定量检测异烟肼的荧光免疫层析检测卡及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种定量检测异烟肼的荧光免疫层析检测卡及制备方法和应用。

背景技术

异烟肼(INH)是目前使用的重要抗结核药，用于各型各期肺结核和肺外各种结核病，是防治结核病的首选一线药，在预防结核病方面也起着至关重要的作用。但是，异烟肼的毒副作用也不可忽视，临床资料提示，异烟肼的应用可引起20％左右的患者出现肝功能改变，约1.6％的患者可发展为症状性肝炎，更有较少数患者可引起肝功能衰竭甚至死亡。异烟肼疗效和毒副作用的个体差异主要与患者血药浓度相关。目前，多个研究发现，不同患者使用标准剂量：5mg/kg的异烟肼时，血药浓度可能存在3-7倍差异。抗结核药物的低血药浓度给抗结核病的治疗带来的影响也不容忽视。众多研究指出，抗结核治疗失败或复发，以及耐药的发生与低血药浓度有关。不能保持有效药物浓度的治疗及低于规定的剂量或低于最低抑菌浓度(MIC)的药物浓度，实质上是诱导结核分枝杆菌对抗结核药物产生耐药的重要因素。异烟肼的血药浓度个体差异较大，与个体吸收差异、年龄、体重、性别、病理生理状态、以及其他合并症用药情况等因素有关。

因此，临床上制定了兼顾有效性和安全性的抗结核药物治疗浓度范围，并进行治疗时的药物浓度监测(Therapeutic Drug Monitoring，TDM)，以药物暴露为指导的个体化给药，可以减少药物不良反应的发生，并增加治疗成功的可能性，用于优化药品的功效和安全性。

目前，异烟肼的血药浓度监测方法，主要有光谱分析法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法。液相色谱-质谱联用技术和高效液相色谱技术也是从药物专属性上推荐采用的技术方法，虽然这两种方法均可对样本中的目标物质进行准确分离、含量测定，具有良好的特异度和敏感度，但是这两种方法对实验室的硬件设施要求较高，对检测人员的专业水平要求也较高，检测过程操作较复杂，仪器昂贵并需要定期进行校准维护，使用成本较高，因此对于临床推广有一定限制。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于定量检测异烟肼的荧光免疫层析检测卡及制备方法和应用，解决现有检测方法存在的检测过程复杂的问题，实现低成本、快速检测，易于临床推广。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种定量检测异烟肼的荧光免疫层析检测卡，所述荧光免疫层析检测卡包括底板以及在底板上依次搭接粘贴的样本垫、荧光微球垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述荧光微球垫上喷涂有荧光微球标记的异烟肼单克隆抗体；所述硝酸纤维素膜上的检测区包被有异烟肼-载体蛋白偶联物，质控区包被有羊抗鼠IgG。

优选地，所述异烟肼单克隆抗体由杂交瘤细胞株1H11(Hybridoma cellline1H11)分泌得到。所述杂交瘤细胞株1H11(Hybridoma cell line 1H11)，于2024年1月24日保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：C202427，保藏结果为存活；所述杂交瘤细胞株1H11是以异烟肼-钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联物作为免疫原制备获得。所述异烟肼-钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联物是由异烟肼与钥孔血蓝蛋白(KLH)通过偶联获得的偶联物。

优选地，所述异烟肼-载体蛋白偶联物是异烟肼与载体蛋白通过偶联得到的偶联物；所述载体蛋白为钥孔血蓝蛋白、牛血清白蛋白、鸡卵黄蛋白中的一种。

优选的，所述荧光微球的直径为100-300nm；所述荧光微球表面含有羧基基团。

本发明还提供了制备上述荧光免疫层析检测卡的方法，包括将样本垫、荧光微球垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接粘贴固定在底板上，所述样本垫在粘贴之前使用含蔗糖的牛血清白蛋白溶液进行处理，所述牛血清白蛋白溶液中，蔗糖的质量体积浓度为1-3％；所述荧光微球垫的制备方法包括：将所述荧光微球标记的异烟肼单克隆抗体喷涂至玻璃纤维素膜，干燥后得到荧光微球垫；所述硝酸纤维素膜的制备方法包括：在检测区包被异烟肼-载体蛋白偶联物，质控区包被羊抗鼠IgG，45-60℃干燥15-25h后，得到包被有异烟肼-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜。

