的Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段中的一种或多种；所述纳米抗体通过噬菌体展示技术获得；优选地，所述纳米抗体选自可靶向小鼠、兔或山羊IgG中的一种或多种，亲和力高，特异性强，且与人IgG无交叉反应。

针对部分组织样品核染的需要，所述组合物中第一多聚酶标抗体与第二多聚酶标抗体的质量比小于13:1被认为是有益的；优选小于5:1。基于多聚酶标抗体组合物针对不同样本染色普适性需要，所述组合物中第一多聚酶标抗体与第二多聚酶标抗体的质量为1:5-13:1，优选为1:2-5:1。

进一步地，所述第一酶和第二酶分别直接与第一高分子骨架和第二高分子骨架相连，优选地，相连方式通过酶上活性官能团与骨架上的活性官能团反应或通过1-3个小分子相连，如醇类、醛类和脂肪酸类等，避免间接连接结构的过长导致多聚酶标抗体体积的增加，进而减弱多聚酶标抗体的穿透力。所述高分子骨架为聚乙二醇或其衍生物连接聚乙烯亚胺和/或其衍生物的高分子化合物，该类骨架材料具有改善紧凑型多聚酶标抗体的亲水性作用，相对于其他骨架材料而言，可极大减小免疫组化二抗的体积，提高了其分子运动能力和穿透能力，并降低了背景染色。

聚乙二醇衍生物为骨架或主链为聚乙二醇，骨架或主链存在支链的情况；按端基是否修饰，聚乙二醇结构包括但不限于端基不修饰的和端基修饰的，端基修饰基团包括但不限于甲基、乙基、异丙基、叔丁基、环丙基等。

聚乙烯亚胺衍生物为骨架或主链为聚乙烯亚胺，骨架或主链存在支链的聚合物；优选地聚乙烯亚胺衍生物为带有支链带有氨基的一类。

进一步地，仅在聚乙二醇或其衍生物的一端连接聚乙烯亚胺和/或其衍生物，可避免在骨架材料两端均连接酶和/或抗体，增加多聚酶标抗体的体积。

例如，聚乙二醇连接聚乙烯亚胺化合物包括直线型(例如式一所示)和多头型(例如式二和式三所示)中的一种。

其中，

R

n＝0-6；

q≥2；

X为包含碳原和/或氧原子的连接部分，例如羰基；

m＝22-900，优选m＝25-500；

j+p＝2-500；优选2≤j+p≥250；

k＝0-50，优选1≤k≤25。

所述“直线型”为骨架中聚乙烯亚胺部分不存在支链的情形(例如式一所示)；所述“多头型”为骨架中存在多个聚乙烯亚胺和/或聚乙烯亚胺衍生物部分(例如式三所示)，或存在一个带有氨基支链的聚乙烯亚胺部分。

任选地，所述高分子骨架中聚乙二醇或其衍生物的分子量为1000-40000，优选为2000-30000；所述聚乙烯亚胺和/或其衍生物的分子量为100-30000，由于抗体及酶空间位阻较大，为便于骨架材料中聚乙烯亚胺和/或其衍生物部分连接适量的抗体及酶，骨架材料中聚乙烯亚胺和/或其衍生物部分分子量优选大于500，更优选地大于1000。骨架材料分子量过大会使得多聚酶标抗体复合物体积更大而导致穿透力下降。因此，优选地，所述骨架材料分子量小于45000，更优选小于35000。

基于强化染色效果需要，所述第一高分子骨架和第二高分子骨架上分别含有至少2个酶；优选地，所述第一高分子骨架和第二高分子骨架上分别含有至少4个酶，因此多头型骨架是优选的。

聚乙二醇与聚乙烯亚胺的连接方式包括：碳氮键、酰胺键、碳-酰胺键。

进一步地，所述所述第一高分子骨架材料与第二高分子骨架材料种类不同。

本发明的另一方面在于，前述任一组合物在制备标志物捕获或结合标志物产品中的应用，例如，在制备免疫组化检测产品中的应用；优选地所述产品为试剂盒。

“标志物”具有本领域通晓的含义，是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生改变的生化物质，具有指示生物生理状态作用，从自然属性可分为核酸类(如DNA和RNA)，蛋白类、糖类及相关衍生物或无机物类等。

