使基因组DNA产生大规模缺失的方法及基因组DNA的分析方法

技术领域

本发明涉及使基因组DNA产生大规模缺失的方法及基因组DNA的分析方法。

背景技术

在高等生物中，基因组序列的仅1-2％被用于编码蛋白质，与此相对，在哺乳类中，大规模且基因间序列被分配用于近端(启动子)或长距离(增强子、抑制子、绝缘子等)的调节元件。因此，在用于创制功能性人工细胞而进行基因组的设计时，除了基因的选择以外，基因间区的设计成为关键。DNA元件百科全书(Encyclopedia of DNA Elements，ENCODE)项目中暗示了，在人培养细胞中，基因间区的大部分显示特定的转录因子结合、组蛋白修饰，暗示了有可能成为合理的基因间区设计的指南。但是，不清楚这些转录及表观遗传活性是否均是正常细胞功能所必需的。哺乳类的细胞网络由于基因家族的扩大和基因控制网络的冗长性增大而在进化方面更为牢固。因此，不仅是非必需基因，而且基因间区的大部分可能并不一定是细胞的生存和维持所必需的(非专利文献1～3)。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Xavier,J.C.,Patil,K.R.&Rocha,I.,Microbiol Mol Biol Rev,78,487-509(2014).

非专利文献2：Posfai,G.,Science,312,1044-1046(2006).

非专利文献3：Hutchison,C.A.et al.,Science,351,aad6253-aad6253(2016).

发明内容

本发明提供使基因组DNA产生缺失的方法及基因组DNA的分析方法。

本发明人开发了使用能够序列特异性地切割靶序列的序列特异性核酸切割分子在2个靶序列间诱导DNA区域的缺失的方法。本发明人还发现，当基因组DNA中缺失的DNA区域扩大时，如果使细胞的生存和/或增殖所必需的基因产生缺失，则细胞的生存和/或增殖会受到负影响。由此，本发明人发现了细胞的生存和/或增殖所必需的基因的位置及指定该基因的方法。本发明人还发现了下述方法：通过将细胞的生存和/或增殖所必需的基因以可异位表达方式插入到基因组DNA中，从而制作虽然具有DNA区域的缺失、但可生存和/或增殖的细胞。另外，本发明人发现了使插入有负选择用标记基因的DNA区域缺失的方法。本发明基于这些发现。

根据本发明，可提供以下发明。

(1)一种体外方法，其包括下述步骤：

(a)准备含有经单离的细胞的细胞群；

(b)使能够序列特异性地切割基因组DNA上的两个部位的靶序列的序列特异性核酸切割分子分别作用于上述细胞群中的上述细胞的基因组DNA，在基因组DNA上的两个部位的靶序列中分别产生切割，由此，使细胞群中的至少一部分细胞中在上述两个部位的切割位点之间的区域中产生DNA区域的缺失；和

(c)然后，培养所得到的细胞群，确定上述DNA区域的缺失对细胞的增殖或生存的影响。

(2)根据上述(1)所述的方法，其中，在上述(c)中，上述确定如下进行：确定DNA区域的缺失效率或其推定值；对之后的培养后的细胞群中的具有DNA区域的缺失的细胞的比例与所确定的缺失效率或其推定值进行比较。

(3)根据上述(2)所述的方法，其中，在上述(c)中，缺失效率或其推定值的确定及培养后的具有DNA区域的缺失的细胞的比例分别以含有细胞群的悬浮液中所含的具有缺失的细胞相对于全部细胞的比例来确定。

(4)根据上述(3)所述的方法，其中，上述比例通过悬浮液中所含的、具有缺失的基因组DNA及不具有缺失的基因组DNA的计数技术来确定。

(5)根据上述(1)～(4)中任一项所述的方法，其中，还包括下述步骤：

(d)基于与作为对照的细胞群相比上述(c)中的对细胞的生存和/或增殖的影响的有无或大小来确定与对照的基因组DNA相比缺失了的DNA区域是否含有控制细胞的生存和/或增殖的基因。

(6)根据上述(5)所述的方法，其中，作为对照的细胞群为含有通过上述(b)而具有更大的DNA区域、更小的DNA区域或不同的DNA区域的缺失的细胞的细胞群。

(7)根据上述(5)或(6)所述的方法，其中，还包括下述步骤：从与对照的基因组DNA相比缺失了的DNA区域中存在的基因中，指定至少1个控制细胞的生存和/或增殖的基因。

(8)根据上述()～(7)中任一项所述的方法，其中，还包括下述步骤：

(f)从缺失了的DNA区域中存在的基因中，指定至少1个控制细胞的生存和/或增殖的基因。

(9)根据上述(7)或(8)所述的方法，其中，还包括下述步骤：

(g)将至少1个可操作地连接于控制序列的控制细胞的生存和/或增殖的基因异位性地导入到具有该DNA区域的缺失的基因组DNA中。

(10)根据上述(1)～(9)中任一项所述的方法，其中，上述(b)中缺失的DNA区域的尺寸为0.5Mbp以上。

(11)根据上述(1)～(10)中任一项所述的方法，其中，上述(b)中缺失的DNA区域的尺寸为1Mbp以上。

(12)一种体外方法，其包括下述步骤：

(α)准备含有经单离的细胞的细胞群，在此，经单离的细胞在要缺失的区域中含有负选择用标记基因；

(β)使能够序列特异性地切割基因组DNA上的两个部位的靶序列的序列特异性核酸切割分子分别作用于上述细胞群中的上述细胞的基因组DNA，在基因组DNA上的两个部位的靶序列中分别产生切割，由此，使细胞群中的至少一部分细胞中在上述两个部位的切割位点之间的区域中产生DNA区域的缺失，在此，上述两个部位设计在夹着上述负选择用标记基因的位置；和

(γ)选择不具有负选择标记基因的细胞。

(13)根据上述(12)所述的方法，其中，上述负选择标记基因是外源性插入到要缺失的区域中的基因。

(14)根据上述(12)所述的方法，其中，上述负选择标记基因是基因组DNA中的内源性基因。

(15)根据上述(1)～(14)中任一项所述的方法，其中，细胞为真核细胞。

(16)根据上述(1)～(11)中任一项所述的方法，其中，步骤(c)不经过从步骤(b)中得到的细胞群中筛选一部分细胞的步骤而实施。

附图说明

图1示出伴有含有HPRT1基因的DNA区域的缺损的人细胞的制作方法。图片a表示使用负选择用标记基因的DNA区域的缺失简图。含有负选择用标记基因的DNA区域缺失时，细胞更易于生存。因此，通过以负选择用标记基因的表达为指标来筛选细胞，能够获得具有DNA区域的缺失的细胞。图片a中，示出使用CRISPR-Cas9系统作为序列特异性核酸切割分子的例子。对于细胞，转染表达针对以夹着负选择用标记基因的方式配置的两个部位的靶序列的gRNA和Cas9核酸内切酶的质粒。2天后，获取一部分细胞，通过数字PCR法进行基因组的缺失区域的连接PCR。用选择培养基培养细胞至形成集落为止。由此，具有负选择用标记基因的细胞、即未产生缺失的细胞死亡，仅具有缺失的细胞生存、增殖并形成集落。对集落数进行计数，再次通过数字PCR法进行连接PCR，确认缺失的存在。图片b为使X染色体上的内源性HPRT1基因座附近缺失，然后通过数字PCR法对连接区域进行PCR的结果。数字PCR中，将100个基因组作为1次PCR的模板，进行48次PCR。14例中得到了扩增产物，因此缺失效率为14/48/100×100＝约0.3(％)。图片c示出利用6-硫鸟嘌呤(6-TG)进行选择后形成的集落及其数量。图片d示出基于L1-R1的缺失区域的前后序列的测序。可知大体上2个靶序列间的DNA区域产生了缺失。

图2示出HPRT1基因附近的基因组区域的图谱和该区域的超大规模缺失的制作。图片a示出X染色体的HPRT1基因附近的Refseq基因。用圆形示出利用OGEE数据库推定的用于细胞增殖的必需基因。图片b和c示出使朝向着丝粒方向及端粒方向的缺失区域显著的实验结果。序列特异性核酸切割分子的靶序列用带有符号L1～L5及R1～R5的垂直虚线示出。示出各个诱发了DNA区域的缺失的细胞群的6-TG选择后的集落形成数和缺失效率(％)。

图3示出具有基于L4-R4的缺失的克隆的基因组分析结果。图片a为明确HAP1细胞(WT)和具有基于L4-R4的缺失的克隆分别具有的基因的存在的PCR结果。图片b示出具有基于L4-R4的缺失的克隆的相对增殖能力。相对增殖能力以具有缺失的细胞相对于野生型细胞的比例来求出，在缺失后第0天及第16天测定，显示出该比例没有变化。图片c示出具有基于L4-R4的缺失的克隆的基因表达的微阵列分析结果。

图4示出包括必需基因的超大规模缺失和缺失的挽救实验。图片a示出使用含有夹着必需基因的上游及下游3kb的序列的pHY262载体向GAPDH基因座的3’非翻译区(UTR)插入基因的简图。图片b示出通过实时PCR分析经过挽救的RBMX2及MMGT1基因的表达而得的结果。图片c及d分别示出内源性的RBMX2及MMGT1基因缺损株和RBMX2及MMGT1挽救株的集落形成数及缺失效率。

图5示出通过超大规模缺失而使含有必需基因的区域的缺失的结果。图片a和c分别示出含有RBMX2及MMGT1基因的区域产生了缺失、但是在GAPDH基因座下游重新导入了各基因、进而使缺失区域扩大的实验结果。图片b示出图片a实验后的相对集落尺寸的测定结果。p值由3次独立的实验结果求出。

图6示出在HCT116细胞中的使用负选择用标记基因的超大规模缺失的制作。图片a示出使用具有胸苷激酶(TK)表达组件的pHYT271载体在HCT116细胞的OCRL基因的下游插入TK的简图。由于连接PCR使扩增产物的尺寸变大，因此确认到插入。图片b示出HCT116细胞中的产生缺失的基因座的基因图谱。图片c示出使用负选择用标记基因TK的超大规模DNA区域的缺失的情形。缺失朝向着丝粒方向扩大。示出针对各缺失的筛选后的集落形成数及缺失效率。数值示出3次独立实验的平均及标准偏差。

图7示出不经负选择而产生超大规模缺失的方法。HAP1细胞中缺失了靶区域A～C这3种靶区域。在诱发基因组缺失的2天后和17天后，对于每孔100基因组，通过数字PCR法判定有无缺失，求出细胞群中的具有缺失的细胞的比例。其结果是，使靶区域B及C缺失时，细胞群中的具有缺失的细胞的比例下降。该下降表明所缺失的区域中含有细胞的生存和/或增殖所必需的基因。

图8示出对于人X染色体上被认为并非细胞的生存所必需的区域，通过本发明的方法分别使图中所示的区域缺失并调查各缺失对细胞的生存率的影响的实验结果。

具体实施方式

本说明书中，“细胞”是指：至少具有基因组DNA和细胞质、以及包裹这些的膜结构的生命的基本单位。作为细胞，没有特别限定，可列举原核生物的细胞和真核生物的细胞。基因组DNA含有该细胞的内源性的DNA，但并不一定仅由该细胞的内源性因子构成。

细胞含有细胞的基因组DNA，但有时还含有外源性侵入者(例如病原体)的基因组DNA。本说明书中，将细胞自身的基因组DNA称为“宿主基因组DNA”。侵入者的基因组DNA可以以与宿主的基因组DNA独立的方式存在于细胞内，有时也整合于宿主的基因组DNA。宿主基因组DNA有时含有外源性因子(例如病毒等的基因组DNA的全部或一部分的插入)。

本说明书中，“细胞群”是指含有多个细胞的组合物。

本说明书中，“单离”是指：将目标细胞与至少1种其它构成要素分离。单离例如可如下实施：将自然存在状态的细胞与在自然存在状态下一起存在的其它构成要素分离，并取出。单离例如可通过从多细胞生物中将一部分细胞分离并取出而实施。本说明书中，将对经单离的细胞进行操作的技术称为体外的技术。

本说明书中，“纯化”是指：将经单离的目标细胞与一起存在的其它构成要素进一步分离。纯化例如可以通过将目标细胞基于形态、表面标记物与其它构成要素分离而实施。纯化可通过细胞的有限稀释和/或克隆来实施。纯化可通过目标细胞的株化而实施。目标细胞具有抗药基因、编码荧光蛋白的基因等标记基因时，纯化可基于该标记基因的表达而实施。本说明书中，“富集”(enrich)是指提高目标细胞的存在密度。

本说明书中，“多核苷酸”及“核酸”这些术语可互换使用，是指核苷酸通过磷酸二酯键结合而成的核苷酸聚合物。“多核苷酸”及“核酸”可以为DNA，可以为RNA，可以由DNA与RNA的组合构成。另外，“多核苷酸”及“核酸”可以为天然核苷酸的聚合物，可以为天然核苷酸与非天然核苷酸(天然核苷酸的类似物；碱基部分、糖部分及磷酸部分中的至少一部分进行了修饰的核苷酸(例如硫代磷酸酯骨架)等)的聚合物，可以为非天然核苷酸的聚合物。