优选的，所述荧光微球标记的异烟肼单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

1)将荧光微球悬液、MES缓冲液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺混合，进行活化处理，得到活化的荧光微球；

2)将步骤1)所述活化的荧光微球和异烟肼单克隆抗体混合，进行偶联，得到荧光微球标记的异烟肼单克隆抗体。

上述荧光免疫层析检测卡的检测方法，包括以下步骤：

将不同浓度的异烟肼纯品添加到空白人血清基质中制备校准品；所述校准品中异烟肼的浓度依次为20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml；将所述校准品稀释10-100倍后加样于所述荧光免疫层析检测卡，进行免疫层析，测定检测区T线和质控区C线的荧光强度比值T/C值，获得校准品中浓度与T/C值的函数关系。

取待测样本，加样于所述荧光免疫层析检测卡，进行免疫层析，测定检测区T线和质控区C线的荧光强度比值T/C值，并根据所述函数公式计算待测样本中异烟肼的含量。

本发明还提供了上述荧光免疫层析检测卡或上述制备方法制备的荧光免疫层析检测卡在检测样本中异烟肼含量中的应用。

本发明还提供了上述荧光免疫层析检测卡的检测方法在检测血清或血浆或全血中异烟肼含量中的应用。

本发明还提供了一种试剂盒，包括上述荧光免疫层析检测卡或上述制备方法制备的荧光免疫层析检测卡。

本发明提供了一种检测异烟肼的荧光免疫层析检测卡及制备方法、检测方法和应用。检测方法是基于时间分辨荧光免疫层析技术，采用竞争法免疫反应原理实现的。当荧光免疫层析检测卡中加入待测溶液后，待测溶液中的异烟肼药物小分子与包被在荧光微球垫上偶联了荧光微球的异烟肼单克隆抗体结合，形成荧光微球-抗体-抗原的复合物，在层析的作用下沿着硝酸纤维素膜层析至质控区(C)，被包被的羊抗鼠IgG捕获，形成复合物沉淀在质控区，而未与异烟肼药物结合的荧光微球-异烟肼单克隆抗体偶联物被检测区(T)包被的抗原捕获，形成复合物沉淀在检测区，其荧光强度与样本中的异烟肼含量成反比。在激发光源的作用下，荧光物质发射特定波长的荧光信号，荧光免疫层析分析仪俘获荧光信号，通过信号转化及设定的标准曲线自动转化为定量数值，计算出待测溶液中的异烟肼浓度。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明提供了一种定量检测异烟肼的荧光免疫层析检测卡及制备方法和应用。该制备方法以异烟肼-钥孔血蓝蛋白偶联物为免疫原，特异性强、免疫原性好；制备出的异烟肼单克隆抗体效价高、竞争效果强，产生该抗体的杂交瘤细胞株编号为1H11，所述杂交瘤细胞株1H11，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202427。此外，本发明的荧光免疫层析检测卡用于测定样本中的异烟肼血药浓度，操作简单，结果立等可取，有效期长达18个月，无需昂贵仪器，维护成本低，适合大规模临床推广应用。

附图说明

图1为本发明实施例1中以异烟肼-KLH和异烟肼-BSA为免疫原制备的异烟肼单克隆抗体效价比较分析图。

图2为本发明实施例1中杂交瘤细胞株1H11分泌得到的异烟肼单克隆抗体的灵敏度(IC50)测试分析图。

图3为本发明实施例1中杂交瘤细胞株4F3分泌得到的异烟肼单克隆抗体的灵敏度(IC50)测试分析图。

图4为本发明中实施例4中定量检测异烟肼的荧光免疫层析检测卡测定结果的相关性分析图。

具体实施方式

本发明提供了一种定量检测异烟肼的荧光免疫层析检测卡，所述荧光免疫层析检测卡包括底板以及在底板上依次搭接粘贴的样本垫、荧光微球垫、包被有异烟肼-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜和吸水垫；所述荧光微球垫喷涂有荧光微球标记的异烟肼单克隆抗体。