申请人确信，基于本领域技术现状与本申请所验证内容，本发明提供的多聚酶标抗体组合物及其制备方法具有如下优点：

(1)基于骨架材料种类、偶联剂种类和制备方法的优化，本发明所述多聚酶标抗体制备条件温和，且避免了剧毒类原料的使用，制备过程更为安全和环保。

(2)本发明同时采用多抗和纳米抗体混搭作为酶标二抗的制备原料，针对不同定位抗原匹配不同尺寸的多聚酶标抗体，一方面充分利用多抗的敏感性，另一方面借助纳米抗体体积小优势，减小免疫组化二抗的体积，提高了其分子运动能力和穿透能力，提高了染色强度和灵敏度，提高二抗对于细胞核膜的穿透力。因此本发明所述组合物能对于核染区和非核染区域亦有显著的染色标记作用，克服了多聚酶标抗体对不同类型抗原检测时表现出参差不齐的问题，提高了产品的普适性。

(3)本发明提供的多聚酶组合物是以聚乙二醇连接聚乙烯亚胺的高分子化合物作骨架，使酶分子之间紧密连接，形成紧凑型的多聚酶组合物结构，极大的缩小了多聚酶的体积，提高了多聚酶标抗体的穿透性以及多聚酶的稳定性。

(4)使用亲水性聚乙二醇作为骨架成分，对多聚酶标抗体复合物起到亲水性修饰作用，使得制备的多聚酶标抗体复合物水溶性更加好，减少多聚酶聚集以及组织切片染色时由于疏水作用导致的染色背景。

说明书附图

图1免疫组化常用酶标二抗检测系统示意图；其中，图A为传统酶标抗体，图B为酶标链霉卵白素-生物素染色法(SABC法)，图C为Polymer-酶标二抗法。

图2本发明所述多聚酶标抗体结构示意图。

图3多聚酶标抗体组合物与多聚酶标纳米抗体免疫组化染色结果对比图；其中，图A为多聚酶标抗体组合物1a染色结果，图B为仅含多聚酶标纳米试剂的染色结果。

图4不同组成多聚酶标抗体组合物免疫组化染色结果对比图；其中，图A为多聚酶标抗体组合物2a染色结果，图B为仅含多聚酶标多抗试剂的染色结果。

图5不同骨架材料的多聚酶标抗体组合物免疫组化染色结果对比图；其中，图A为多聚酶标抗体组合物1a染色结果，图B多聚酶标抗体组合物2a染色结果。

图6不同骨架材料的多聚酶标抗体组合物免疫组化染色结果对比图；其中，图A为多聚酶标抗体组合物5的染色结果，图B为多聚酶标抗体组合物6的染色结果，图C为多聚酶标抗体组合物7的染色结果。

图7多聚酶标抗体组合物和市售产品Novolink RE7200-K免疫组化在不同组织样品的染色结果对比图片；其中，上图为本发明所述多聚酶标抗体组合物的染色结果，下图为市售产品的染色结果。

图8不同偶联剂制备的多聚酶标抗体组合物免疫组化染色结果对比图；其中，图A为多聚酶标抗体组合物1a染色结果，图B多聚酶标抗体组合物8染色结果。

具体实施方式

结合具体实施例对本发明作进一步解释。本实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域常规技术方法和仪器说明书内容进行操作。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购或自研获得的常规产品。