本说明书中，“多核苷酸”或“核酸”的碱基序列在没有特别声明时以通常认可的单字母符号来记载。没有特别声明时，碱基序列从5’侧向3’侧来记载。构成“多核苷酸”或“核酸”的核苷酸残基有时仅以腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤或尿嘧啶等或它们的单字母符号来记载。

本说明书中，“基因”这一术语是指含有编码特定蛋白的至少1个开放阅读框的多核苷酸。基因可含有外显子和内含子这两者。

本说明书中，“多肽”、“肽”和“蛋白质”这些术语可互换使用，是指通过酰胺键结合而成的氨基酸的聚合物。“多肽”、“肽”或“蛋白质”可以为天然氨基酸的聚合物，可以为天然氨基酸与非天然氨基酸(天然氨基酸的化学类似物、修饰衍生物等)的聚合物，可以为非天然氨基酸的聚合物。没有特别声明时，氨基酸序列从N末端侧向C末端侧来记载。

本说明书中，“等位基因”这一术语是指存在于染色体基因组上的同一座位的碱基序列的组。一个方式中，在二倍体细胞中在同一座位上存在2个等位基因，在3倍体细胞中在同一座位上存在3个等位基因。另外，一个方式中，有时由于染色体的异常拷贝或该座位的异常追加拷贝而形成有追加的等位基因。

本说明书中，“基因组改造”或“基因组编辑”这些术语可互换使用，是指对基因组上的期望位置(靶区域)诱导突变。基因组改造可包括以切割靶区域DNA的方式设计的序列特异性核酸切割分子(例如序列特异性或序列依赖性核酸内切酶)的使用。优选实施方式中，基因组改造可包括以切割靶区域的DNA的方式操作的核酸酶的使用。优选实施方式中，基因组改造可包括以切割靶区域中的具有特定碱基序列的靶序列的方式操作的核酸酶(例如TALEN、锌指核酸酶(ZFN))的使用。特别优选的实施方式中，基因组改造可包括以切割靶区域中的具有特定碱基序列的靶序列的方式操作的核酸酶(例如CRISPR-Cas9系统)的使用。优选实施方式中，基因组改造有时也可以以切割靶区域中的具有特定碱基序列的靶序列的方式使用兆核酸酶等在基因组中仅具有1个切割位点的限制酶(例如具有16个碱基的序列特异性的限制酶(理论上，以在4

“靶区域”这一术语是指被基因组改造系统作为靶的区域。本发明中，可使位于两个部位的靶区域(例如第1靶区域及第2靶区域)之间的、基因组上的DNA区域缺失。

“序列特异性核酸切割分子”这一术语是指能够识别特定核酸序列、并且在上述特定核酸序列处切割核酸的分子。序列特异性核酸切割分子为具有序列特异性地切割核酸的活性(序列特异性核酸切割活性)的分子。

“靶序列”这一术语是指成为序列特异性核酸切割分子的切割对象的、基因组中的DNA序列。序列特异性核酸切割分子为Cas蛋白时，靶序列是指成为Cas蛋白的切割对象的、基因组中的DNA序列。在使用Cas9蛋白作为Cas蛋白时，靶序列需要为与前间隔序列邻近基序(PAM)的5’侧相邻的序列。靶序列通常选择紧挨PAM的5’侧的上游的17～30个碱基(优选为18～25个碱基、更优选为19～22个碱基、进一步优选为20个碱基)的序列。在设计靶序列时，可以利用CRISPR DESIGN(crispr.mit.edu/)等公知的设计工具。

“Cas蛋白”这一术语是指CRISPR相关(CRISPR-associated)蛋白。优选方式中，Cas蛋白与指导RNA形成复合体、显示核酸内切酶活性或切口酶活性。作为Cas蛋白，没有特别限制，可列举例如Cas9蛋白等。Cas蛋白只要与指导RNA协同地显示核酸内切酶活性或切口酶活性，则包括野生型Cas蛋白及其同源物(旁系同源物和直系同源物)、以及它们的突变体。

优选方式中，Cas蛋白为与2类CRISPR/Cas系统相关的Cas蛋白，更优选为与II型CRISPR/Cas系统相关的Cas蛋白。作为Cas蛋白的优选例，可例示Cas9蛋白。

“Cas9蛋白”这一术语是指与II型CRISPR/Cas系统相关的Cas蛋白。Cas9蛋白与指导RNA形成复合体、与指导RNA协同地显示出切割靶区域的DNA的活性。Cas9蛋白只要具有上述活性，则包含野生型Cas9蛋白及其同源物(旁系同源物和直系同源物)、以及它们的突变体。野生型Cas9蛋白具有作为核酸酶结构域的RuvC结构域和HNH结构域，但本说明书中的Cas9蛋白可以为RuvC结构域和HNH结构域中的任一者已失活的蛋白。RuvC结构域和HNH结构域中的任一者已失活的Cas9对双链DNA导入单链切割(切口)。因此可以以如下方式构成改造系统：将RuvC结构域和HNH结构域中的任一者已失活的Cas9用于双链DNA的切割时，对有义链和反义链分别设定Cas9的靶序列，使有义链和反义链的切口在足够近的位置处产生，由此诱发双链切割。

Cas9蛋白所来源的生物种没有特别限制，可优选例示属于链球菌(Streptococcus)属、葡萄球菌(Staphylococcus)属、奈瑟氏菌(Neisseria)属或密螺旋体(Treponema)属的细菌等。更具体而言，可优选例示来自酿脓链球菌(S.pyogenes)、嗜热链球菌(S.thermophilus)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)或齿垢密螺旋体(T.denticola)等的Cas9蛋白。优选方式中，Cas9蛋白为来自酿脓链球菌的Cas9蛋白。

“指导RNA”和“gRNA”这一术语可互换使用，是指能够与Cas蛋白形成复合体、将Cas蛋白诱导至靶区域的RNA。优选方式中，指导RNA含有CRISPR RNA(crRNA)和反式激活型CRISPR RNA(tracrRNA)。crRNA参与对基因组上的靶区域的结合，tracrRNA参与与Cas蛋白的结合。优选方式中，crRNA含有间隔序列和重复序列，间隔序列在靶区域中与靶序列的互补链结合。优选方式中，tracrRNA含有反重复序列和3’尾序列。反重复序列具有与crRNA的重复序列互补的序列，与重复序列形成碱基对，3’尾序列通常形成3个茎环。

指导RNA可以为在crRNA的3’末端连接有tracrRNA的5’末端的单一指导RNA(sgRNA)，可以为使crRNA和tracrRNA为不同的RNA分子、且利用重复序列和反重复序列形成碱基对的RNA。优选方式中，指导RNA为sgRNA。

crRNA的重复序列和tracrRNA的序列可根据Cas蛋白的种类适当选择，可以使用与Cas蛋白来自相同细菌种属者。作为CRISPR-Cas9系统，可使用来自酿脓链球菌的Cas9蛋白、crRNA及tracrRNA(或sgRNA)。用于设计sgRNA的crRNA重复序列和tracrRNA的序列已经提出了各种，本领域技术人员可以基于公知技术来设计sgRNA(例如Jinek et al.(2012)Science,337,816-21；Mali et al.(2013)Science,339：6121,823-6；Cong et al.(2013)Science,339：6121,819-23；Hwang etal.(2013)Nat.Biotechnol.31：3,227-9；Jinek etal.(2013)eLife,2,e00471)。

关于多核苷酸使用的“可操作地连接”这一术语是指第一碱基序列以足够靠近第二碱基序列的方式配置、第一碱基序列可对第二碱基序列或第二碱基序列控制下的区域产生影响。例如，多核苷酸与启动子可发挥功能地连接是指该多核苷酸以在启动子控制下表达的方式进行连接。

“能够表达的状态”这一术语是指在导入了多核苷酸的细胞内处于该多核苷酸能够转录的状态。

“表达载体”这一术语是指含有对象多核苷酸、并且具备在导入了该载体的细胞内使对象多核苷酸处于能够表达的状态的系统的载体。例如，“Cas蛋白的表达载体”是指在导入了该载体的细胞内能够表达Cas蛋白的载体。另外，例如“指导RNA的表达载体”是指在导入了该载体的细胞内能够表达指导RNA的载体。

本说明书中，碱基序列彼此或氨基酸序列彼此的序列一致性(或同源性)是指：将2个碱基序列或氨基酸序列以使对应的碱基或氨基酸最多一致的方式在相当于插入和缺失的部分引入间隙并进行排列，以所得到的比对中的除间隙以外的、一致的碱基或氨基酸相对于碱基序列整体或氨基酸序列整体的比例求出的值。碱基序列或氨基酸序列彼此的序列一致性可以使用该技术领域中公知的各种同源性检索软件求出。例如，碱基序列的序列一致性的值可以基于利用公知的同源性检索软件BLASTN得到的比对通过计算得到，氨基酸序列的序列一致性的值可以基于利用公知的同源性检索软件BLASTP得到的比对通过计算得到。

＜本发明的方法＞

根据本发明，提供包括下述步骤的方法：(a)准备含有细胞的细胞群；和(b)使能够序列特异性地切割基因组DNA上的两个部位的靶序列的序列特异性核酸切割分子分别作用于上述细胞群中的上述细胞的基因组DNA，在基因组DNA上的两个部位的靶序列中分别产生切割，由此，使细胞群中的至少一部分细胞中在上述两个部位的切割位点之间的区域中产生DNA区域的缺失。本发明的方法可以为体外方法。本发明的方法另外可优选使用经单离的细胞。

因此，根据本发明，提供体外方法，其包括下述步骤：(a)准备含有经单离的细胞的细胞群；和(b)使能够序列特异性地切割基因组DNA上的两个部位的靶序列的序列特异性核酸切割分子分别作用于上述细胞群中的上述细胞的基因组DNA，在基因组DNA上的两个部位的靶序列中分别产生切割，由此，使细胞群中的至少一部分细胞中在上述两个部位的切割位点之间的区域中产生DNA区域的缺失。

根据本发明的一个方式，本发明的方法还包括下述步骤：(c)在含有产生了上述DNA区域的缺失的细胞的细胞群中，确定产生了上述DNA区域的缺失的细胞相对于全部细胞的比例。

上述(a)中，细胞群中所含的细胞可以为单一种类，也可以为多个种类。细胞群中所含的细胞可优选为单一种类(例如细胞株、经克隆化的细胞)。细胞群可以为悬浮细胞群，也可以为粘附细胞群。细胞群可以为单一细胞化的细胞群，也可以为含有细胞块的细胞群。细胞群可含有细胞和生理学上可接受的赋形剂。作为生理学上可接受的赋形剂，为具有适合于维持细胞的条件的赋形剂，可列举例如水、盐、pH缓冲剂、等渗剂等。细胞群可含有例如10

本发明的一个方式中，细胞可以为经单离的细胞。细胞可以为经纯化的细胞。细胞可以为单细胞生物的细胞。细胞可以为细胞株。细胞可以为经克隆化的细胞(细胞克隆)。细胞可以为经单一细胞化的细胞。细胞可以为悬浮细胞。细胞可以为粘附细胞。细胞可以形成细胞块。细胞可以形成集落。细胞可被置于适合其维持或增殖的条件下。

一个方式中，细胞可以为选自由多能细胞及多能干细胞(胚胎干细胞及人工多能干细胞等)组成的组中的细胞。一个方式中，细胞可以为组织干细胞。一个方式中，细胞可以为体细胞。一个方式中，细胞可以为组织前体细胞。一个方式中，细胞可以为生殖系列细胞(例如生殖细胞)。一个方式中，细胞可以为细胞株。一个方式中，细胞可以为永生化细胞。一个方式中，细胞可以为癌细胞。一个方式中，细胞可以为非癌细胞。一个方式中，细胞可以为疾病患者的细胞。一个方式中，细胞可以为健康者的细胞。一个方式中，细胞可以为感染了外源病原体的细胞。一个方式中，细胞可以为非感染细胞。一个方式中，细胞可以为动物细胞(例如禽类细胞、例如鱼类细胞、例如两栖类细胞、例如爬行类细胞、例如哺乳动物细胞、例如啮齿类细胞、例如灵长类细胞、例如人细胞)。一个方式中，细胞可以为例如选自由昆虫细胞(例如蚕细胞)、HEK293细胞、HEK293T细胞、Expi293F(商标)细胞、FreeStyle(商标)293F细胞、中华仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、CHO-S细胞、CHO-K1细胞及ExpiCHO细胞、以及来自这些细胞的派生细胞组成的组中的细胞(特别是产生重组蛋白的细胞)。一个方式中，细胞可以为植物细胞。一个方式中，作为细胞，另外可列举微生物细胞、例如丝状菌、放线菌等革兰氏阳性菌、大肠杆菌等革兰氏阴性菌、及酵母等真菌等微生物的细胞。

优选地，本发明中使用的细胞可以为单倍体细胞，也可以为二倍体细胞。细胞另外可以为上述以外的倍数体的细胞，可以没有特别限定地使用。本发明的全部实施方式中，均可优选使用单倍体细胞。