本发明中，所述荧光免疫层析检测卡优选按照以下方法进行组装：将样本垫、荧光微球垫、包被有异烟肼-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜和吸水垫从左至右依次搭接粘贴固定在底板上，样本垫的末端与荧光微球垫始端相连，荧光微球垫的末端与包被有异烟肼-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜的始端相连，包被有异烟肼-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜的末端与吸水垫的始端相连，样本垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐，然后用切条机斩切成合适宽度试纸条，将试纸条装在特制的塑料卡壳中，组装成荧光免疫层析检测卡；所述试纸条的宽度优选为3.9-4.1mm，更优选为4.0mm。

本发明中，所述样本垫优选的采用以下方法处理，步骤如下：将样本垫置于含蔗糖的牛血清白蛋白溶液中，进行浸泡，干燥后得到样本垫。所述含蔗糖的牛血清白蛋白溶液中蔗糖的含量优选为1-3％(W/V)，更优选为2％(W/V)；所述含蔗糖的牛血清白蛋白溶液的溶剂优选为磷酸盐缓冲液；所述磷酸盐缓冲液的浓度优选为0.01-0.05mol/L，更优选为0.02mol/L；所述磷酸盐缓冲液的PH值优选为7.1-7.5，更优选为7.2；浸泡的时间优选为1.5-2.5h，更优选为2h；浸泡的温度优选为15-25℃，更优选为20℃；干燥的温度优选为45-55℃，更优选为50℃；干燥的时间优选为5-8h，更优选为6h；干燥的方式优选为鼓风干燥烘干。

本发明中，所述荧光微球垫喷涂有荧光微球标记的异烟肼单克隆抗体；所述荧光微球垫优选的采用以下方法制备获得：将所述荧光微球标记的异烟肼单克隆抗体上样至捷宁喷金滑膜仪，选择喷金模式喷涂至玻璃纤维素膜，干燥后得到荧光微球垫；所述荧光微球标记的异烟肼单克隆抗体的喷涂量优选为2.0-6.0μl/cm，最优选为4μl/cm；所述荧光微球标记的异烟肼单克隆抗体的加样设备优选为捷宁喷金划膜仪(型号：XYZ3020)；干燥的时间优选为18-24h，更优选为20h；干燥的温度优选为40-50℃，更优选为45℃。

本发明中，所述荧光微球标记的异烟肼单克隆抗体优选的采用以下方法制备获得：

1)将荧光微球悬液、MES缓冲液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺混合，进行活化处理，得到活化的荧光微球；

2)将步骤1)所述活化的荧光微球和异烟肼单克隆抗体混合，进行偶联，得到荧光微球标记的异烟肼单克隆抗体。

上述步骤1)中，荧光微球的直径优选为100-300nm，最优选为200nm；优选的，所述荧光微球表面含有羧基基团；所述荧光微球优选为聚苯乙烯包裹稀土离子Eu

上述步骤1)中，在得到活化的荧光微球后，还包括对活化的荧光微球进行离心，取沉淀进行重悬；离心的转速优选为12000-16000rpm，更优选为15000rpm；离心的温度优选为10-20℃，更优选为15℃；离心的时间优选为10-20min，更优选为15min；重悬沉淀的溶剂优选为MES缓冲液，体积为1000μL。

上述步骤2)中，所述活化的荧光微球和异烟肼单克隆抗体的体积质量比优选为800-1200μL∶40-60μg，更优选为1000μL∶50μg；偶联的时间优选为100-150min，更优选为120min；偶联的温度优选为18-26℃，更优选为20℃；偶联优选的在震荡条件下进行。

上述步骤2)中，在得到荧光微球标记的异烟肼单克隆抗体后，优选的还包括将荧光微球标记的异烟肼单克隆抗体和牛血清白蛋白水溶液混合，进行封闭处理，得到封闭后的荧光微球标记的异烟肼单克隆抗体；所述荧光微球标记的异烟肼单克隆抗体与牛血清白蛋白水溶液的体积比优选为1-3∶0.5-1.5，更优选为2∶1；所述牛血清白蛋白水溶液中牛血清白蛋白的质量百分含量优选为2-4％，更优选为3％；封闭的温度优选为26-37℃，更优选为30℃；封闭的时间优选为1.5-3h，更优选为2h。