制备实施例1

多聚酶标抗体组合物的制备包括如下步骤：

1、多酶聚合物制备：

(1)称取辣根过氧化物酶10mg，加入2mL纯水，混匀使其充分溶解。然后称取10mg高碘酸钠加入加入上述反应液中，25℃避光反应1h。

(2)量取400μL乙二醇溶液加入反应液中，置于4℃避光反应1h。然后将反应液置于2mM的醋酸钠缓冲液(pH 4.1)中透析过夜。

(3)称取10mg骨架材料，加入透析结束后的活化酶溶液中，然后使用碳酸钠溶液调节反应液的pH值至9.5，将反应液置于25℃反应4h。

(4)称取2mg硼氢化钠，加入反应体系中，置于4℃反应1h终止反应。然后使用10mMPBS(pH 7.4)透析过夜，即可得到多酶聚合物，置于4℃待用。

2、多酶聚合物活化：

(1)称取1mg sulfo-SMCC，加入1mL纯水溶解。取500μL sulfo-SMCC溶液加入步骤1制备的酶聚合物溶液中，混匀后置于25℃反应1h。

(2)将活化后的多酶聚合物溶液过PD-10脱盐柱，即可得到马来酰亚胺基修饰的多酶聚合物。

3、标记抗体活化：

(1)取多抗IgG 150uL(抗体含量10mg/mL)，补充一定体积的100mM PBS(含5mMEDTA，pH 8.0)溶液，使抗体终浓度为3mg/mL。

(2)称取2-亚氨基硫烷盐酸盐0.1mg加入上述多抗反应液中，置于25℃反应1h。然后将反应后的溶液过PD-10脱盐柱后，即得巯基修饰的多抗IgG。

参照上述步骤，用纳米抗体替换多抗，制备巯基修饰的纳米抗体。

4、多酶聚合物标记抗体：

(1)取5mg马来酰亚胺基修饰的多酶聚合物与步骤3制备的巯基修饰多抗IgG混合均匀，置于25℃反应1h。反应液过Sephacryl S-200蛋白纯化柱纯化，平衡缓冲液用10mMPBS(pH7.4)，收集第一个主峰，即得第一多聚酶标抗体(多聚酶标多抗IgG)。

(2)取5mg马来酰亚胺基修饰的多酶聚合物与步骤3制备的巯基修饰的纳米抗体混合均匀，置于25℃反应1h。反应液过Sephacryl S-200蛋白纯化柱纯化，平衡缓冲液用10mMPBS(pH 7.4)，收集第一个主峰，即得第二多聚酶标抗体(多聚酶标纳米抗体)。

5、多酶聚合物标记抗体组合物：

(1)取适量的多聚酶标抗体IgG和多聚酶标纳米抗体，分别与PBS缓冲液(含1％BSA和0.05％Proclin300，pH7.4)配制为多聚酶标抗体固含量为1μg/ml液体，按需混合后在2-8℃保存备用。

其中，步骤1-5中骨架材料、多抗、纳米单抗的选择及其组合物的组成信息如表1所示。

表1多聚酶标多抗组合物组成信息

其中，mPEG2k-g-PEI2k(PEG分子量2k、PEI分子量2k)、mPEG10k-g-PEI1k(PEG分子量10k、PEI分子量1k)、mPEG15k-g-PEI30k(PEG分子量15k、PEI分子量30k)和mPEG10k-g-PEI25k(PEG分子量10k、PEI分子量25k)为多头型骨架，购自“碳水科技”公司。

PPE-104(PEG分子量5k,PEI分子量4k)和PPE-101(PEG分子量2k,PEI分子量4k)为直线型骨架，购自“Creative PEGWorks”公司。

BoltornTM H40购自Polymer Factory公司。

多抗和纳米抗体均为重庆艾生斯生物工程有限公司自研。

制备实施例2

按照组合物1a所述的制备方法制备组合物8，不同的是，采用聚合度为24的双氨聚乙二醇(NH

制备实施例3

手工免疫组化时的标准操作流程具体步骤如下：

(1)烤片：选取相应得石蜡包埋组织片，至于烤片机上，65℃烤片30min。

(2)脱蜡复水：将切片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯再浸泡10min；将切片置于无水乙醇中浸泡5min，更换无水乙醇再浸泡5min；将切片置于95％乙醇中浸泡5min；将切片置于85％乙醇中浸泡5min；将切片置于75％乙醇中浸泡5min；超纯水浸泡5min。

(3)抗原修复：向不锈钢锅内加入pH 9.0EDTA修复液，将上述切片浸泡其中，电磁炉水加热至沸腾，维持20min。关闭加热，将不锈钢锅转移至水槽中，流水冲洗，降至室温。