上述(b)中，可以使能够序列特异性地切割基因组DNA上的两个部位的靶序列的序列特异性核酸切割分子分别作用于细胞的基因组DNA(特别是宿主基因组DNA)。靶序列可以由本领域技术人员根据使用的序列特异性核酸切割分子的切割特性来适当设定。靶序列可以存在于至少1个等位基因的碱基序列中，优选为共同存在于2个以上或全部等位基因中的序列。切割基因组上的多个靶序列时，例如CRISPR-Cas9系统、TALEN、及锌指核酸酶均可优选使用。具体而言，这是由于，随着靶序列的增加而增加所使用的指导RNA(crRNA与tracrRNA的组合、或sgRNA)就能够切割多个部位(例如，参照WO2014/093661)。在切割时使用CRISPR-Cas9系统以外的基因组改造系统的情况下，对每个靶序列准备切割分子。

基因组DNA(特别是宿主基因组DNA)中产生切割时，切割位点可通过细胞的基因组修复机制再次连接。在基因组DNA中产生两个部位的切割时，基因组DNA的端粒侧的切割末端与着丝粒侧的切割末端可通过基因组修复机制以一定的概率直接连接，可使两个部位的切割位点之间的DNA区域从基因组DNA中缺失。

因此，上述(b)中，可获得含有至少1个具有在上述两个部位的切割位点之间的区域中产生的DNA区域的缺失的细胞(优选多个细胞)的细胞群。

上述(b)中，可按照夹着含有一个或多个基因或基因候补的区域的方式来设计两个部位的切割位点。在两个部位的切割位点所含的一个或多个基因或基因候补可以含有一个或多个对细胞的生存和/或增殖进行正控制的基因(例如细胞的生存和/或增殖所必需的基因)。在两个部位的切割位点所含的一个或多个基因或基因候补可含有一个或多个抑制细胞增殖的基因等产生缺失时促进细胞增殖的一个或多个基因。对细胞的生存和/或增殖进行正控制的基因(例如，细胞的生存和/或增殖所必需的基因)并不一定需要本领域技术人员已经预先掌握。但是，对细胞的生存和/或增殖进行正控制的基因(例如细胞的生存和/或增殖所必需的基因)可以使用Online Gene Essentiality(OGEE)数据库(http：//ogee.medgenius.info/browse/)等公开数据库预先推定。

一个方式中，含有一个或多个基因或基因候补的区域可含有推定为对细胞的生存和/或增殖进行正控制的基因(例如细胞的生存和/或增殖所必需的基因)的基因。一个方式中，含有一个或多个基因或基因候补的区域可含有对细胞的生存和/增殖进行负控制的基因或推定为对细胞的生存和/增殖进行负控制的基因的基因。一个方式中，含有一个或多个基因或基因候补的区域可含有对细胞的生存和/或增殖进行正控制的基因(例如细胞的生存和/或增殖所必需的基因)或推定为对细胞的生存和/增殖进行正控制的基因的基因、以及对细胞的生存和/增殖进行负控制的基因或推定为对细胞的生存和/增殖进行负控制的基因的基因。

上述(b)中，两个部位的切割位点没有特别限定，可以以夹着0.1Mb以上、0.2Mb以上、0.3Mb以上、0.4Mb以上、0.5Mb以上、0.6Mb以上、0.7Mb以上、0.8Mb以上、0.9Mb以上、1Mb以上、2Mb以上、3Mb以上、4Mb以上、或5Mb以上的区域的方式来设计。即，从基因组DNA中缺失的DNA区域可以具有0.1Mb以上、0.2Mb以上、0.3Mb以上、0.4Mb以上、0.5Mb以上、0.6Mb以上、0.7Mb以上、0.8Mb以上、0.9Mb以上、1Mb以上、2Mb以上、3Mb以上、4Mb以上或5Mb以上的长度。

由此，上述(b)中，可得到含有具有在上述两个部位的切割位点之间的区域中产生的DNA区域的缺失的细胞的细胞群。具有两个部位的切割的基因组DNA等DNA可在细胞内进行修复，但是通过该修复，可能以一定概率产生含有具有在上述两个部位的切割位点之间的区域中产生的DNA区域的缺失的基因组DNA等DNA的细胞。因此，通过上述，可得到含有具有在上述两个部位的切割位点之间的区域中产生的DNA区域的缺失的细胞的细胞群。

可以从细胞群获得具有在上述两个部位的切割位点之间的区域中产生的DNA区域的缺失的细胞。获得例如可以通过对细胞群进行有限稀释、克隆来进行。可认为，缺失了DNA区域的基因组DNA中，缺失的部分的前后是直接连接的。因此，通过以夹着该连接部(连接)的方式设计扩增用引物并且以缺失了DNA区域的基因组DNA为模板的PCR法(连接PCR)，可以确定有无DNA区域的缺失。另外，通过对连接部进行测序，可以确定有无DNA区域的缺失。

此时，在缺失了的DNA区域不含对细胞的生存和/或增殖进行正控制的基因(例如细胞的生存和/或增殖所必需的基因)的情况下，可以获得具有该DNA区域的缺失的细胞。另外，在缺失了的DNA区域含有对细胞的生存和/或增殖进行正控制的基因(例如细胞的生存和/或增殖所必需的基因)的情况下，具有该缺失的细胞随着时间而停止增殖或死亡，细胞在细胞群中所占的比例减少。或者，在缺失了的DNA区域含有对细胞的生存和/增殖进行负控制的基因的情况下，具有该缺失的细胞随着时间而增殖，在细胞群中所占的比例增加。

上述(c)中，可以基于产生了DNA区域的缺失的细胞的比例来确定上述DNA区域的缺失对细胞的增殖或生存的影响。

上述DNA区域的缺失对细胞的增殖或生存的影响可以通过各种方法来确定。

上述(c)可以接着步骤(b)来进行。在此，在步骤(b)与(c)之间，可以不实施细胞筛选(将特定细胞与其它细胞单离，例如从细胞群中筛选一部分细胞)。即，可以将步骤(b)中得到的细胞群直接培养，实施步骤(c)。培养可以在适合于培养缺失前的细胞(或使其增殖)的条件下进行。或者，在步骤(b)与(c)之间，也可以实施细胞筛选步骤。

上述(c)中，上述确定可如下进行：确定DNA区域的缺失效率或其推定值；对之后的培养后的细胞群中的具有DNA区域的缺失的细胞的比例与所确定的缺失效率或其推定值进行比较。

上述(c)中，缺失效率或其推定值的确定及培养后的具有DNA区域的缺失的细胞的比例可以分别以含有细胞群的悬浮液中所含的具有缺失的细胞相对于全部细胞的比例来确定。上述比例可通过悬浮液中所含的具有缺失的基因组DNA及不具有缺失的基因组DNA的计数技术来确定。

DNA区域的缺失对细胞的增殖或生存的影响可以由缺失的导入效率(或其推定值)和接下来的培养后的具有DNA区域的缺失的细胞的比例来确定。例如，上述(c){以下，在确定DNA区域的缺失的影响的步骤中也同样}可包括计算缺失的导入效率(或其推定值)的步骤。DNA区域的缺失的导入效率可以在上述(b)的处理后、在细胞中产生DNA区域的缺失效果之前进行。刚进行DNA区域的缺失后，细胞内残留有来自该缺失了的DNA区域的转录产物、翻译产物，因此，DNA区域的缺失的影响小。因此，可以在上述(b)的处理后、例如2小时后～3天后、4小时～3天后、6小时～3天后、8小时～3天后、12小时～3天后、18小时～3天后、1天后～2天后、1天后～3天后、1天～60小时后、4小时～60小时后、4小时～48小时后、4小时～36小时后、4小时～30小时后、或4小时～2天后确认DNA区域的缺失的导入效率。上述(c){以下，在确定DNA区域的缺失的影响的步骤中也同样}另外可包括培养所得到的细胞的步骤。培养可以在适合于培养DNA区域的缺失处置前的细胞的条件下进行。例如，可以培养上述(b)后得到的、含有具有上述DNA区域的缺失的细胞的细胞群并对相对于一定细胞数的增殖出的细胞的数量或增殖出的细胞所形成的集落数进行计数，由此来进行评价。具体而言，相对于一定细胞数的增殖出的细胞的数量或增殖出的细胞所形成的集落数发生变化(或者，具有缺失的集落的比例或细胞的比例与缺失的导入效率相比下降)是指上述缺失了的DNA区域中含有控制细胞的生存和/或增殖的基因。更具体而言，相对于一定细胞数的增殖出的细胞的数量或增殖出的细胞所形成的集落数多或增加可以评价为上述DNA区域的缺失对细胞的增殖或生存带来了正影响或上述DNA区域含有对细胞的生存和/或增殖进行负控制的基因。另外，相对于一定细胞数的增殖出的细胞的数量或增殖出的细胞所形成的集落数少或减少可评价为上述DNA区域的缺失对细胞的增殖或生存带来负影响或上述DNA区域含有对细胞的生存和/或增殖进行正控制的基因(特别是细胞的生存和/或增殖所必需的基因)。上述培养可在适合于培养改造前的细胞的条件下进行。也可以调查具有DNA区域的缺失的集落相对于所形成的集落数的比例。

另外，例如也可以使用数字PCR、基于分子条形码的核酸数字计数技术等计数方法来确定缺失的导入效率(或其推定值)及细胞群中的具有上述DNA区域的缺失的细胞数的比例。上述计测方法可以不包括将某种细胞与其它细胞分离的步骤、和/或使细胞形成集落的步骤。即，可以使用细胞悬浮液(或者使用由细胞悬浮液提取的基因组DNA或其扩增产物)来计算缺失的导入效率(或其推定值)及细胞群中的具有上述DNA区域的缺失的细胞数的比例。

数字PCR为如下方法：对于核酸(在此为基因组DNA)，以使每孔中的基因组数恒定的浓度及量将核酸分注于多个微细的隔板并供于PCR反应，对发生了PCR反应的孔数进行计数，从而进行模板核酸的绝对定量。可以使用微流体器件、利用油中液滴的微滴法将核酸划分为含有1分子的多个级分，在各个含有1分子的级分中并列地引发核酸扩增反应。利用要扩增的模板不存在则不产生扩增产物、要扩增的模板存在则产生扩增产物这一点，对每个级分计数扩增的有无，由此可以数字化地确定样品中是否存在要扩增的模板或其存在量。PCR引物可以按照未产生DNA区域的缺失时增加、具有缺失时不增加的方式来设计，或者可以按照未产生DNA区域的缺失时不增加、具有缺失时增加的方式来设计。

基于分子条形码的核酸的数字计数技术为如下技术：对于核酸片段，在每1分子上添加固有的分子条形码(具体而言，固有的碱基序列)，然后对其序列进行测序，由此对核酸分子数进行绝对定量。基于分子条形码的核酸的数字计数技术中，分子条形码的种类数与核酸分子数对应。

上述DNA区域含有对细胞的生存和/或增殖进行正控制的基因(特别是细胞的生存和/或增殖所必需的基因)时，细胞会随着培养而死亡。因此，例如，可以通过在其死亡的前后确定细胞群中的具有上述DNA区域的缺失的细胞数的比例(或具有缺失的集落的比例或细胞的比例与缺失的导入效率相比下降)来评价上述DNA区域的缺失对细胞的增殖或生存的影响。

上述DNA区域的缺失对细胞的增殖或生存的影响可以与对照进行比较而确定。例如，上述DNA区域的缺失对细胞的增殖或生存的影响可以与对照的细胞的增殖或生存进行比较而确定。作为对照的细胞，例如可以为具有上述DNA区域的一部分或全部的细胞。

本发明的一个方式中，上述(c){以下，在确定DNA区域的缺失的影响的步骤中也同样}包括培养上述(b)中得到的细胞的步骤。该培养例如可以在规定条件下进行。作为规定条件下，除了常规的细胞的培养条件下以外，还可以列举例如应激存在下、增殖刺激存在下、分化诱导刺激存在下、低氧条件下、增殖因子存在下、增殖抑制剂存在下、分化诱导因子存在下、分化抑制因子存在下、及药剂存在下。通过如此地在规定条件下培养上述(b)中得到的细胞，从而可以确定缺失了的DNA区域对该细胞在该规定条件下的行为的影响(作用)。另外，还可以调查培养条件(规定条件)对具有特定的DNA区域的缺失的细胞的行为的影响。例如，通过调查药剂添加对具有特定的DNA区域的缺失的细胞的行为的影响，可以进行药剂的特性分析、药剂的筛选。

本发明的方法可以包括：上述(a)～(c)；以及(d)基于与作为对照的细胞群相比上述(c)中的对生存和/或增殖的影响的有无或大小来确定与对照的基因组DNA相比缺失了的DNA区域是否含有控制细胞的生存和/或增殖的基因。

上述(d)中，对照或阴性对照可以为未改造或改造前的细胞或细胞群。上述(d)中，对照(或阴性对照)可以为具有更小的DNA区域的缺失的细胞或含有该细胞的细胞群。上述(d)中，对照(或阳性对照)可以为具有更大的DNA区域的缺失的细胞或含有该细胞的细胞群。上述(d)中，对照可以为具有不同的DNA区域的缺失的细胞或含有该细胞的细胞群。上述细胞群可以通过上述(b)得到。

上述(d)中，通过将未改造或改造前的细胞或细胞群作为对照，可以评价缺失了的DNA区域中所含的基因对细胞的生存和/或增殖的影响。

上述(d)中，通过将具有更小的DNA区域的缺失的细胞或含有该细胞的细胞群作为对照，可以评价作为该对照所含的基因的、因成为评价对象的DNA的缺失而缺失了的基因对细胞的生存和/或增殖的影响。