本发明中，所述封闭后的荧光微球标记的异烟肼单克隆抗体的贮存方法，包括以下步骤：将封闭后的荧光微球标记的异烟肼单克隆抗体离心，将沉淀重悬，洗涤，保存。其中，离心的转速优选为12000-16000rpm，更优选为15000rpm，离心的温度优选为10-20℃，更优选为15℃，离心的时间优选为10-20min，更优选为15min；重悬沉淀的溶剂优选为贮存缓冲液，贮存缓冲液优选为含有Proclin300和牛血清白蛋白的Tris缓冲液，Tris缓冲液中Proclin300的质量百分含量优选为0.05％-0.1％，Tris缓冲液中牛血清白蛋白的质量百分含量优选为0.5％-1％，Tris缓冲液的pH值优选为7.1-7.3，更优选为7.2；洗涤沉淀的次数优选为1-2次，洗涤沉淀的方法为再次离心，重悬沉淀；保存的温度优选为2-8℃，更优选为4℃；保存优选为避光保存。

本发明中，所述异烟肼单克隆抗体优选的是以异烟肼-钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联物作为免疫原制备获得；异烟肼-钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联物是将异烟肼与钥孔血蓝蛋白(KLH)进行偶联得到的偶联物；所述异烟肼-钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联物制备过程：称取购自默克生物生产的异烟肼纯品(货号：I104690)40mg，溶解于2mL的DMF中，形成20mg/mL的终浓度。然后取90μL浓度为20mg/mL的异烟肼，与8μL的浓度为100mg/mL的EDC混合，再加入12μL浓度为50mg/mL的NHS，均匀混合后在室温搅拌条件下反应15-60min。反应结束后，将上述反应混合液1600r/min离心弃上清液，添加1mL的浓度为3mg/mL的钥孔血蓝蛋白(KLH)溶液并混匀，在室温搅拌条件下反应1-5h后，用磷酸缓冲液透析4次，12h换1次液。收集透析液，用美国伯乐(BIO-RAD)公司的Quick Start Bradford ProteinAssay Kit测定抗原的浓度，偶联好的完全抗原进行紫外扫描鉴定。所述异烟肼单克隆抗体采用以下方法制备获得：a)利用异烟肼-钥孔血蓝蛋白偶联物作为免疫原免疫Balb/c小鼠，加强免疫后得到能产生特异性抗体的Balb/c小鼠脾细胞；b)将步骤a)所述能产生特异性抗体的Balb/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP20融合，测定细胞上清液，筛选阳性孔；c)对步骤b)所述阳性孔中的融合细胞进行克隆化，得到产单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并编号为1H11，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202427；d)在Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油后，腹腔注射步骤c)所述杂交瘤细胞1H11，采集腹水，纯化腹水，得到纯度在90％以上的异烟肼单克隆抗体。

上述Balb/c小鼠的周龄优选为7-9周龄，更优选为8周龄；本发明对灭菌石蜡油的注入量没有特殊限制，本领域常规剂量即可；在Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油与腹腔注射杂交瘤细胞之间的时间间隔优选为7-14d，更优选为10-12d；腹腔注射杂交瘤细胞与采集腹水之间的时间间隔优选为7-10d，更优选为8-9d；纯化腹水的方法优选为亲和层析法。

在本发明中，所述包被有异烟肼-载体蛋白偶联物的硝酸纤维素膜优选的包括检测区(T)和质控区(C)；所述检测区优选的包被有异烟肼-牛血清白蛋白偶联物，异烟肼-牛血清白蛋白偶联物购自南京拂晓生物科技有限公司(货号：A163104L)；所述质控区优选的包被有羊抗鼠IgG。上述包被有异烟肼-载体蛋白偶联物的硝酸纤维素膜优选的采用以下方法制备获得：在检测区包被异烟肼-牛血清白蛋白偶联物，质控区包被羊抗鼠IgG，干燥后，得到包被有异烟肼-牛血清白蛋白偶联物和羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜；干燥的温度优选为45-60℃，更优选为50℃；干燥的时间优选为15-25h，更优选为20h。

本发明中，所述检测区包被异烟肼-牛血清白蛋白偶联物优选的采用以下方法进行：将异烟肼-牛血清白蛋白偶联物喷涂到硝酸纤维素膜上的检测区域，制成检测区。本发明中，喷涂使用的所述异烟肼-牛血清白蛋白偶联物的浓度优选为250-500μg/mL，更优选为400μg/mL，喷涂量优选为0.75-1.5μL/cm，更优选为1.0μL/cm；喷涂的设备优选为捷宁喷金划膜仪(型号：XYZ3020)。

