一种屋尘螨I类变应原pro-Der p 1重组蛋白及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种屋尘螨I类变应原pro-Der p 1重组蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

尘螨、花粉和动物毛发等是引起过敏性疾病的主要过敏原，尤其是尘螨，在人们居住的环境中是一种重要过敏原。目前常见尘螨包括两种，一种是屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)，另一种是粉尘螨(Dermatophagoides farinae)。据报道，约60％～80％的过敏性疾病患者对屋尘螨过敏。屋尘螨的分泌物、排泄物以及虫体死亡后的降解产物都能成为过敏原。研究表明，屋尘螨粗提物中含有多种成分可与人血清IgE抗体结合，但患者的发病原因可能只与其中的某种或某些成分有关，这些成分叫做“组分”。就屋尘螨的组成成分而言，国际免疫学会联合会已经命名的组分有30多种，其中组分1和组分2被认为是屋尘螨过敏原中最主要的成分。

目前常用的过敏原特异性检测方法主要包括：体内试验(皮内试验或皮肤点刺试验)、器官激发实验(经过鼻黏膜、结膜或气道)、血清特异性IgE(specific immunoglobulinE,sIgE)检测、斑贴试验等。其中血清特异性IgE检测作为一种安全、有效、便捷的检测手段，已经广泛应用于过敏性疾病的诊断。但是，目前商品化的血清特异性IgE检测试剂大都采用的是粗提物，这些粗提物由于提取方法、后期处理及保存方法的差异，可能出现部分组分丢失或杂质蛋白较多的现象，因此容易导致假阴性结果的出现。另外，蛋白粗提取物中可能会存在与真正过敏原具有相似抗原表位的物质，这些相似的抗原表位可引起交叉反应而出现假阳性的结果。因此，提高血清特异性IgE检测结果的准确率是目前急需解决的问题。与此同时，由于粗提物中含有多种过敏原组分，同一组分在不同批次产品中的含量不一致，不利于实现产品的标准化。

因此，需要了解屋尘螨的过敏原成分，制备过敏原单组份重组蛋白，特别是屋尘螨I类过敏原Der p 1重组蛋白，为屋尘螨过敏性疾病的快速诊断提供技术手段，为临床制订有效脱敏治疗方案提供依据。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明目的之一提供了一种屋尘螨I类变应原pro-Der p1重组蛋白，特别适用于屋尘螨过敏原的快速检测与脱敏治疗。

具体地，屋尘螨I类变应原pro-Der p 1重组蛋白，其中，pro-Der p 1基因序列具有优化的昆虫密码子且3’端偶连His蛋白序列，序列如SEQ IDNO：1所示。本发明的pro-Derp 1重组蛋白具有较高的表达量，且与天然蛋白具有类似的生物学活性。

本发明的目的之二是提供包含上述屋尘螨I类变应原pro-Der p 1重组蛋白的重组质粒。所述重组质粒是利用Xho I和KpnI酶切位点将具有优化的昆虫密码子且3’端偶连His蛋白序列的pro-Der p 1重组基因序列插入基于穿梭载体pFastBac

本发明目的之三是提供包含上述重组质粒的表达载体。具体地，将所述重组杆状病毒质粒Bacmid-Der p 1转染到Sf9细胞中，获得pro-Der p 1表达载体。

本发明目的之四是提供上述屋尘螨I类变应原pro-Der p 1重组蛋白的制备方法。具体地，合成SEQ ID NO.1所述的连接His蛋白基因序列的pro-Der p 1基因序列，并将其通过Xho I和KpnI酶切位点连接到穿梭载体pFastBac-SCUVI上，通过转化DH10Bac感受态细胞获得重组杆状病毒质粒Bacmid-Der p1，然后转染Sf9昆虫细胞制备重组杆状病毒，采用P2代重组杆状病毒感染Sf9细胞，离心收集上清液。

具体地，所述的蛋白纯化如下：将收集的上清液用0.45um滤器过滤；滤液His层析柱上样，淋洗后分别用100mM、200mM咪唑进行洗脱；取洗脱液跑SDS-PAGE胶，得到纯的pro-Der p 1条带，大小34kD左右；用超滤膜包对洗脱液进行浓缩和PBS置换，得到PBS重悬的纯化pro-Der p 1重组蛋白。