上述(d)中，通过将具有更大的DNA区域的缺失的细胞或含有该细胞的细胞群作为对照，可以评价作为该对照不含的基因的、具有成为评价对象的DNA的缺失的细胞所含有的基因对细胞的生存和/或增殖的影响。

上述(d)中，通过将具有不同的DNA区域的缺失的细胞或含有该细胞的细胞群作为对照，可以评价(d-1)作为该对照所含的基因的、因成为评价对象的DNA的缺失而缺失了的基因和/或(d-2)作为该对照不含的基因的、具有成为评价对象的DNA的缺失的细胞所含有的基因对细胞的生存和/或增殖的影响。

一个方式中，本发明可包括下述步骤：上述(a)～(c)；以及(e)还包括在至少两个不同的时刻确定上述细胞的比例的步骤，基于随着时间经过的上述(c)中的对细胞的生存和/或增殖的影响的有无或大小来确定缺失了的DNA区域是否含有至少1个控制细胞的生存和/或增殖的基因。

通过上述(b)，得到包含含有上述DNA区域的缺失的细胞的细胞群。细胞群中所含的该含有缺失的细胞的比例依赖于基因组的改造效率。细胞群中所含的该含有缺失的细胞可通过培养而使其数量增加、减少或维持。细胞在基因组产生改造后，也会在短时间内由于细胞质内的来自基因组DNA的转录产物(例如mRNA)的残留、来自转录产物的翻译产物(例如蛋白质)的残留而可能显示出与改造前同样的行为。但是，培养一段时间后，上述转录产物的残留量、蛋白质的残留量减少，基于DNA的缺失的基因型以表型来表达。并且之后，基于控制细胞的生存和/或增殖的基因的表型变得明显。

上述(e)中，关于两个时刻(第1时刻及第2时刻)，第1时刻可以为基于DNA的缺失的基因型以表型来表达之前，第2时刻可以为基于DNA的缺失的基因型以表型来表达之后。例如，第1时刻可以为基因组改造起3天以内。另外，例如第2时刻可以为基因组改造起第3天以后。第1时刻与第2时刻的间隔例如可以为1天以上、2天以上、3天以上、4天以上、5天以上、6天以上、或1周以上的期间。本领域技术人员可以基于细胞的状态等适当地确定第1时刻和第2时刻，并实施本发明。

上述(e)中，还包括在至少两个不同的时刻确定上述细胞的比例的步骤，评价随着时间经过的上述(c)中的对细胞的生存和/或增殖的影响的有无或大小。

上述(e)中，随着时间经过而观察到上述(c)中的对细胞的生存和/或增殖的影响时，表明成为其原因的DNA区域的缺失可能含有控制细胞的生存和/或增殖的基因。另外，随着时间经过而观察到上述(c)中的对细胞的生存和/或增殖的影响时，可以通过评价其影响的大小来评价成为其原因的DNA区域的缺失所含的控制细胞的生存和/或增殖的基因对细胞的生存和/或增殖的影响力的大小。影响的大小可以与对照进行比较来进行评价。作为对照，可列举编码细胞的增殖因子的基因等阳性对照和/或编码细胞的增殖抑制因子的基因等阳性对照。作为对照，也可使用编码已知不会影响细胞的生存和/或增殖的因子的基因等阴性对照。

缺失了的DNA区域含有多个推定基因(或基因)时，可以实施步骤(f)：从其中确定哪个基因是控制细胞的生存和/或增殖的基因。确定哪个基因是控制细胞的生存和/或增殖的基因可以使用各种方法来实施。例如，通过特异性的基因破坏、由本发明的基因缺失导致的缺损区域的细化、基因克隆和该基因的功能分析等，可以确定哪个基因是控制细胞的生存和/或增殖的基因。

缺失了的DNA区域含有控制细胞的生存和/或增殖的基因时，可以将该基因异位性地导入到基因组DNA的其它位置。因此，本发明可以还包括下述步骤：

(g)将至少1个可操作地连接于控制序列的控制细胞的生存和/或增殖的基因(特别是对细胞的生存和/或增殖进行正控制的基因)异位导入到具有该DNA区域的缺失的基因组DNA中。

在此，异位性地导入是指对与内源性所处位置不同的位置进行导入。

通过上述(b)和上述(g)，使基因组DNA产生DNA区域的缺失、并且将控制细胞的生存和/或增殖的基因(特别是对细胞的生存和/或增殖进行正控制的基因、特别是细胞的生存所必需的基因)异位性地导入到上述基因组DNA中，从而能够降低对细胞的生存和/或增殖的影响且使基因组DNA产生更大的DNA区域的缺失。由此能够将细胞的基因组DNA最小化至具有生存所必需的基因集的状态。

根据本发明，另外提供包括下述步骤的方法：

(α)准备含有细胞的细胞群；在此，细胞在要缺失的区域中含有负选择标记基因，

(β)使能够序列特异性地切割基因组DNA上的两个部位的靶序列的序列特异性核酸切割分子分别作用于上述细胞群中的上述细胞的基因组DNA，在基因组DNA上的两个部位的靶序列中分别产生切割，由此，使细胞群中的至少一部分细胞中在上述两个部位的切割位点之间的区域中产生DNA区域的缺失，在此，上述两个部位设计在夹着上述负选择标记基因的位置；和

(γ)选择不具有负选择标记基因的细胞。

本发明的方法可以为体外方法，细胞可以为经单离的细胞。一个方式中，本发明的方法为体外方法，细胞为经单离的细胞。

上述(α)除了细胞在要缺失的区域中含有负选择标记基因以外均与上述(a)相同，因此省略对于相同部分的说明。在此，在选择标记物表达细胞及选择标记物非表达细胞混合存在的细胞群中对选择标记物非表达细胞进行选择时，将该选择标记物称为“负选择标记物”或“负选择用选择标记物”。

负选择标记物只要能够选择不表达其的细胞则没有特别限定。作为负选择标记基因，可列举例如自杀基因(胸苷激酶(TK)等)、荧光蛋白基因、发光酶基因、显色酶基因等。在负选择标记基因为对细胞的生存产生负影响的基因(例如自杀基因)时，该负选择标记基因可以与诱导型启动子可发挥功能地连接。通过与诱导型启动子可发挥功能地连接，可以使负选择标记基因仅在想要去除具有负选择标记基因的细胞时表达。在负选择标记基因为可通过荧光、发光和显色等光学方式检测的标记基因(可视化标记基因；visible markergene)时等对细胞的生存的负影响小的情况下，可以使其稳定地表达。

上述(α)中，细胞在要缺失的DNA区域中含有负选择标记基因(可以用于负选择的标记基因)。要缺失的DNA区域可通过设为内源性具有负选择标记基因的部分或向要缺失的DNA区域中外源性导入负选择标记基因而制作。内源性具有负选择标记基因的部分可以为例如X染色体的HPRT1基因(特别是人X染色体的人HPRT1基因)所在的区域(特别是人X染色体的q25-26的DNA区域)。向要缺失的区域外源性导入负选择标记基因例如可以使用基因改造技术(例如HDR、基因组编辑系统)来进行。例如负选择标记基因为可视化标记基因时，例如通过将可视化标记基因插入到基因组DNA的特定DNA区域后使其表达，由此根据其发光强度可以判断是在1个等位基因中导入了可视化标记基因还是在多个等位基因中导入了可视化标记基因。通过对向特定DNA区域中插入了可视化标记基因的细胞进行克隆，由此可以得到要缺失的区域中含有负选择标记基因的细胞。或者，通过对多个等位基因分别插入可相互区分的固有的选择标记基因和负选择标记基因，以该分别整合于等位基因中的固有的选择标记物的表达为指标选择细胞，从而可以获得在多个等位基因中整合有负选择标记基因的细胞。向特定DNA区域中插入基因可以如下实现：使用基因组改造系统切割该DNA区域中的靶序列，利用具备能够与切割位点的上游同源重组的上游同源臂和能够与切割位点的下游同源重组的下游同源臂、并且在上游同源臂与下游同源臂之间含有要插入的基因的供体DNA诱发HDR。负选择标记基因为自杀基因等对细胞的生存带来负影响的基因时，在克隆后使各个克隆表达自杀基因、自杀的细胞为在至少1个等位基因中导入了负选择标记基因的细胞。在也向其它等位基因中导入了负选择标记基因的情况下，与其它诱导性启动子可发挥功能地(可操作地)连接并向其它等位基因中导入负选择标记基因，确认在驱动该启动子的情况下细胞不死亡即可。细胞可以使用二倍体细胞，优选使用单倍体细胞。从分析系统的简便性的观点出发，作为单倍体细胞，例如可以使用HAP1细胞。

上述(β)中，可以以夹着上述(α)中插入了负选择用标记基因的DNA区域的方式确定两个部位的靶序列，设计能够对其进行序列特异性切割的序列特异性核酸切割分子。使序列特异性核酸切割分子作用于基因组DNA时，两个部位的靶序列之间的DNA区域从基因组DNA中缺失。由于两个部位的靶序列之间的DNA区域含有负选择用标记基因，因此，由于上述缺失，负选择用标记基因也一起缺失。

上述(γ)中，选择通过上述(β)而得到的、具有两个部位的靶序列之间的DNA区域的缺失的细胞。具有两个部位的靶序列之间的DNA区域的缺失的细胞如上所述不具有负选择用标记基因。因此，即使在诱导负选择用标记基因的条件下维持细胞，也不会表达负选择用标记基因。因此，可以以在诱导负选择用标记基因的条件下维持细胞、不表达负选择用标记基因为指标，来选择具有两个部位的靶序列之间的DNA区域的缺失的细胞。负选择用标记基因为使细胞死亡的基因(自杀基因)时，这些基因可以与诱导性启动子可操作地连接，使诱导因子作用于该诱导性启动子而诱导负选择用标记基因的表达，从而可以除去不具有DNA区域的缺失的细胞。负选择用标记基因为可视化标记基因时，可以以表达可视化标记基因为指标来除去不具有DNA区域的缺失的细胞。另外，负选择用标记基因为可视化标记基因时，还可以以不表达可视化标记基因为指标来选择具有DNA区域的缺失的细胞。

＜具有DNA区域的缺损的细胞＞

根据本发明，通过上述的本发明的方法，可以得到具有靶DNA区域的缺失的细胞。因此，根据本发明，提供具有靶DNA区域的缺失的细胞。根据本发明，靶DNA区域可以含有细胞的生存所必需的基因。因此，根据本发明，提供具有靶DNA区域的缺失、并且靶DNA区域含有细胞的生存所必需的基因的细胞。根据本发明，具有靶DNA区域的缺失、并且靶DNA区域含有细胞的生存所必需的基因的细胞可以具有异位性地插入了生存所必需的基因的基因组DNA。因此，根据本发明，提供具有靶DNA区域的缺失、并且靶DNA区域含有细胞的生存所必需的基因、并且具有异位性地插入了该细胞的生存所必需的基因的基因组DNA的细胞。异位性的插入部位没有特别限定，可以为不存在其它基因的区域。上述(a)及(α)中，作为细胞，可以使用具有靶DNA区域的缺失、并且靶DNA区域含有细胞的生存所必需的基因、并且具有异位性地插入了该细胞的生存所必需的基因的基因组DNA的细胞。由此，通过上述(b)或(β)，可以使要缺失的DNA区域进一步扩大，可以使缺失扩大至下一个控制细胞的生存和/或增殖的基因(例如对细胞的生存和/或增殖进行正控制的基因、例如细胞的生存和/或增殖所必需的基因)。通过上述的本发明的方法得到的具有靶DNA区域的缺失的细胞与缺失前的细胞相比，可以具有50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、或95％以上的增殖率或生存率。一个方式中，上述具有靶DNA区域的缺失的细胞缺失了原来的基因组的20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上或90％以上。

＜具有DNA区域的缺损的细胞的制造方法＞

上述具有靶DNA区域的缺失的细胞可以通过上述的本发明的方法来制作。因此，根据本发明，提供制造具有靶DNA区域的缺失的细胞的方法，其包括实施本发明的方法的步骤。具有DNA区域的缺失的细胞可以为通过不具有负选择用标记基因而选择出的细胞。

实施例

将HAP1细胞在含有5％CO

HAP1细胞的必需基因按照以下2个基准来定义：(1)在3个报告(OGEE数据库

关于24个gRNA/Cas9表达质粒(gpHY001-pJS067)的构建，使用CRISPRdirect软件

[表1]

将连接产物转化于DH5 alpha E.coli细胞，将质粒使用制造者的规程，利用EndoFree质粒小提试剂盒(Qiagen)进行纯化。

pHY262通过向pWZ267载体

pHY263通过向pGEM(商标)-T Easy Vector(Promega)中插入IRES-GFP-2A-Puro组件而构建。

pHY271(胸苷激酶负选择标记物)通过将表2-1及2-2所示的扩增产物用GibsonAssembly进行结合而构建。将Gibson Assembly产物转化于DH5 alpha E.coli细胞。关于质粒，使用EndoFree质粒中提试剂盒(Qiagen)使用制造者的规程进行纯化。

[表2-1]

[表2-2]