本发明中，在将异烟肼-牛血清白蛋白偶联物喷涂到硝酸纤维素膜上的检测区域前，优选的包括对异烟肼-牛血清白蛋白偶联物进行稀释处理；所述稀释溶液优选为磷酸缓冲液；所述磷酸缓冲液的浓度优选为0.005-0.02mol/L，更优选为0.01mol/L；所述磷酸缓冲液的pH值优选为7.0-7.5，更优选为7.2。

本发明中，所述质控区包被羊抗鼠IgG优选的采用以下方法进行：将羊抗鼠IgG喷涂到硝酸纤维素膜上的质控区域，制成质控区。喷涂使用的所述羊抗鼠IgG的浓度优选为150-250μg/mL，更优选为200μg/mL，喷涂量优选为0.8-1.2μL/cm，更优选为1.0μL/cm；喷涂的设备优选为捷宁喷金划膜仪(型号：XYZ3020)。

本发明中，在将羊抗鼠IgG喷涂到硝酸纤维素膜上的质控区域前，优选的包括对羊抗鼠IgG进行稀释处理；所述稀释溶液优选为磷酸缓冲液；所述磷酸缓冲液的浓度优选为0.005-0.02mol/L，更优选为0.01mol/L；所述磷酸缓冲液的pH值优选为7.0-7.5，更优选为7.2。

本发明中，上述荧光免疫层析检测卡在检测异烟肼中的方法，步骤如下：

将不同浓度的异烟肼纯品添加到不含异烟肼的人血清基质中制备校准品；所述校准品中异烟肼的浓度依次为20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml；将所述校准品稀释10～100倍后加样于所述荧光免疫层析检测卡，进行免疫层析，测定检测区T线和质控区C线的荧光强度比值T/C值，获得校准品中浓度与T/C值的函数关系。

取待测样本，加样于所述荧光免疫层析检测卡进行免疫层析，测定检测区T线和质控区C线的荧光强度比值T/C值，根据上述获得得函数公式计算待测样本中异烟肼的含量。

下面结合附图和实施例1-4对本发明提供的一种定量检测异烟肼的荧光免疫层析检测卡及制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1、一种定量检测异烟肼的荧光免疫层析检测卡及其制备方法

本实施例的定量检测异烟肼的荧光免疫层析检测卡包括底板及在底板上依次搭接粘贴的样本垫、荧光微球垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，硝酸纤维素膜上设置有检测区和质控区；荧光微球垫喷涂有荧光微球标记的异烟肼单克隆抗体；硝酸纤维素膜上的检测区包被有异烟肼-牛血清白蛋白偶联物，质控区包被有羊抗鼠IgG。

上述荧光免疫层析检测卡的制备方法包括以下步骤：

(1)异烟肼单克隆抗体的制备

异烟肼-钥孔血蓝蛋白偶联物(异烟肼-KLH)制备过程：称取购自默克生物生产的异烟肼纯品(货号：I104690)40mg，溶解于2mL的DMF中，形成20mg/mL的终浓度，然后取90μL浓度为20mg/mL的异烟肼，与8μL的浓度为100mg/mL的EDC混合，再加入12μL浓度为50mg/mL的NHS，均匀混合后在室温搅拌条件下反应15-60min。反应结束后，将上述反应混合液1600r/min离心弃上清，添加1mL浓度为3mg/mL的钥孔血蓝蛋白(KLH)溶液并混匀，在室温搅拌条件下反应1-5h后，用磷酸缓冲液透析4次，12h换1次液。收集透析液，用美国伯乐(BIO-RAD)公司的Quick Start Bradford ProteinAssay Kit测定抗原的浓度，偶联好的完全抗原进行紫外扫描鉴定。

异烟肼单克隆抗体制备过程：将异烟肼-钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联物作为免疫原，用10mM磷酸盐缓冲液稀释成0.2mg/ml，取500μl稀释后的免疫原与等体积的弗氏完全佐剂混合后，乳化完全，采用常规方法免疫Balb/c小鼠，4次免疫后的小鼠腹腔注射免疫原约100μg进行加强免疫，3d后取产生特异性抗体的Balb/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP20融合。采用间接竞争酶联免疫分析方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到并建立产生异烟肼单克隆抗体的杂交瘤细胞株。产生异烟肼单克隆抗体的杂交瘤细胞株的命名为杂交瘤细胞株1H11，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：C202427。