(4)封闭：使用PBS缓冲液冲洗切片，甩干PBS缓冲液。向组织上滴加0.1mL的内源性过氧化物酶封闭剂，室温孵育10min。然后使用PBS缓冲液冲洗切片。

(5)一抗孵育：甩干PBS缓冲液，向组织上滴加0.1mL相应的一抗抗体，确保一抗溶液覆盖整个组织，室温孵育1h。然后使用PBS缓冲液冲洗切片。

(6)一抗后孵育：甩干PBS缓冲液，向组织上滴加0.1mL相应得二抗A试剂，确保一抗后溶液覆盖整个组织，室温孵育15min。然后使用PBS缓冲液冲洗切片。

(7)二抗孵育：甩干PBS缓冲液，向组织上滴加0.1mL相应的二抗聚合物试剂，确保二抗溶液覆盖整个组织，室温孵育15min。然后使用PBS缓冲液冲洗切片。

(8)DAB显色：甩干PBS缓冲液，向组织上滴加0.1mLDAB显色液，确保DAB显色液覆盖整个组织，室温孵育5min。然后使用去离子水冲洗切片。

(9)衬染：甩干去离子水。向组织上滴加0.1mL染液，确保染液覆盖整个组织，室温孵育5min。然后使用去离子水冲洗切片。

(10)脱水、透明、封片：将切片置于75％乙醇中浸泡3min；将切片置于95％乙醇中浸泡3min；将切片置于无水乙醇中浸泡3min，更换无水乙醇再浸泡3min；将切片置于二甲苯中浸泡5min，更换二甲苯再浸泡5min。将切片从溶剂中取出，在组织上滴加中性树酯，盖上盖玻片，放置于通风橱中过夜风干。

(11)在显微镜下观察组织形态，判定染色结果。

效果验证例

为验证本发明所述多聚酶标抗体组合物的效果，根据二抗类型选择适宜的一抗、按照实施例3所述实验步骤对实施例1和实施例2所制备得到的多聚酶标抗体和组合物以及市售产品进行免疫组化测试和效果对比。

效果例1

采用实施例1制备的多聚酶标抗体组合物1a以及组合物1a对应的多聚酶标纳米抗体作为工作液、在固含量相同基础上进行比较。本试验中，采用经福尔马林固定及石蜡包埋的人肠癌组织，选取细胞质表达蛋白DOG1作为待测一抗指标。染色结果如图3所示，由于本发明所述多聚酶标抗体组合物中既包含多聚酶标抗体结构，又包含小体积的多聚酶标纳米抗体，染色均匀度和染色深度明显优于单独应用的多聚酶标纳米抗体，表明本发明所述多聚酶标抗体组合物对于部分组织样品染色效果更好，更具有普适性。

效果例2

为证明多聚酶标抗体组合物组成对组织样品染色的影响，采用实施例1所制备的多聚酶标抗体组合物2a、组合物2b、组合物2c以及组合物2a对应的多聚酶标抗体作为工作液，在固含量相同基础上进行比较。本试验中，采用经福尔马林固定及石蜡包埋的人肺鳞癌组织样本，选取细胞核表达蛋白P63作为待测一抗指标。染色结果如图4所示，由于细胞核密度较大，大分子物质难以进入，因此细胞核表达蛋白的染色效果随着多聚酶标抗体组合物中多聚酶标纳米抗体的含量减少而逐渐变弱，其中组合物2a染色效果最好(图4A)；当组合物中多聚酶标多抗与多聚酶标纳米抗体质量比大于15:1时，其染色效果与仅含多聚酶标多体的工作液染色效果(图4B)相当。基于染色有效性考量，多聚酶标抗体组合物中多聚酶标多抗与多聚酶标纳米抗体的质量比小于13:1，优选小于5:1。