构建pHY269(RBMX2基因座克隆)及pHY270(MMGT1基因座克隆)。将pHY262(～100ng)利用BamHI及EcoRI(New England Biolabs)直链化，与覆盖包括转录起始点上游的3kb区域及多聚腺苷酸化位点下游的3kb区域的RBMX2或MMGT1基因座的～100ng的基因组扩增产物(补充表6)一起共转化于酵母。各片段具有～300bp的重叠。酵母的转化按照前文记载的规程进行

将HAP1细胞以6×10

对于各靶区域，以巢式PCR形式进行48次反应。第1次PCR中，每次反应使用100个基因组(单倍体人细胞的情况下为3.3pg的基因组DNA)，第2次PCR中使用2×Quick Taq HSDyeMix(东洋纺)和表3-1及3-2中记载的引物，使用第1次PCR混合物的1/100稀释液作为模板。缺失效率(λ)使用泊松统计学来计算：λ＝-ln(1-p){在此，λ为100个基因组中的具有缺失接合部的基因组的平均数，p为48次PCR中的阳性反应的比例}9。

[表3-1]

表3-1(补充表5)连接数字PcR中使用的引物

[表3-2]

将gRNA/Cas9表达载体转染于HAP1细胞后，对～2000个细胞进行胰蛋白酶处理，重新播种于10cm培养皿，在5μM 6-硫鸟嘌呤(6-TG)(Sigma、A4882-100MG)中培养12天。然后挑取10cm培养皿上的独立集落，分别展开至24孔板的各孔中。接着，将细胞的一部分在12孔板中展开以单离基因组DNA，将剩余部分冷冻储存以进行各克隆的进一步分析。

将gRNA/Cas9表达载体转染于HAP1或HCT116后，对～5×10

将在12孔板中培养的细胞收集到1.5mL的管中，重新悬浮于118μL的封闭缓冲液(10mM Tris-HCl(pH8.0)、100mM NaCl、0.04％(w/v)SDS、0.2mg/mL蛋白酶K(和光)、2.5mg/mL RNasA(ニッポンジーン))，在37℃下孵育～18小时。添加苯酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)的1体积，以60rpm旋转30分钟。以12000rpm离心分离10分钟后，将上层水层转移到新的管中，添加绝对异丙醇1体积。以13000rpm离心分离5分钟后，将颗粒用300μL的70％乙醇洗涤、风干。将基因组DNA溶解于100μL的TE缓冲液，在-20℃下保存。

使用2×Quick Taq HS DyeMix(东洋纺)和补充表5中记载的PCR引物，由提取的基因组DNA通过巢式PCR形式扩增具有缺失的连接部(缺失连接部；deletion junction)。使用ABI PRISM BigDye终止剂循环测序试剂盒(Applied Biosystems公司)，利用ABI 3100DNA测序仪确定总PCR产物的碱基序列(图1d)。

为了使用2x Quick Taq HS DyeMix(东洋纺)和表4-1及4-2中记载的PCR引物扩增所提取的基因组DNA并确认应缺失的基因从基因组上缺失，通过巢式PCR形式来进行基因缺失的检测。通过1％琼脂糖凝胶电泳来分析得到的PCR产物(图3a)。

[

[

将各HAP1缺失克隆或WT克隆与hHY224(将IRES-GFP-2A-Puro组件整合于HAP1细胞的GAPDH基因座的3’UTR而得)混合，在IMDM培养基中培养。培养2天后，回收细胞作为“day_0”样品，将剩余细胞进一步培养16天，作为“day_16”样品而回收。通过流式细胞术对GFP阳性细胞和阴性细胞进行测定。将缺失克隆中的GFP阴性细胞的比率除以WT克隆中的GFP阴性细胞的比率而计算出相对群。流式细胞术分析使用EC800流式细胞分析仪(索尼生物技术有限公司制)进行。

使用RNeasy Mini RNA分离试剂盒(Qiagen)，从HAP1细胞提取总RNA。微阵列分析使用SurePrint G3 Human GE 8x60K Microarray(安捷伦)来进行。数据分析使用AgilentFeature Extraction软件(Agilent)来进行。在数据的绘图中，仅选择全部野生型克隆或缺失克隆中具有信号评价评分＝2的基因。将P值＜0.05、2倍变化＞1视为显著。

将pHY269(RBMX2基因座克隆)、pHY270(MMGT1基因座克隆)、或pHY263(用于制作hHY224细胞的带有IRES-GFP-2A-Puro组件的质粒)使用pJS039(以GAPDH区域的3’UTR为靶的gRNA表达载体)及pJS050(以pHY262的sgRNA(sg-A)位点为靶的gRNA表达载体)共转染于HAP1细胞。在转染后第2天，将细胞在添加了1ng/ml嘌呤霉素的IMDM培养基中培养～10天。HAP1细胞的一部分群形成二倍体，因此使用SH800Z(索尼生物)仅收集单倍体群。在为了长期保存而将细胞冷冻保存前，对单倍体细胞进行扩大培养，培养7天。将细胞株解冻，用通常的培养基培养5天后，应用MEGES。

将pHY271使用pJS067(以OCRL区域的下游为靶的gRNA表达载体)及pJS050(以pHY271的sg-A位点为靶的gRNA表达载体)共转染于HCT116。转染2天后，将细胞在McCoy’s5A培养基(10％ FBS、1％青霉素/链霉素、1ng/μL嘌呤霉素)中培养～10天。将单一集落扩大，在为了长期保存而将细胞冷冻保存前，另外进行7天培养。通过使用HY2223及HY2224引物的PCR来试验标记物的整合(补充表1)。将细胞储备体解冻，在应用MEGES前，在通常的培养基中培养7天。

将2×10

使用RNeasy Mini RNA分离试剂盒(Qiagen)从HAP1细胞中提取总RNA。将400ng的RNA用PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA eraser(宝生物)进行逆转录。定量PCR使用TB Green(商标)Premix Ex Taq

[表5]

[结果]

为了验证该实验平台的概念，尝试使人细胞株HAP1的含有次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1(HPRT1)基因的染色体X上的基因组区域缺失(图1b)。基于Online GEneEssentiality(OGEE)的数据库[REF]，HPRT1在特定的人细胞中被鉴定为必需基因，但作为与6-TG(Nature Reviews Genetics，6，507-512(2005))的负选择标记物来建立。这种情况下，如果HAP1细胞也同样，则不能使用HPRT1作为负选择标记物。在Blomen’s genetrapping

然后，使从HPRT1中缺失的区域朝向着丝粒方向和端粒方向这两个方向扩大，研究我们的平台能否用于本质性基因区和/或基因间区的鉴定(图2)。基于OGEE数据库，着丝粒方向的HPRT1起的第一个必需基因候补为ARHGAP36，它们之间存在22个潜在的非必需基因区和介于其间的非编码区(相当于图2b的gRNA L1位点与L2位点之间的3.12Mb的区域)。下一个必需基因候补为RBMX2。在ARHGAP36与RBMX2之间(对应于图2b的gRNA L3位点与L4位点之间的0.62Mb区域)存在3个非必需基因候补，大部分为基因间区。在此，将gRNA L1与L5之间的约4Mb的区域分离为4个部分(2个必需基因候补区域和2个非必需基因候补簇)，应用我们的平台研究必需基因候补和/或广大的基因间区中的哪一个是对于HAP1的生长所必需的(图2b)。

通过第2天的数字连接PCR确认，利用L1、L2、L3、L4、L5各自与R1的5个不同gRNA对以同等效率(0.3-1.1％)实现了靶区域的缺失。值得注意的是，在6-TG选择后，利用5个gRNA对中的4个gRNA对形成了数百个集落，但如果使L4/L5之间的区域缺失则生存细胞极端地消失。该数据表明，在L4与L5的gRNA靶位点之间存在的RBMX2基因对于HAP1的正常增殖很重要，处于其间的区域已缺失。另外，该结果与Blomen的基因捕获

继续进行了缺失向端粒方向的扩大(图2c)。第一个被OGEE支持的必需基因候补为SMIM10，此前未在HAP1细胞中验证过必需性。关于接下来的OGEE候补MMGT1，在Mair的CRISPR筛选中暗示了在HAP1细胞中是必需的，但是在Biomen的基因捕获中暗示了是非必需的。应当注意的是，在HPRT1与MMGT1之间的1.1Mb的区域(gRNA R1与R4位点之间)也存在30个非必需基因候补和其基因间序列。MEGES利用R2、R3、R4及R5各自与L4的5个不同gRNA对来诱导缺失。如在其第2天通过数字连接PCR检验的那样可知，诱导了全部靶区域的高效缺失。表明MMGT1为必需，但是包含SMIM10的gRNA的L4与R4位点之间的5.48Mb区域整体对于HAP1细胞的生长没有明显影响、可以缺失。

使用R4与L4的成对gRNA，在MEGES后，对经单克隆展开而得到的4种HAP1细胞克隆(hHY131、145、148、149；L4-R4缺失克隆)进行分析。利用使用碘化丙锭染色的流式细胞术确认得到的克隆为单倍体

[表6]

表6所示的数据是通过分析图2所示的克隆的基因型而得到的。将具有期望的基因缺损的细胞克隆作为具有缺失的细胞数来计数。

另外，评价了69个基因缺失对转录物组的影响(图3b)。该转录物组分析中，RBMX2和MMGT1几乎不存在由相邻的5.5Mb区域的缺失引起的转录水平的变化[图3c]，表明在该缺失区域中不存在这些基因的远端的顺式调节要素。

RBMX2基因和MMGT1基因如果没有远端的顺式控制要素，则细菌、酵母的基因大部分在基因组的设计及合成中如此，因此似乎可以作为紧凑且独立的基因单元来处理。为了对此进行验证，尝试将两个基因移植到不同的染色体位置。使用BAC-YAC载体克隆包括转录起始位点上游的～3kbp区域和多聚腺苷酸化(pA)位点下游的～3kbp区域的基因区整体(“挽救组件”)[图4a]。在闭环型pHY262载体上，在IRES序列与pA信号之间存在嘌呤霉素N-乙酰基转移酶(PNAT)的编码序列。将作为结果而得到的挽救载体转染于HAP1时，共转染gRNA/Cas9的2个不同载体，1个是靶向12号染色体上的GAPDH基因的3’UTR的gRNA，另一个是靶向挽救基因座载体上的IRES序列紧外侧的物质

为了拓展MEGES的范围，进行了下述试验：使用其它负选择标记物，在不同的人细胞株HCT116中，使HPRT1基因座以外的基因组区域缺失。由大肠癌男性患者建立的HCT116细胞中，X染色体为1条，因此HPRT1基因座为1个。单纯疱疹病毒胸苷激酶(TK)表达组件在编码TK的序列之后紧接着包含夹着2A肽的PNAT，这些在CMV启动子和SV40pA信号作用下表达[图6a]。将包含TK表达组件的质粒与gRNA/Cas9的2个不同载体共转染时，1个gRNA靶向染色体X上的HCT116的非必需基因OCRL(Nucleic Acid Research，2020，doi：10.1093/nar/gkaa884)的3’UTR，另1个gRNA靶向TK表达组件载体上的CMV启动子的紧上游

到目前为止，已经进行了对细胞增殖而言重要的基因组区域的筛选、鉴定、以及具有百万碱基对级别的靶基因组区域的缺失的细胞克隆的单离，为了进一步阐明靶区域的功能性意义，对MEGES的有用性和优点进行证实。但是，仅筛选必需区域时，需要事先整合负选择标记物，另外存在使用负选择的集落形成分析的通量低的问题。因此，代替负选择，我们考虑了包含多个时刻的数字连接PCR的MEGES的改良版。缺失了的区域对于细胞增殖必不可少或重要时，具有缺失了的区域的细胞的比例会随着细胞培养进行而减少。该比例的变化可以通过比较在gRNA/Cas9转染后在多个时间点使用数字连接PCR确定的缺失效率来进行评价。将该战略称为基于数字连接PCR的MEGES(dMEGES)。为了证实该概念，我们将dMEGES应用于HPRT1基因座(图7)。我们在利用2个gRNA对(R1-L4和R1-L5)进行切割后，在第2天和第17天进行数字连接PCR，对所期待的结果进行了证实。R1-L4被切割的细胞的比例在第2天至第17天几乎没有变化(1.8％至2.0％)，但R1-L5被切割的细胞的比例从1.0％大幅减少至0.2％。在此，对切割RBMX2基因座内侧的、与R1和L13不同的gRNA对开裂进行了试验，结果R1-L5的开裂从1.0％显著减少到0.2％。这也导致了具有缺失的细胞群的显著减少(从2.1％至0.6％)。这些数据与图2b的数据一致，表明了R1与L4之间的4.35Mb的区域不影响细胞增殖、可以使其缺失，而R1-L5的区域为RBMX2的本质性区域、因而不能使其缺失。

进而，对于X染色体，制作22个区域各自的具有缺失的细胞群，同样地进行分析(图8)。其结果是，如图8所示，表明区域7及区域16的缺失可能是细胞的增殖或生存所必需的。另外表明，区域1、9～15、及17～19可能含有对细胞的增殖或生存具有正影响的基因。目前为止的CRISPR筛选中，是被认为并非生存所必需的22个区域的缺失，根据本发明，可以灵敏度高地确定必需的染色体区域。