本发明目的之五涉及上述屋尘螨I类变应原pro-Der p 1重组蛋白在用于制备检测屋尘螨引起的过敏性疾病的诊断试剂或脱敏治疗等生物制品方面的应用。

本发明目的之六涉及上述屋尘螨I类变应原pro-Der p 1重组蛋白在用于制备检测屋尘螨的诊断试剂或生物制品方面的应用。

本发明目的之七涉及上述屋尘螨I类变应原pro-Der p 1重组蛋白在检测屋尘螨的方法中的应用。所述方法包括ELISA、液相芯片、固相芯片、胶体金等基于抗原抗体的体外诊断方法，可快速对屋尘螨过敏原进行检测。

本发明的重组pro-Der p 1蛋白理化特性更接近天然过敏原蛋白组分，具备较高的半胱氨酸蛋白酶活性，因此检测灵敏度高，非特异性少，ELISA和液相芯片检测结果与ImmunoCAP结果相关性高，趋势一致，特别适用于屋尘螨过敏原的快速检测。

本发明提供的屋尘螨I类变应原pro-Der p 1重组蛋白，其pro-Der p 1基因序列具有优化的昆虫密码子，对屋尘螨的特异性更强，有利于对屋尘螨的特异性检测。且pro-Der p 1基因序列的3’端偶连His蛋白，有利于蛋白的纯化，可以利于His层析柱进行洗脱分离，获得的重组蛋白纯度较高。高纯度的重组蛋白有利于临床上屋尘螨过敏原的快速病原学诊断、治疗，有利于精准诊断屋尘螨过敏组分，缩短治疗周期，节省医疗费用，产生良好的社会效益。

附图说明

图1为pro-Der p 1原始序列与优化后序列比对图。

图2为pro-Der p 1重组质粒图谱。

图3为pro-Der p 1重组蛋白与原始pro-Der p 1蛋白测序对比图。

图4为pro-Der p 1重组蛋白SDS-PAGE检测。

Lane 1：Sf9细胞培养上清；Lane 2：蛋白样品过镍柱后流穿液；Lane 3：50mM咪唑洗脱液；Lane4：200mM咪唑洗脱液；Lane 5：1M咪唑再生洗脱液。

图5为pro-Der p 1重组蛋白酶活性评价。

图6为pro-Der p 1重组蛋白sIgE抗体ELISA(TMB法)与ImmunoCAP检测结果相关性分析。

图7为pro-Der p 1重组蛋白sIgE抗体化学发光酶免疫法(CLEIA)与ImmunoCAP检测结果相关性分析。

图8为pro-Der p 1重组蛋白sIgE抗体液相芯片与ImmunoCAP检测结果相关性分析。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

其中，pFastBacTM Dual购于Thermo Fisher公司，Sf9昆虫细胞购于美国菌种保藏中心(ATCC)，2×PCR反应液、KOD FX酶、dNTPs购于东洋纺(上海)生物科技有限公司，抗人HRP-IgE、化学发光底物购于Thermo Fisher公司，液相芯片微球、蛋白偶联试剂盒购于Bio-Rad公司。

具体实施流程为：

(1)制备屋尘螨组分I—pro-Der p 1重组蛋白：从NCBI数据库中找出Der p 1的基因序列，进行昆虫密码子优化，并在3’端连接His蛋白基因序列后插入基于穿梭载体pFastBacTM Dual改造的pFastBac-SCUVI载体中，转化DH10Bac感受态细胞挑选获得Bacmid杆粒，通过转染Sf9昆虫细胞制备重组杆状病毒，得到pro-Der p 1重组蛋白并进行纯化。

昆虫密码子优化参考文献：马园，仲亮，王国华，等.口蹄疫病毒VP1基因密码子偏好性分析.中国动物检疫，2021。28(4)：116-123。

(2)pro-Der p 1重组蛋白活性评价：通过比较纯化的pro-Der p 1重组蛋白水解半胱氨酸蛋白酶底物Z-phe-arg-MCA后荧光强度，对其蛋白活性进行评价。