将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油，7-14天后腹腔注射杂交瘤细胞，7-10天后采集腹水。经亲和层析法进行腹水纯化，纯度经SDS-PAGE电泳鉴定为90％以上，-20℃保存。

将该方法制备的异烟肼单克隆抗体与通过异烟肼-牛血清白蛋白偶联物(异烟肼-BSA)制备得到的异烟肼单克隆抗体进行抗体效价对比验证实验和抗体灵敏度对比验证实验，由结果可知，本发明方法以异烟肼-钥孔血蓝蛋白偶联物为免疫原，特异性强、免疫原性好；制备出的异烟肼单克隆抗体效价高、竞争效果强。

以异烟肼-牛血清白蛋白偶联物制备异烟肼单克隆抗体的方法为：将以异烟肼-钥孔血蓝蛋白偶联物制备异烟肼单克隆抗体的步骤中的钥孔血蓝蛋白替换为牛血清白蛋白即可。以异烟肼-牛血清白蛋白偶联物作为免疫原制备得到的产生异烟肼单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株4F3。

①抗体效价对比验证实验：

将异烟肼-KLH和异烟肼-BSA分别免疫小鼠后制得的单克隆抗体用酶联免疫方法(ELISA)进行效价测定，相同抗体浓度下，测得OD值越高，代表抗体效价越高。结果如表1和图1所示，用异烟肼-KLH完全抗原免疫小鼠制得的单克隆抗体的效价明显高于用异烟肼-BSA制得的单克隆抗体的效价。

表1：1H11株和4F3株抗体效价结果对比

②抗体灵敏度对比验证实验(IC50)

通过间接竞争酶联免疫实验(ICELISA)测试抗体的半数抑制率(IC50)，ICELISA实验中，不含异烟肼标准品对照孔的OD值为B0，添加了异烟肼标准品孔的OD值为B，计算结合率B/B0，在结合率为50％时，所对应的异烟肼标准品的浓度即为IC50。IC50的数值越小，说明抗体的灵敏度越高、特异性越强。结果如表2和图2、图3所示，用异烟肼-KLH完全抗原免疫小鼠制得的单抗测得IC50为326.2ng/ml，异烟肼-BSA完全抗原免疫小鼠制得的单抗测得IC50为3210.8ng/ml，因此，前者制得单抗灵敏度明显高于后者10倍。

表2：1H11株和4F3株抗体灵敏度(IC50)结果对比

(2)荧光微球标记的异烟肼单克隆抗体的制备

①活化：取购自江苏为度生物技术有限公司的内部包埋荧光染料、表面修饰有羧基官能团的微球悬液50μL混悬于1000μL活化缓冲液中(50mM MES pH6.0)，加入0.035mgEDC和0.35mg NHS，混匀后于26℃下震荡活化15min得到混悬液I；

②偶联：将步骤①活化后的混悬液I于15℃条件下，15000r/min离心15min后弃上清，重悬于1000μL活化缓冲液中，加入50μg异烟肼单克隆抗体，混匀后于20℃下震荡偶联120min得到混悬液II；

③封闭：将步骤②得到的混悬液II加入3％的牛血清白蛋白溶液500μL，混匀后于30℃下震荡封闭120min得到混悬液III；

④贮存：将步骤③中混悬液III于15℃条件下，15000r/min离心15min后弃上清，重悬于贮存缓冲液中(贮存缓冲液为含0.07％Proclin300、质量百分比为0.8％的牛血清白蛋白的pH7.2的Tris缓冲液)，以贮存缓冲液洗涤微球2次，最后重悬于500μL贮存缓冲液中，混匀后于4℃避光保存。