从而，本申请发明中，能够在不事先导入负选择标记物的情况下实施MEGES，这种情况下，可通过MEGES产生大规模基因组缺失，进而可确定细胞的生存所必需的基因所在的区域。在确定了生存所必需的基因的情况下，将其整合于其它染色体上，能够进一步扩大基因组的缺失。dMEGES可以为对于确定细胞的生存所必需的基因的方法和/或基因组的大规模缺失有用的技术。

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序列表

<110> 株式会社标志融合

<120> 使基因组DNA产生大规模缺失的方法及基因组DNA的分析方法

<130> PL19-9002WO

<150> JP 2020-216271

<151> 2020-12-25

<160> 388

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L1正向引物

<400> 1

caccgaataa ttgtgtagtt aagtc 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L1反向引物

<400> 2

aaacgactta actacacaat tattc 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L2正向引物

<400> 3

caccgttaat agcttgatat agcta 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L2反向引物

<400> 4

aaactagcta tatcaagcta ttaac 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L3正向引物

<400> 5

caccggggag agattatgct ttacg 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L3反向引物

<400> 6

aaaccgtaaa gcataatctc tcccc 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L4正向引物

<400> 7

caccgttctc agcaattgtg cggtc 25

<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> L4反向引物

<400> 8

aaacgaccgc acaattgctg agaac 25

<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> L5正向引物

<400> 9

caccgcatct agcactcccg gtaac 25

<210> 10

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> L5反向引物

<400> 10

aaacgttacc gggagtgcta gatgc 25

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L6正向引物

<400> 11

caccgttctc agcaattgtg cggtc 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L6反向引物

<400> 12

aaacgaccgc acaattgctg agaac 25

<210> 13

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> L7正向引物

<400> 13

caccgtgggg aagagctcac cgctc 25

<210> 14

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<212> DNA

<213> 人工序列

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aaacgagcgg tgagctcttc cccac 25

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<212> DNA

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<223> L8正向引物

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caccgatccc cattactagc tcgaa 25

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aaacttcgag ctagtaatgg ggatc 25

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<223> L9正向引物

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caccgatttc tatgaacaca cgtag 25

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<223> L9反向引物

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aaacctacgt gtgttcatag aaatc 25

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<223> L10正向引物

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caccggcatg gagtgaatac gactt 25

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aaacaagtcg tattcactcc atgcc 25

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<212> DNA

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<223> L11正向引物

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caccgcagag aaatgacgaa cgatt 25

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aaacaatcgt tcgtcatttc tctgc 25

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caccgagcac atttgcaacg tcacg 25

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<223> R1正向引物

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caccggacag cagtgagcgt agagt 25

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aaacactcta cgctcactgc tgtcc 25

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caccgcactt gatgcattaa tgccg 25

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caccggaggg agaaacaggt ccgtt 25

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caccgaacag aaaagtttac tgcga 25

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aaactcgcag taaacttttc tgttc 25

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aaactccgta gttgtagttg gcttc 25

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<223> R8正向引物

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caccggctgt gctattaaga tgcgc 25

<210> 40

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<223> R8反向引物

<400> 40

aaacgcgcat cttaatagca cagcc 25

<210> 41

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> R9正向引物

<400> 41

caccgccatg gactggaata gccgg 25

<210> 42

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> R9反向引物

<400> 42

aaacccggct attccagtcc atggc 25

<210> 43

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA#1正向引物

<400> 43

caccgagccc cagcaagagc acaag 25

<210> 44

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA#1反向引物

<400> 44

aaaccttgtg ctcttgctgg ggctc 25

<210> 45

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA#2正向引物

<400> 45

caccggagat cgagtgccgc atcac 25

<210> 46

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA#2反向引物

<400> 46

aaacgtgatg cggcactcga tctcc 25

<210> 47

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA#3正向引物

<400> 47

caccggggac tgcagtcaag tcgaa 25

<210> 48

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA#3反向引物

<400> 48

aaacttcgac ttgactgcag tcccc 25

<210> 49

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY1674

<400> 49

atatggccac aaccgccacc atgggtaccg tgagcaaggg 40

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<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY1675

<400> 50

gacgactgag cgcgggatct cttgtacagc tcgtccatgc c 41

<210> 51

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> JS214

<400> 51

gatcgagtgc cgcatcaccg gcaattgacg cgtgctcctc 40

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY1673

<400> 52

ggtggcggtt gtggccatat 20

<210> 53

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> JS210

<400> 53

aaactcatca atgtatctta attgcgttgc gctcactgcc 40

<210> 54

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> JS211

<400> 54

gtgatgcggc actcgatctc cctgatgcgg tattttctcc 40

<210> 55

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2669

<400> 55

ccgcgctcag tcgtccaatt ctgccgtgga cggcaccgcc ggacccggct ccaccggatc 60

tcgcgagggc agaggaagtc ttct 84

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<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> JS218

<400> 56

taagatacat tgatgagttt ggacaaac 28

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<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY1498

<400> 57

gaatactcat tttagcttcc ttagctcctg aaaatctcg 39

<210> 58

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY1499

<400> 58

gcatcgcaaa ctgcacccgg tgccgggcag ccacatcca 39

<210> 59

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY1496

<400> 59

gcccgggcgc atgcgggccg gatcagacta tcagcgtgag 40

<210> 60

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY1497

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ggaagctaaa atgagtattc aacatttccg tgt 33

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY1569

<400> 61

gtgggatcca gacttcgaat tcatgtcgaa agctacatat aagga 45

<210> 62

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY1570

<400> 62

tccggcccgc atgcgcccgg gccggccctg atgcggtatt ttctcctta 49

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<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY1567

<400> 63

aactcatcaa tgtatcttag cccctacaac aactaagaaa atgg 44

<210> 64

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY1568

<400> 64

gacatgaatt cgaagtctgg atcccactat ttataccatg ggagg 45

<210> 65

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2670

<400> 65

atatggccac aaccgccacc atgaccgagt acaagc 36

<210> 66

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY1419

<400> 66

gctaagatac attgatgagt ttggaca 27

<210> 67

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> JS213

<400> 67

gtggcggttg tggccatatt atcatcgtgt ttttcaaagg 40

<210> 68

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY1571

<400> 68

atcgtctttc cctcgctatc ac 22

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY1572

<400> 69

ccactattta taccatggga ggcg 24

<210> 70

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY1587

<400> 70

tcccatggta taaatagtgg ggcttataaa tgcagatcct ttac 44

<210> 71

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY1578

<400> 71

ctgccaagaa ggagaacaga g 21

<210> 72

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY1579

<400> 72

aatacctctg ctgaacctac ca 22

<210> 73

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY1580

<400> 73

gattgccttt gctcactaac ct 22

<210> 74

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY1581

<400> 74

ggtcgtagtt tgctttcttt gtt 23

<210> 75

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<400> 75

cctttggatt tcccagtttt ct 22

<210> 76

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY1583

<400> 76

tggccttgaa ttagtctttg ct 22

<210> 77

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY1427

<400> 77

acgacgcatc tcaaattcac agcatttaaa aaacataatt attt 44

<210> 78

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY1428

<400> 78

gtgaatttga gatgcgtcgt aactattttt gtatctaaaa cttc 44

<210> 79

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY1429

<400> 79

gtgctagagc gagaaaggtt cgtgcaaaca atatccagga tatc 44

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<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<400> 80

gaacctttct cgctctagca cagtatgtat cctgaacttt ggtt 44

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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agccctaagt gtgtaactgg aa 22

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY1585

<400> 82

caacaccgag tagcgtttga tt 22

<210> 83

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY1589

<400> 83

cttatatgta gctttcgaca tggcgggtga gcagcctcta at 42

<210> 84

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY1573

<400> 84

catgtcgaaa gctacatata agga 24

<210> 85

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY1574

<400> 85

gcttcaaacc gctaacaata cc 22

<210> 86

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HK1294

<400> 86

taagtacctt gggttcccac tatttatacc atgggaggcg tca 43

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HK1295

<400> 87

atggtataaa tagtgggaac ccaaggtact tatttgaatg atacagtc 48

<210> 88

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HK1296

<400> 88

gctgcgcagc ggaaaaggcg gcgtg 25

<210> 89

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HK1297

<400> 89

ctttcgcctc ttcgtttatg act 23

<210> 90

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HK1298

<400> 90

ccagttcttc tgttgttggt gtt 23

<210> 91

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HK1299

<400> 91

atgtaaggga aataaagcca aca 23

<210> 92

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HK1300

<400> 92

agagggatgg aaggagtgaa ag 22

<210> 93

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HK1301

<400> 93

gaggcaatga agaggtagag aga 23

<210> 94

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HK1302

<400> 94

tcagagaaat gatgaaacaa gacag 25

<210> 95

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HK1303

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atcactgcgt cgttaagatt tgt 23

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY1660

<400> 96

ggactatcct aagcaagcat tctttaggga gttacagaga ataatcacc 49

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY1669

<400> 97

agaatgcttg cttaggatag tcc 23

<210> 98

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY1670

<400> 98

agatattttc gagagcgcta gc 22

<210> 99

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY1663

<400> 99

gctagcgctc tcgaaaatat ctatgattgt ctcaccctgt ttttggt 47

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HK1304

<400> 100

cttgccccca ctcccctttc taagaa 26

<210> 101

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HK1305

<400> 101

gtagctttcg acatttaatg tacacacatt tttaaaaacc atttgggag 49

<210> 102

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HK1306

<400> 102

ttttaaaaat gtgtgtacat taaatgtcga aagctacata taaggaa 47

<210> 103

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2639

<400> 103

tcactgcccg ctttccagtc 20

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<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2640

<400> 104

tgccggtgat gcggcactcg atctccctga tgcggtattt tctcc 45

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<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2641

<400> 105

cgagtgccgc atcaccggca attgacgcgt gctcaattcg ataatcatat tgtgacgtac 60

gttaaagata 70

<210> 106

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2642

<400> 106

cccctcgata tacagaccga taaaacacat gcgtcaattt tacacatgat tatctttaac 60

gtacgtcaca 70

<210> 107

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2643

<400> 107

tcggtctgta tatcgagggg gcagagcgca catcgcccac agtcc 45

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<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2644