(3)pro-Der p 1重组蛋白的应用：所获得的pro-Der p 1重组蛋白用于Der p 1sIgE抗体的检测，分别采用了ELISA(TMB法)、化学发光酶免疫法(CLEIA)和液相芯片法，通过与ImmunoCAP的检测结果进行比较，均显示出很好的相关性，特别适用于屋尘螨过敏原的快速检测。

实施例1屋尘螨组分I pro-Der p 1重组蛋白的制备

1.pro-Der p 1重组质粒的构建

从NCBI数据库中找出Der p 1的基因序列，该序列包含了前体肽部分，将该序列进行昆虫密码子优化并在其3’末端加上His蛋白基因序列后(图1)，RT-PCR扩增或直接合成并利用Xho I和KpnI酶切位点将优化后的pro-Der p 1插入穿梭载体pFastBac SCUV中，获得pro-Der p 1重组质粒pFastBac-SCUVI-Der p 1(图2)。

2.杆状病毒质粒(Bacmid)的制备与鉴定

(1)转化与扩增

向100ul DH10 MultiBac感受态细胞中加入250ng重组质粒pFastBac-SCUVI-Derp 1，冰浴30分钟，42℃热激90秒，冰上放置3分钟后加入900ul无抗性LB液体培养基继续培养5小时。取200ul菌液涂布于加有IPTG与X-gal的LB抗性平板(含10mg硫酸卡那霉素、10mg盐酸四环素、1.4mg硫酸庆大霉素)，37℃培养48小时后，通过蓝白斑筛选出目标白色菌落，重新划线在加有IPTG与X-gal的LB抗性平板，37℃培养24小时后再分别挑1个白色菌落于5ml LB液体培养基(含10mg硫酸卡那霉素、10mg盐酸四环素、1.4mg硫酸庆大霉素)中继续培养16小时。

(2)Bacmid-Der p 1杆粒提取

1)取1个无菌2ml离心管，分三次收集6ml待提取杆粒的菌液，每次的离心条件为12000×g，1分钟，室温，离心后弃尽上清。以下操作对每个离心管分别进行。

2)加250μl Buffer S1(已加入RNA酶)(Axygen质粒小量DNA提取试剂盒AP-MN-P-250)，用1ml移液枪重悬细菌沉淀。

3)加250μl Buffer S2(来自Axygen质粒提取试剂盒)，温和并充分地上下翻转6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液，静置3分钟。此步骤未超过5分钟。

4)加350μl Buffer S3(来自Axygen质粒提取试剂盒)，温和并充分地上下翻转混合8次，冰上放置5分钟后12000×g离心10分钟，收集上清液到新的离心管中，约800μl。

5)通风橱内加入等体积的DNA提取液(苯酚/氯仿/异戊醇＝25:24:1)，温和颠倒混匀后，12000×g，离心5分钟，收集上层上清液(约800ul)。

6)加0.6倍体积(480μl)的异丙醇，混匀，-20℃放置1小时；12000×g离心20分钟，弃上清；

7)每管加入700μl 70％乙醇漂洗沉淀除盐，12000×g离心5分钟，弃上清液。

8)12000×g离心5分钟，洁净工作台内用移液枪吸除剩余上清后放置数分钟风干沉淀。

9)在超净工作台内加入30μl灭菌水溶解后暂时放置4℃保存，即为pro-Der p 1重组杆状病毒质粒(Bacmid-Der p 1)。

(3)Bacmid-Der p 1的鉴定

采用特异性引物P10(F:ATACGGACCTTTAATTCAACCCAAC；R:ACCCGTGCGTTTTATTCTGTCTTTT)以及STAP3(F:CCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATT；R:ATGTGGACAAAATACCTGGTTACCC)对提取的杆粒进行PCR鉴定。PCR反应体系如下表所示，反应体系总体积为50μl。