(3)荧光微球垫的制备

将贮存的荧光微球标记的异烟肼单克隆抗体以贮存缓冲液稀释为50μg/mL，用喷金划膜仪喷金，喷涂量为4.0μl/cm，45℃干燥20h，取出密封保存。

(4)包被有抗体的硝酸纤维素(NC)膜的制备

用0.01mol/L，pH7.2的磷酸缓冲液将异烟肼-牛血清白蛋白偶联物稀释到400μg/mL，用喷金划膜仪将其喷涂于NC膜上的检测区(T)，喷膜量为1.0μL/cm；用0.01mol/L、pH7.2的磷酸缓冲液将羊抗鼠IgG稀释到200μg/mL，用喷金划膜仪将其喷涂于NC膜上的质控区(C)，喷膜量为1.0μL/cm；50℃干燥20h，备用。

(5)样本垫的制备

将样本垫用含2％蔗糖，体积分数为0.5％的牛血清白蛋白，pH 7.2，0.02mol/L的磷酸盐缓冲液浸泡2h，50℃下烘干6h，备用。

(6)检测卡的组装

将样本垫、荧光微球垫、硝酸纤维素膜、吸水垫从左至右依次搭接粘贴固定在底板上，样本垫的末端与荧光微球垫始段相连，荧光微球垫的末端与硝酸纤维素膜的始端相连，硝酸纤维素膜的末端与吸水垫的始端相连，样本垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐，然后用切条机斩切成4.0mm宽的试纸条，装在特制的塑料制卡中，组装成荧光免疫层析检测卡。塑料制卡上设置有加样孔和检测视窗。

实施例2、一种定量检测异烟肼的荧光免疫层析检测卡的检测方法

(1)样本前处理

准确吸取新鲜恢复至室温的20μl样本加入到180μL样本稀释液中，充分混匀。

(2)用荧光免疫层析检测卡检测

用微量移液器准确吸取90μL经样本前处理后的待检样品溶液于实施例1中制备得到的荧光免疫层析检测卡加样孔中，室温条件下反应15min；将反应完成的检测卡插入到艾格立特(武汉)科技有限公司生产的荧光检测仪(型号：IGreat-IF-F10)卡槽中，通过触摸显示屏选择待检项目，按下“快速检测”按键，荧光检测仪在在激发/发射波段365/610nm条件下，将自动对荧光免疫层析检测卡进行扫描测试。

(3)检测结果分析

测试完成后，荧光检测仪获得荧光免疫层析检测卡检测区荧光强度和质控区荧光强度的比值，根据以下公式计算待测样本中的异烟肼含量：

Y＝D+(A－D)/[1+(X/C)^B]；

其中，A＝0.282190，B＝-1.745659，C＝1.720567，D＝2.035401；

Y为荧光免疫层析检测卡上检测区荧光强度与质控区荧光强度的比值；X为样本中异烟肼的浓度。

实施例3、荧光免疫层析检测卡的抗干扰实验

将干扰物质添加至异烟肼待测样本中，通过实施例1制备得到的荧光免疫层析检测卡测试干扰物质添加前后的样本数值，评价常规临床干扰物质是否对测定结果有显著影响，实验结果见表3。干扰物质为甘油三脂、胆红素和血红蛋白的混合物，在待测样本中的浓度分别为10mg/ml、1mg/ml和10mg/ml。

表3：干扰物质对测定结果的影响

由表3可知，添加干扰物质前后各样本的检测结果偏差均在±10％范围内，属于可接受范围。

实施例4、荧光免疫层析检测卡的测定结果相关性分析

将上述实施例1中制备得到的荧光免疫层析检测卡与高效液相色谱法测定人血清中异烟肼方法进行比较，其中人血清为临床血清样本。高效液相色谱法按照如下方案：采用安捷伦公司1260InfinityII型高效液相色谱仪，C18柱(150mm×4.6mm，5μm)，流动相：pH4.2的25mmol/L磷酸二氢钾缓冲液-乙腈(85∶15)；检测波长：240nm；流速：1mL/min；400μl血清样本加入50μl的10％的硫酸锌沉淀蛋白，离心5000r/min后取20μl进样，测定异烟肼峰高。结果见表4。相关性曲线见图4，可见二者拟合良好。

表4：本发明中异烟肼荧光免疫层析检测卡与高效液相色谱法测定人血清中异烟肼方法比较

由表4和图4所示，两种不同方法检测异烟肼用药患者的血清样本，相关性较好R

由以上实施例可知，本发明提供了一种定量检测异烟肼的荧光免疫层析检测卡，该检测卡抗干扰能力强，具有检测准确度高、特异性强的优点。