<400> 108

gctggcgtgc tggtggcagg ggtagctggc catggtggcg ata 43

<210> 109

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2645

<400> 109

gccagctacc cctgccacca gcacgccagc gccttcgacc aggc 44

<210> 110

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2646

<400> 110

tcctgctgtc ttctgggtct cagggcggtt cttctgttgc tgtggcctct gcttctggcg 60

gcctggtcga aggcgctggc 80

<210> 111

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2647

<400> 111

agacccagaa gacagcagga ggccaccgag gtgagactgg agcagaagat gcccaccctg 60

ctgagagtgt acatcgacgg 80

<210> 112

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2648

<400> 112

tctctgctgc ccagggccac cagcagctgg gtggtggtgg tcttgcccat gccgtggggg 60

ccgtcgatgt acactctcag 80

<210> 113

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2649

<400> 113

gtggccctgg gcagcagaga cgacatcgtg tacgtgcccg agcccatgac ctactggcag 60

gtgctgggcg ccagcgagac 80

<210> 114

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2650

<400> 114

tcgccggcgc tgatctcgcc ctggtccagt ctgtgctggg tggtgtagat gttggcgatg 60

gtctcgctgg cgcccagcac 80

<210> 115

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2651

<400> 115

ggcgagatca gcgccggcga cgccgccgtg gtgatgacca gcgcccagat caccatgggc 60

atgccctacg ccgtgaccga 80

<210> 116

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2652

<400> 116

gccgggggcg gggcgtggct gctgccggcc tcgccgccca cgtggggggc cagcacggcg 60

tcggtcacgg cgtagggcat 80

<210> 117

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2653

<400> 117

agccacgccc cgcccccggc cctgaccatc ttcctggaca gacaccccat cgccttcatg 60

ctgtgctacc ccgccgccag 80

<210> 118

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2654

<400> 118

ggggggatca gggccacgaa ggccagcacg gcctgggggg tcatgctgcc catcaggtat 60

ctggcggcgg ggtagcacag 80

<210> 119

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2655

<400> 119

ttcgtggccc tgatcccccc caccctgccc ggcaccaaca tcgtgctggg cgccctgccc 60

gaggacagac acatcgacag 80

<210> 120

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2656

<400> 120

ctgatggcgg ccagcatggc caggtccagt ctctcgccgg gtctctgtct cttggccagt 60

ctgtcgatgt gtctgtcctc 80

<210> 121

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2657

<400> 121

gccatgctgg ccgccatcag aagagtgtac ggcctgctgg ccaacaccgt gagatacctg 60

cagggcggcg gcagctggtg 80

<210> 122

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2658

<400> 122

ctctggggct cggcgccctg ggggggcacg gcggtgccgc tcagctggcc ccagtcctcc 60

caccagctgc cgccgccctg 80

<210> 123

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2659

<400> 123

cagggcgccg agccccagag caacgccggc cccagacccc acatcggcga caccctgttc 60

accctgttca gagcccccga 80

<210> 124

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2660

<400> 124

gccagcacgt ccagggccca ggcgaacacg ttgtacaggt cgccgttggg ggccagcagc 60

tcgggggctc tgaacagggt 80

<210> 125

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2661

<400> 125

tgggccctgg acgtgctggc caagagactg agacccatgc acgtgttcat cctggactac 60

gaccagagcc ccgccggctg 80

<210> 126

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2662

<400> 126

ccgggggtgg tcacgtgggt ctgcaccatg ccgctggtca gctgcagcag ggcgtctctg 60

cagccggcgg ggctctggtc 80

<210> 127

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2663

<400> 127

gccagctacc cctgccacca gcacgccagc gccttcgacc aggc 44

<210> 128

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2664

<400> 128

gttggcctcg cccatctctc tggcgaaggt tctggccagg tcgcagatgg tggggatgct 60

gccgggggtg gtcacgtggg 80

<210> 129

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2665

<400> 129

gagagatggg cgaggccaac gagggcagag gaagtcttct 40

<210> 130

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2666

<400> 130

tgagtcaaaa tgacgcatga gacttcgttc ctgtgaggac 40

<210> 131

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2667

<400> 131

tcatgcgtca ttttgactca cgcggtcgtt atagttcaaa atcagtgaca cttaccgcat 60

<210> 132

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2668

<400> 132

ggaaagcggg cagtgaagct cccgtgaggc gtgcttgtca atgcggtaag tgtcactgat 60

<210> 133

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for L1-R1（用于L1-R1的第1步正向）

<400> 133

tggtaaggat gagggaaaga tg 22

<210> 134

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for L1-R1（用于L1-R1的第1步反向）

<400> 134

gccaagtagc aaagagcgtg t 21

<210> 135

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for L1-R1（用于L1-R1的第2步正向）

<400> 135

atataagaag gacgaggaga aatg 24

<210> 136

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for L1-R1（用于L1-R1的第2步反向）

<400> 136

ggccaatatg tgctttagga a 21

<210> 137

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for L2-R1

<400> 137

tggcatattt gttaatgttc tgct 24

<210> 138

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for L2-R1

<400> 138

gccaagtagc aaagagcgtg t 21

<210> 139

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for L2-R1

<400> 139

ataagaccaa cttcagacac cag 23

<210> 140

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for L2-R1

<400> 140

ggccaatatg tgctttagga a 21

<210> 141

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for L3-R1

<400> 141

aaagagatca tggggtagca aa 22

<210> 142

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for L3-R1

<400> 142

gccaagtagc aaagagcgtg t 21

<210> 143

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for L3-R1

<400> 143

gtagccaaga gggctgagag t 21

<210> 144

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for L3-R1

<400> 144

ggccaatatg tgctttagga a 21

<210> 145

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for L4-R1

<400> 145

cagacttgga tgtggacctt g 21

<210> 146

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for L4-R1

<400> 146

gccaagtagc aaagagcgtg t 21

<210> 147

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for L4-R1

<400> 147

gatcatagca aaagctcagt tgtc 24

<210> 148

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for L4-R1

<400> 148

ggccaatatg tgctttagga a 21

<210> 149

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for L5-R1

<400> 149

cccatcctgt gcttcttctc t 21

<210> 150

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for L5-R1

<400> 150

gccaagtagc aaagagcgtg t 21

<210> 151

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for L5-R1

<400> 151

gcactcatgt gctctggtct t 21

<210> 152

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for L5-R1

<400> 152

ggccaatatg tgctttagga a 21

<210> 153

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for L4-R2

<400> 153

cagacttgga tgtggacctt g 21

<210> 154

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for L4-R2

<400> 154

tcctgaacca caccttggac 20

<210> 155

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for L4-R2

<400> 155

gatcatagca aaagctcagt tgtc 24

<210> 156

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for L4-R2

<400> 156

acgagaggca gctctattca tc 22

<210> 157

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for L4-R3

<400> 157

cagacttgga tgtggacctt g 21

<210> 158

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for L4-R3

<400> 158

ttgtaacctg tgttttcatg ttttt 25

<210> 159

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for L4-R3

<400> 159

gatcatagca aaagctcagt tgtc 24

<210> 160

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for L4-R3

<400> 160

tggcacaaag gagagaataa ca 22

<210> 161

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for L4-R4

<400> 161

cagacttgga tgtggacctt g 21

<210> 162

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for L4-R4

<400> 162

gcttgctagg attttggttt tt 22

<210> 163

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for L4-R4

<400> 163

gatcatagca aaagctcagt tgtc 24

<210> 164

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for L4-R4

<400> 164

ccacagattc attaaaagga ggag 24

<210> 165

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for L4-R5

<400> 165

cagacttgga tgtggacctt g 21

<210> 166

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for L4-R5

<400> 166

cacttctggg gtcacttagg aa 22

<210> 167

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for L4-R5

<400> 167

gatcatagca aaagctcagt tgtc 24

<210> 168

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for L4-R5

<400> 168

ctagctgtac cttgcacctt tg 22

<210> 169

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for L4-R6

<400> 169

cagacttgga tgtggacctt g 21

<210> 170

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for L4-R6

<400> 170

ccaaggtacc acttaatgct tca 23

<210> 171

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for L4-R6

<400> 171

gatcatagca aaagctcagt tgtc 24

<210> 172

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for L4-R6

<400> 172

tactcggcag gtagtaaact tct 23

<210> 173

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for L6-R1

<400> 173

ctccctggct tttgtgttgg 20

<210> 174

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for L6-R1

<400> 174

gccaagtagc aaagagcgtg t 21

<210> 175

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for L6-R1

<400> 175

ctccctggct tttgtgttgg 20

<210> 176

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for L6-R1

<400> 176

ggccaatatg tgctttagga a 21

<210> 177

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for L7-R1

<400> 177

caccgaccag accctgggat cgtcc 25

<210> 178

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for L7-R1

<400> 178

gccaagtagc aaagagcgtg t 21

<210> 179

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for L7-R1

<400> 179

ctgtggagat tagtcagccc aa 22

<210> 180

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for L7-R1

<400> 180

ggccaatatg tgctttagga a 21

<210> 181

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for L4-R7

<400> 181

cagacttgga tgtggacctt g 21

<210> 182

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for L4-R7

<400> 182

ctgctggacg ttttggtaat gc 22

<210> 183

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for L4-R7

<400> 183

gatcatagca aaagctcagt tgtc 24

<210> 184

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for L4-R7

<400> 184

ccagctatcc acgccattta g 21

<210> 185

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for L4-R8

<400> 185

cagacttgga tgtggacctt g 21

<210> 186

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for L4-R8

<400> 186

ggaagaaggc aaatcaaaag gtc 23

<210> 187

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for L4-R8

<400> 187

gatcatagca aaagctcagt tgtc 24

<210> 188

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for L4-R8

<400> 188

gcttgactct tctaattctc actgc 25

<210> 189

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for L8-R9

<400> 189

tttgtggttc tggcatattg gg 22

<210> 190

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for L8-R9

<400> 190

atgcctcctt gacttccatc ag 22

<210> 191

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for L8-R9

<400> 191

aaaagcaaag cagaattccg ga 22

<210> 192

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for L8-R9

<400> 192

taaagtgacg agcaagcaag ga 22

<210> 193

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for L9-R9

<400> 193

taattgaaga agccctcgac cc 22

<210> 194

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for L9-R9

<400> 194

atgcctcctt gacttccatc ag 22

<210> 195

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for L9-R9

<400> 195

acccctttta ctatccacag gc 22

<210> 196

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for L9-R9

<400> 196

taaagtgacg agcaagcaag ga 22

<210> 197

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for L10-R9

<400> 197

atgattgtcc cagtctttcc cc 22

<210> 198

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for L10-R9

<400> 198

atgcctcctt gacttccatc ag 22

<210> 199

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for L10-R9

<400> 199

acagggaagt tgcaaagaca aa 22

<210> 200

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for L10-R9

<400> 200

taaagtgacg agcaagcaag ga 22

<210> 201

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for L11-R9

<400> 201

aggcagttaa ggaaaagtac cca 23

<210> 202

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for L11-R9

<400> 202

atgcctcctt gacttccatc ag 22

<210> 203

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for L11-R9

<400> 203

tctgatctat tcctgggctg gt 22

<210> 204

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for L11-R9

<400> 204

taaagtgacg agcaagcaag ga 22

<210> 205

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for L12-R9

<400> 205

aaataaggct gggcatggtt g 21

<210> 206

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for L12-R9

<400> 206

atgcctcctt gacttccatc ag 22

<210> 207

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for L12-R9

<400> 207

gcaaaccaaa accacgagat ac 22

<210> 208

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for L12-R9

<400> 208

taaagtgacg agcaagcaag ga 22

<210> 209

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for GPR119

<400> 209

gcccttaccg tcttagccat ca 22

<210> 210

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for GPR119

<400> 210

cgacatgctc aagattgcct cc 22

<210> 211

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for GPR119

<400> 211

ctgctgatct agttggggct cc 22

<210> 212

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for GPR119

<400> 212

gctgtatttc accctcactt cgt 23

<210> 213

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for RBMX2

<400> 213

cactgaagca tcgcctgtct tg 22

<210> 214

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for RBMX2

<400> 214

atgtcgagtg gctgtacaag gt 22

<210> 215

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for RBMX2

<400> 215

tcactgaagc atcgcctgtc tt 22

<210> 216

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for RBMX2

<400> 216

ggagaacaac cttggcagca g 21

<210> 217

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for DENND10P1

<400> 217

gaaaggtccc aagtcaaagg aa 22

<210> 218

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for DENND10P1

<400> 218

gggtcagaaa ccacaccaag 20

<210> 219

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for DENND10P1

<400> 219

ccagccctac atgtgttcag ga 22

<210> 220

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for DENND10P1

<400> 220

ccgccacaac cccatatgta ga 22

<210> 221

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for ENOX2,LOC105373338

<400> 221

aagccagttt tcagcacgaa tg 22

<210> 222

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for ENOX2,LOC105373338

<400> 222

aacagagagg atggaggttt gg 22

<210> 223

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for ENOX2,LOC105373338

<400> 223

ccaagagccc gagactgatg aa 22

<210> 224

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for ENOX2,LOC105373338

<400> 224

ttcccctctg gccttcttac ag 22

<210> 225

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for LINC01201,ARHGAP36

<400> 225

tcctctagaa cggaccagtg at 22

<210> 226

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for LINC01201,ARHGAP36

<400> 226

cgaagggagg cagagacaca c 21

<210> 227

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for LINC01201,ARHGAP36

<400> 227

tcctgctcac attcttggtc ct 22

<210> 228

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for LINC01201,ARHGAP36

<400> 228

acccagctaa gagtgtttcg gt 22

<210> 229

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for IGSF1

<400> 229

acattacacc caggaagagc gg 22

<210> 230

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for IGSF1

<400> 230

aggtgccctt actgagtcca at 22

<210> 231

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for IGSF1

<400> 231

tggatatgag tgcggcagat gt 22

<210> 232

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for IGSF1

<400> 232

ggatctgggt ccgggctaat tt 22

<210> 233

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for OR13H1

<400> 233

tcaaacgagt gtctccttgg ct 22

<210> 234

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for OR13H1

<400> 234

tcagggtagg acttggactg ag 22

<210> 235

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for OR13H1

<400> 235

aatttacctc agcacattgt tggg 24

<210> 236

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for OR13H1

<400> 236

caacataact ttccttattg cccgt 25

<210> 237

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for FIRRE

<400> 237

cactgttggc accgtttaga tttt 24

<210> 238

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for FIRRE

<400> 238

tgaccacgca caaacagatg ag 22

<210> 239

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for FIRRE

<400> 239

tgcacaaatt cttcaacacc acc 23

<210> 240

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for FIRRE

<400> 240

gtattcgtct ctctccccgc c 21

<210> 241

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for MST4

<400> 241

ggggtgtggt atgggacttc aa 22

<210> 242

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for MST4

<400> 242

cccctttcct ccatcctagc ac 22

<210> 243

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for MST4

<400> 243

tctaggtgaa gcatactcca gtgt 24

<210> 244

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for MST4

<400> 244

aggaggcaat tctataggca agct 24

<210> 245