PCR鉴定杆状病毒质粒的反应体系：

PCR反应程序：

STAP3:94℃,2分钟；(98℃，10秒；68℃，5分钟),26个循环；68℃,20分钟；4℃,保存。

P10:94℃,2分钟；(98℃,10秒；57℃,30秒；68℃,2分钟),26个循环；68℃,20分钟；4℃,保存。

如图3的PCR产物基因测序分析以及PCR产物测通的结果所示，所述重组蛋白为pro-Der p 1蛋白。

3.重组杆状病毒的制备与重组pro-Der p 1的表达

(1)无血清Grace’s培养基培养昆虫细胞Sf9，取对数生长期细胞，将获得的重组杆状病毒质粒bacmid-Der p 1转染到Sf9细胞中，换Grace’s完全培养基(5％FBS)后继续培养4-5天，收集上清，获得P1代重组杆状病毒。

(2)取对数生长期Sf9细胞，调整细胞密度为3.5×10

(3)取对数生长期Sf9细胞，调整细胞密度为3.5×10

(4)取对数生长期Sf9细胞，调整细胞密度为3.5×10

4.pro-Der p 1重组蛋白的纯化与鉴定

(1)将收集的细胞培养上清液用0.45um滤膜进行过滤处理；之后将样品通过镍离子亲和层析柱进行纯化，淋洗后分别用50mM、200mM、1M咪唑进行洗脱，收集各阶段得到的流穿液。

(2)纯化鉴定：取洗脱液进行SDS-PAGE胶电泳后进行考马斯亮蓝染色，如图4所示，目标蛋白主要集中于200mM咪唑洗脱液，得到较纯的pro-Der p 1蛋白，大小34kD左右。

(3)浓缩脱盐：用超滤膜包对200mM咪唑洗脱液进行浓缩和PBS置换，得到PBS重悬的pro-Der p 1重组蛋白，浓度为3.5mg/ml，蛋白得率为每1L昆虫细胞培养上清25mg。

实施例2pro-Der p 1重组蛋白活性评价

采用半胱氨酸蛋白酶的特异性荧光底物Z-苯丙胺酰-精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素盐酸盐(Z-phe-arg-MCA)对所表达的重组pro-Der p 1的蛋白酶活性进行检测。

1.取适量pro-Der p 1加入pH为5.5的磷酸-柠檬酸钠缓冲液中，总反应体积为3ml，pro-Der p 1终浓度为25ug/ml，37℃水浴30分钟；若需要对pro-Der p 1的酶活性进行抑制，则提前将pro-Der p 1与E64于37℃反应15分钟。

2.水浴30分钟后，向溶液中加入2ul Z-phe-arg-MCA底物缓冲液(终浓度为20umol/L)，37℃继续反应30分钟。

3.反应结束后，各取100ul反应液于96孔板中，在激发光370nm，发射光440nm处检测荧光强度。Pro-Der p 1的蛋白酶活性与此结果中荧光强度呈正比。

结果如图5所示，与其它组相比，pro-Der p 1水解半胱氨酸蛋白酶底物Z-phe-arg-MCA后荧光强度最高，证明重组的Der p 1确实具有半胱氨酸蛋白酶活性。

实施例3pro-Der p 1重组蛋白用于ELISA(TMB法)检测sIgE抗体

(1)包被：用碳酸盐缓冲液稀释重组pro-Der p 1蛋白至5ug/ml，按100ul/孔包被于96孔酶标板中，贴上封口膜于4℃包被过夜。

(2)洗板：将已包被过夜的板拿出，甩去已有液体，再加入PBST 300μl/孔，振荡20秒，甩去洗液，重复洗涤3次，最后一次将板内液体拍干。

(3)封闭：孔中加入200μl封闭液，将板静置于37℃孵育箱中2小时。

(4)洗板：洗板3次，同步骤(2)。

(5)加样：用样本稀释液按1:20比例稀释临床血清样本，按100μl/孔加入至孔中，两副孔；同时设置PBS阴性对照组；37℃孵育2小时。由于目前我国市面上并无Der p 1 sIgE的标准品，于是选取了经ImmunoCAP检测的高级别sIgE血清倍比稀释作为标准品。