效果例3

为证明骨架材料种类、分子量与结构对于实际应用效果的影响，采用实施例1所制备的多聚酶标抗体组合物1a、组合物2a、组合物3、组合物4和组合物6作为工作液、在固含量相同基础上进行比较。本试验中，采用经福尔马林固定及石蜡包埋的人肺鳞癌组织样本，选取细胞核表达蛋白P63作为待测一抗指标。通过组织样品的染色结果对比，根据染色效果从优到劣依次排序为：组合物1a、组合物2a、组合物6、组合物3以及组合物4。其中，组合物1a中多聚酶标抗体骨架的亲水性相对于组合物2a中多聚酶标抗体骨架的亲水性更高，背景染色有所降低、染色深度进一步增加(如图5所示)。组合物1a和组合物2a骨架中聚乙烯亚胺部分为多头型，可连接更多酶及二抗，因此染色效果好于含有骨架为直链型的多聚酶标抗体组合物6。组合物3仍能对组织样品进行染色、达到有效分辨作用，但组合物4中多聚酶标抗体骨架分子量过大且聚乙烯亚胺部分氨基偶联酶及二抗过多，导致染色效果减弱。

因此，本发明采用聚乙二醇连接聚乙烯亚胺高分子化合物作为多聚酶标抗体的骨架材料能有效降低背景染色、提升染色效果，采用多头型聚乙烯亚胺骨架材料可进一步提升染色效果，进一步综合染色效果及多聚酶标抗体的应用场景，应控制骨架分子量低于45000，优选低于35000。

效果例4

为进一步证明本发明所述骨架材料选择具有的有益效果，采用实施例1所制备的多聚酶标抗体组合物5、组合物6和组合物7作为工作液、在固含量相同基础上进行比较。本试验中，采用经福尔马林固定及石蜡包埋的人肺鳞癌组织样本，选取细胞核表达蛋白P63作为待测一抗指标。染色结果如图6所示，包含本发明所述骨架的多聚酶标抗体组合物的染色效果(图6A-图6B)显著优于组合物7(图6C)的染色效果，进一步证明了本发明所述骨架材料对于多聚酶标抗体组合物的组织染色效果有促进作用。

效果例5

为了评价所制备的多聚酶标抗体组合物在免疫组织化学实验中的特异性和灵敏度。我们采用了实施例1制得的多聚酶标抗体组合物1a进行实验，并以含抗兔IgG聚合HRP的市售产品聚合物试剂盒(Novolink RE7200-K，Cell IDx)作为对照样。本实验中，采用经福尔马林固定及石蜡包埋的组织样本，包括人扁桃体组织和人乳腺组织，选用CD5、CK8&18和P53作为待测一抗。如图7所示，在相同实验条件下，本发明制得的多聚酶标抗体组合物对CD5和CK8&18一抗的染色强度明显强于对照样，两者在P53一抗染色上具有相当效果。进一步表明本发明所述多聚酶标抗体组合物普适性好、且综合效果优于同类产品。

效果例6

从上述验证效果可知，通过本发明所述方法制备得到多聚酶标抗体组合物在染色和普适性方面具有预料不到的技术效果，且制备过程未采用剧毒偶联试剂。进一步采用组合物1a和组合物8作为工作液，评价偶联剂选择的效果。本试验中，采用经福尔马林固定及石蜡包埋的人组织样本，选取细胞核表达蛋白Ki-67作为待测一抗指标。染色结果如图8所示，在满足大分子空间位置需求基础上，sulfo-SMCC相对于双氨聚乙二醇分子链更短，所形成的多聚酶标抗体聚合物体积更小，染色效果更为突出。

通过上述实验和验证可知，本发明所述多聚酶标抗体组合物的制备方法所采用的条件温和，无有毒原料，生产更为安全；由特殊骨架制成的多聚酶标抗体亲水性更强和体积更小，染色效果更好；同时采用多聚酶标多抗与多聚酶标纳米抗体复配使用，提升了染色效果也提高了产品的普适性。

还需要说明的是，本发明中提及的示例性实施例，基于一系列的步骤或者装置描述一些方法或系统。但是，本发明不局限于上述步骤的顺序，也就是说，可以按照实施例中提及的顺序执行步骤，也可以不同于实施例中的顺序，或者若干步骤同时执行。

本发明中，针对一个实施方式描述和/或例示的特征，可以在一个或更多个其它实施方式中以相同方式或以类似方式使用，和/或与其他实施方式的特征相结合或代替其他实施方式的特征。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明实施例可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。