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for FRMD7

<400> 245

cgctattctc cctcctgtta caca 24

<210> 246

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for FRMD7

<400> 246

tgtttacgtg tggcagtgtt gt 22

<210> 247

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for FRMD7

<400> 247

aagccctcat tgtcacgatg tt 22

<210> 248

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for FRMD7

<400> 248

acctcgtacc agtgcttcat cc 22

<210> 249

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for RAP2C,RAP2C-AS1,MBNL3

<400> 249

ttcaccctga ctgacttttg ct 22

<210> 250

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for RAP2C,RAP2C-AS1,MBNL3

<400> 250

tgggactgac atttaaaacg cct 23

<210> 251

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for RAP2C,RAP2C-AS1,MBNL3

<400> 251

acgaaactca gttgaaccga agc 23

<210> 252

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for RAP2C,RAP2C-AS1,MBNL3

<400> 252

agtggggaac agaagtatat gtgct 25

<210> 253

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for HS6ST2,HS6ST2-AS1

<400> 253

gtgagtctgg tttggctttc gg 22

<210> 254

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for HS6ST2,HS6ST2-AS1

<400> 254

tcagacccat ttccagagcc ag 22

<210> 255

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for HS6ST2,HS6ST2-AS1

<400> 255

ttctacagct cggtaagatt cacc 24

<210> 256

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for HS6ST2,HS6ST2-AS1

<400> 256

acaacctctc tgtcatgcct ga 22

<210> 257

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for USP26

<400> 257

aacgcctatc ctcctgcatc tg 22

<210> 258

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for USP26

<400> 258

actcagcagt gtgacggtat ga 22

<210> 259

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for USP26

<400> 259

agctatggga ttgaggtgtc tgt 23

<210> 260

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for USP26

<400> 260

tcaaacagtg cccgaaaatc ca 22

<210> 261

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for TFDP3

<400> 261

cccaaaagtc atgcccatcc ac 22

<210> 262

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for TFDP3

<400> 262

cctgtgccgt ctttccatga ag 22

<210> 263

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for TFDP3

<400> 263

tcgcaatgtt ggtcaggtca ct 22

<210> 264

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for TFDP3

<400> 264

gcctctcaga accagcattc ct 22

<210> 265

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for GPC4

<400> 265

ttgcccgagt gttgacagct at 22

<210> 266

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for GPC4

<400> 266

tctggagaga cgtggaggtg at 22

<210> 267

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for GPC4

<400> 267

tctggacacc tagttctccc ct 22

<210> 268

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for GPC4

<400> 268

aagcaaacca gggtcccttc tt 22

<210> 269

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for GPC3,GPC3-AS1

<400> 269

cagggaggtg ggtttcaagg aa 22

<210> 270

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for GPC3,GPC3-AS1

<400> 270

gtgtgcttct tcttcctggt gc 22

<210> 271

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for GPC3,GPC3-AS1

<400> 271

agttgtaaag agagaccaga ccagg 25

<210> 272

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for GPC3,GPC3-AS1

<400> 272

actggcctat gatctggatg tgg 23

<210> 273

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for microRNAs

<400> 273

atcctccttt cttccacagg cc 22

<210> 274

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for microRNAs

<400> 274

actgccctaa atgccccttc tg 22

<210> 275

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for microRNAs

<400> 275

gctgatcagg aatgtcgcca ac 22

<210> 276

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for microRNAs

<400> 276

aggccttggc catgtaaaag tg 22

<210> 277

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for CCDC160

<400> 277

cagatagcag caagggaatg ga 22

<210> 278

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for CCDC160

<400> 278

tgacttcttt ggcttgctgg ag 22

<210> 279

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for CCDC160

<400> 279

cagatattgg aagaggtgcc tgga 24

<210> 280

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for CCDC160

<400> 280

gagcacattt ccaacctcgg t 21

<210> 281

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for PHF6

<400> 281

gggttaccgc ttgctaagga ct 22

<210> 282

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for PHF6

<400> 282

tggtactgag gtgctatggt agt 23

<210> 283

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for PHF6

<400> 283

cttgacagca cacctcctct ct 22

<210> 284

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for PHF6

<400> 284

acttgacaaa cgtgatctta aggga 25

<210> 285

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for HPRT1

<400> 285

cctttgggcg gattgttgtt taa 23

<210> 286

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for HPRT1

<400> 286

tttgtagctc cgccaaccca tt 22

<210> 287

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for HPRT1

<400> 287

actggaaaag caaaatacaa agcct 25

<210> 288

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for HPRT1

<400> 288

ggaacacgtg taagctagat ggc 23

<210> 289

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for microRNAs-2

<400> 289

ccttatgtca ggggttcatg ct 22

<210> 290

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for microRNAs-2

<400> 290

tggggaaaag aggctatcag ga 22

<210> 291

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for microRNAs-2

<400> 291

caatgcgtct tgaggccctg 20

<210> 292

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for microRNAs-2

<400> 292

tctgagttgt ggtataaagg tgacc 25

<210> 293

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for MIR503HG,microRNAs

<400> 293

tggaggaaaa tctaggcaca ctg 23

<210> 294

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for MIR503HG,microRNAs

<400> 294

gaaatcccca ttctgctccc gc 22

<210> 295

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for MIR503HG,microRNAs

<400> 295

agtttaaggg ccacgtctgt ct 22

<210> 296

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for MIR503HG,microRNAs

<400> 296

ggcccctaga agtttcccag tt 22

<210> 297

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for LINC00629

<400> 297

ttcatgttcc caggtggcaa gg 22

<210> 298

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for LINC00629

<400> 298

catccaagga caagaggcag gg 22

<210> 299

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for LINC00629

<400> 299

actcgattct ctccctacac tgg 23

<210> 300

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for LINC00629

<400> 300

tttcaaagtg gggtgaggag gt 22

<210> 301

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for PLAC1

<400> 301

agggacctgg gtatgctctt ct 22

<210> 302

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for PLAC1

<400> 302

gatcctcctc acctctgcgt tt 22

<210> 303

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for PLAC1

<400> 303

ggacccaatc atatcatctg tgtga 25

<210> 304

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for PLAC1

<400> 304

gttctgtttt gggttcatct tgagg 25

<210> 305

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for FAM122B,FAM122C

<400> 305

ggcaaccaca aaccccaaat ct 22

<210> 306

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for FAM122B,FAM122C

<400> 306

ggtggctggg agtagaagta gc 22

<210> 307

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for FAM122B,FAM122C



<400> 307

agttgccatg cctgttcctt tc 22

<210> 308

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for FAM122B,FAM122C



<400> 308

cccaaattaa gtactacaag tggcg 25

<210> 309

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for MOSPD1

<400> 309

gcagggaggg gcttggaaga 20

<210> 310

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for MOSPD1

<400> 310

cactttgatt gctaggggtc atgt 24

<210> 311

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for MOSPD1

<400> 311

tgacttaggc tcctcacatg gt 22

<210> 312

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for MOSPD1

<400> 312

aggatgcttc tgagtgacac ct 22

<210> 313

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for LINC02243

<400> 313

ccactggcat ttctaccacc ca 22

<210> 314

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for LINC02243

<400> 314

cagcacagca gttccatgtc ac 22

<210> 315

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for LINC02243

<400> 315

ccccagtccc attatctgcc tt 22

<210> 316

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for LINC02243

<400> 316

tgcatcgtca caggcagtaa ga 22

<210> 317

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for SMIM10

<400> 317

tgattctcaa cgtccacctg ca 22

<210> 318

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for SMIM10

<400> 318

gggagatttg cctgctgtct ga 22

<210> 319

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for SMIM10

<400> 319

catccctctg tcccacggtc 20

<210> 320

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for SMIM10

<400> 320

caactgttca aaaccatgcc aca 23

<210> 321

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for RLT8B

<400> 321

cctgctggct gacttctcac at 22

<210> 322

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for RLT8B

<400> 322

ctgttacctt cagcgagacc ca 22

<210> 323

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for RLT8B

<400> 323

cagctgttca ccaataatct gtgtg 25

<210> 324

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for RLT8B

<400> 324

agacgactac atcatgctgc cc 22

<210> 325

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for RLT8C

<400> 325

ctttctggcc gagatgaagc ga 22

<210> 326

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for RLT8C

<400> 326

tctgtcggtg ggatgcgatg 20

<210> 327

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for RLT8C

<400> 327

tgcagctgat aaaggccctc c 21

<210> 328

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for RLT8C

<400> 328

ccagcccaga tacctccgag 20

<210> 329

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for RLT8A

<400> 329

agtctggagg agtggaggtg g 21

<210> 330

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for RLT8A

<400> 330

tctccaacga cgccctgaag 20

<210> 331

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for RLT8A

<400> 331

ctctggggat ggggaggaaa tg 22

<210> 332

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for RLT8A

<400> 332

ttccctttcc cgagacgttt ga 22

<210> 333

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for SMIM0L2B

<400> 333

aaatggggat agcaggtgag gg 22

<210> 334

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for SMIM0L2B

<400> 334

gggaatctgg ggatctcgct tt 22

<210> 335

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for SMIM0L2B

<400> 335

caaggtcagg ggttctcagg ag 22

<210> 336

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for SMIM0L2B

<400> 336

tgacagagga aaccgaggct tc 22

<210> 337

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for ETDB,SMIM10L2B-AS1

<400> 337

cccaagtgac agagaggtga ga 22

<210> 338

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for ETDB,SMIM10L2B-AS1

<400> 338

gccagggtag ttgagggttc tg 22

<210> 339

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for ETDB,SMIM10L2B-AS1



<400> 339

tgggaacgta atcacagtgg ct 22

<210> 340

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for ETDB,SMIM10L2B-AS1

<400> 340

catggcggac aaagttgctg at 22

<210> 341

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for CT55

<400> 341

aggggttctc tgccttcctt tg 22

<210> 342

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for CT55

<400> 342

ttcctctgtg tgtccccttg tc 22

<210> 343

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for CT55

<400> 343

tcaccaacat gatgagtagc acct 24

<210> 344

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for CT55

<400> 344

ggtcccatgc cacagtgtct 20

<210> 345

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for ZNF75D,ETDA,ETDC,ZNF449

<400> 345

cagctcctgt ccccgtttcg 20

<210> 346

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for ZNF75D,ETDA,ETDC,ZNF449

<400> 346

tgacgcattg aatctcacag ga 22

<210> 347

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for ZNF75D,ETDA,ETDC,ZNF449

<400> 347

gtttcaagtt ccagccggtg ag 22

<210> 348

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for ZNF75D,ETDA,ETDC,ZNF449

<400> 348

tgagccttgg agtaactgga gc 22

<210> 349

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for LOC100506790

<400> 349

tgtttggtaa tcaggggagg gt 22

<210> 350

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for LOC100506790

<400> 350

agctgccttc ttctcacctc tg 22

<210> 351

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for LOC100506790

<400> 351

accctattga gtcctgaacc cg 22

<210> 352

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for LOC100506790

<400> 352

tcacacatgg ggctgtatag ga 22

<210> 353

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for SMIM10L2A

<400> 353

atctgctcct gtccctgctt tt 22

<210> 354

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for SMIM10L2A

<400> 354

gtccaggtca agtcggttct ca 22

<210> 355

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for SMIM10L2A

<400> 355

cagatgtggc cctttcaaac cc 22

<210> 356

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for SMIM10L2A

<400> 356

agaacaagca gctacctctc gg 22

<210> 357

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for INTS6L,ISTN6L-AS1

<400> 357

tccctcccct agtcctgtca tc 22

<210> 358

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for INTS6L,ISTN6L-AS1

<400> 358

gttcatagag gcggacgtgt ct 22

<210> 359

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for INTS6L,ISTN6L-AS1

<400> 359

cattcgaact gcttccaagt cct 23

<210> 360

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for INTS6L,ISTN6L-AS1

<400> 360

ggggtcgcgt aggaaaggag 20

<210> 361

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for SAGEP2

<400> 361

gcgagactaa ttgagccctc ct 22

<210> 362

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for SAGEP2

<400> 362

ccactccatt ccctaccctt gg 22

<210> 363

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for SAGEP2

<400> 363

gtatgttttg tcccatcctc ccc 23

<210> 364

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for SAGEP2

<400> 364

taacgcgggt cccatccatt tc 22

<210> 365

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for CT45A1,2,3,5,6,7,8,9,10

<400> 365

cctgagtccc accataggct ta 22

<210> 366

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for CT45A1,2,3,5,6,7,8,9,10

<400> 366

cgccacaact tcactgccat tt 22

<210> 367

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for CT45A1,2,3,5,6,7,8,9,10

<400> 367

gcacatttcc cacaactccc ag 22

<210> 368

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for CT45A1,2,3,5,6,7,8,9,10

<400> 368

agacagagtt cccaaggtca cg 22

<210> 369

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for SAGE1

<400> 369

gtctttggtg gaaactgtgc ca 22

<210> 370

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for SAGE1

<400> 370

cactcacctt gctgcttcct tg 22

<210> 371

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for SAGE1

<400> 371

acaggacatt gtatgccacc ca 22

<210> 372

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for SAGE1

<400> 372

ggccagggat taggaggaac aa 22

<210> 373

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for MMGT1

<400> 373

cccactcccc tttctaagaa cact 24

<210> 374

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for MMGT1

<400> 374

tgaccttgcc ctgtccaata aat 23

<210> 375

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for MMGT1

<400> 375

tgcatacatc atctttcttg cccc 24

<210> 376

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for MMGT1

<400> 376

agcatcttcc tggttgtatg tgg 23

<210> 377

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP forward for SLC9A6

<400> 377

ttttgtgtgc taggggaggg ag 22

<210> 378

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1st STEP reverse for SLC9A6

<400> 378

aacttctgac gacaaagcct gc 22

<210> 379

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP forward for SLC9A6

<400> 379

tggttgcact ctgtagactg ga 22

<210> 380

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2nd STEP reverse for SLC9A6

<400> 380

ctgactttgg tgcagtgtgg aa 22

<210> 381

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HK1338

<400> 381

gcgaacccga ggagatga 18

<210> 382

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HK1339

<400> 382

agatccaggc gctgtcctt 19

<210> 383

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HK1375

<400> 383

ccttcggata cagcaaattc tt 22

<210> 384

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HK1376

<400> 384

gcagggagga gtgttttata cc 22

<210> 385

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2671

<400> 385

cactgtgttg gcgtacaggt ctt 23

<210> 386

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2672

<400> 386

ctgaggcact cttccagcct tc 22

<210> 387

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2223

<400> 387

acattgcatt agtctccctt tcac 24

<210> 388

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HY2224

<400> 388

aattgagttg ttttgttgcc tgaa 24