(6)洗板：洗板3次，同步骤(2)。

(7)检测抗体：加入稀释后的HRP标记的抗人IgE抗体，100μl/孔，37℃孵育1小时。

(8)洗板：洗板5次，同步骤(2)，最后一次拍干板。

(9)加底物：按100μl/孔加入底物TMB，37℃避光反应约5分钟。

(10)加终止液：观察孔内颜色变化，加终止液H

(11)读板：将板放入酶标仪中，在450nm波长下读板记录OD值。

(12)结果计算：由标准品的浓度和对应OD值建立标准曲线，得出计算公式，由样品复孔平均OD值计算其相应sIgE浓度。

通过检测21例血清的Der p 1 sIgE结果(0-6级，每级别3个样本)，以ImmunoCAP的检测结果作为对照。结果如表1和图6所示，ELISA检测Der p 1 sIgE的OD值及其换算的浓度值与ImmunoCAP方法检测出的屋尘螨sIgE浓度呈显著相关，相关系数分别为0.938，P<0.001和0.927,P<0.001。

表1 pro-Der p 1应用ELISA(TMB法)检测人血清Der p 1 sIgE结果

实施例4pro-Der p 1重组蛋白用于化学发光酶免疫法(CLEIA)检测sIgE抗体

(1)用包被液稀释Derp 1原液至5μg/ml浓度，100μl/孔加入至避光微孔板中，4℃过夜包被。

(2)洗板：将已包被过夜的板取出，用PBST 200μl/孔，洗涤3次，最后一次拍板。

(3)封闭：按200μl/孔加入封闭液，37℃2小时静置孵育。

(4)洗板3次，同步骤(2)。

(5)加样：用样本稀释液将血清样本按1：20比例稀释，按100μl/孔加入，每种样本设置两复孔，同时用样本稀释液作为阴性对照，37℃2小时静置孵育。

(6)洗板3次，同步骤(2)。

(7)检测抗体：HRP标记的抗人IgE抗体按1：2000稀释，100μl/孔，37℃，1小时，200rpm振荡孵育。

(8)洗板5次，同步骤(2)。

(9)加底物：提前配制好SuperSignal化学发光底物，按50μl/孔加入，避光振荡孵育1分钟。

(10)读板：加入底物后1-5分钟内将板放置于酶标仪BIOTEK Cytation3中在425nm波长光下检测相对光单位值。

(11)结果计算：由标准品的浓度和对应RLU值建立标准曲线，得出计算公式，由样品复孔平均RLU值计算其相应sIgE浓度。

通过检测14例血清的Der p 1 sIgE结果，以ImmunoCAP的检测结果作为对照，结果如表2和图7所示，CLEIA化学发光值及其换算的sIgE浓度与ImmunoCAP结果呈显著相关，相关系数分别为0.921,P<0.001与0.929，P<0.001。

表2 pro-Der p 1应用化学发光酶免疫法(CLEIA)检测人血清Der p 1 sIgE结果

实施例5pro-Der p 1重组蛋白用于液相芯片检测sIgE抗体

1.偶联pro-Der p 1与磁珠：

(1)重悬分散磁珠：将磁珠于涡旋振荡仪上按1400rpm涡旋振荡约30秒后用水浴超声15秒。

(2)清洗磁珠：取100μl重悬后磁珠加入无菌1.5ml离心管中，于磁力反应架上静置1分钟，使磁珠完全被吸附，小心吸弃上清；加入100μl磁珠清洗液，涡旋振荡30秒后置于磁力架静置1分钟，小心吸弃上清。

(3)活化磁珠：用100μl磁珠活化液重悬磁珠，涡旋振荡30秒；加入10μl的50mg/ml的S-NHS，轻微混匀后立即加入10μl的50mg/ml的EDC，再轻微混匀；高速振荡重悬至少30秒；25℃避光1100rpm振荡孵育20分钟。

(4)洗涤：孵育完成后立即加入150μl MES(0.05M pH 5.0)，高速振荡洗涤10秒；离心管置于磁力架1分钟，磁珠沉淀后吸弃上清；加入100μl MES重悬磁珠，高速振荡30秒。

(5)偶联蛋白：向磁珠中加入4μg rpro-Der p 1，用MES调节终体积至500μl，高速振荡分散磁珠1分钟；25℃避光1200rpm振荡孵育2小时。

(6)洗涤：产物置于磁力架静置1分钟，小心吸弃上清；加入500μl MES，涡旋振荡洗涤30秒后置于磁力架1分钟，吸弃上清。

(7)封闭：加入125μl磁珠封闭液，涡旋振荡洗涤30秒后置于磁力架1分钟，吸弃上清；加入250μl磁珠封闭液，涡旋振荡重悬磁珠，25℃避光1200rpm振荡孵育30分钟；产物置于磁力架静置1分钟，小心吸弃上清。

(8)贮存并计数：加入500μl磁珠贮存液，涡旋振荡洗涤30秒后置于磁力架1分钟，吸弃上清；加入150μl磁珠贮存液，涡旋振荡重悬磁珠，利用细胞计数板计，完成后，避光置于4℃。

2.利用Luminex平台检测Der p 1 sIgE

(1)磁珠计数：取出偶联rpro-Der p 1的磁珠(rpro-Der p 1-Beads)150μl，振荡30秒混匀，取1μl加入19μl PBS液，混匀后计数，rpro-Der p 1-Beads密度为10.35×106/ml；用低交叉反应液稀释偶联后的磁珠至6×104/ml浓度。

(2)1400rpm振荡偶联后磁珠30秒(避光)，在96孔反应微孔板中加入50μl/孔。

(3)洗涤：将板置于磁性洗板工作站上，自动进行洗涤三次。

(4)样品稀释：根据预实验结果，用低交叉反应液将样本稀释倍数设置为20倍，同时将样本中经ImmunoCAP检测的Der p 1 sIgE浓度最高的样本作为标准品，进行倍浓度梯度稀释：1:10、1:40、1:160、1:640、1:2560、1:10240、1:40960。

(5)加样：分别向已有磁珠的孔内加入50μl稀释后样本及标准品，空白孔加入低交叉反应液作为对照。

(6)室温1100rpm避光振荡30秒，700rpm振荡孵育1小时。

(7)洗涤：同步骤(3)。

(8)用样本稀释液将biotin标记的抗人IgE稀释至1μg/ml(1:750稀释)。

(9)每孔加入50μl稀释后检测抗体。

(10)室温1100rpm避光振荡30秒，700rpm振荡孵育30分钟。

(11)洗涤：同步骤(3)。

(12)用样本稀释液将SA-PE(100X)稀释至1X浓度，每孔加入50μl稀释后SA-PE，室温1100rpm避光振荡30秒，700rpm振荡孵育15分钟。

(13)洗涤：同步骤(3)。

(14)每孔加入125μl样本稀释液重悬磁珠，平板摇床上1100rpm振荡1分钟后上机检测。

通过检测19例血清的Der p 1 sIgE结果，以ImmunoCAP的检测结果作为对照，结果如表3和图8所示，液相芯片荧光值及其换算的sIgE浓度值与ImmunoCAP结果呈显著相关，相关系数分别为0.939，P<0.001以及0.800,P<0.005。

表3 pro-Der p 1应用Luminex液相芯片法检测检测人血清Der p 1 sIgE结果

序列表

<110> 广州医科大学

<120> 一种屋尘螨I类变应原pro-Der p 1重组蛋白及其制备方法与应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 999

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctcgagatga agatcgtgct ggctatcgct agcttgttgg cgttgtccgc tgtgtacgct 60

cgcccttcct ccatcaagac cttcgaggag tacaagaagg ctttcaacaa gtcctacgct 120

accttcgagg acgaggaggc tgcccgtaaa aacttcctgg agtctgtgaa gtacgtgcaa 180

tccaacggtg gtgccatcaa ccacctgtcc gacctgtccc tggacgagtt caagaaccgc 240

ttcttgatgt ccgctgaggc tttcgagcac ctgaagacac agttcgacct gaacgctgag 300

accaacgctt gttccatcaa cggtaacgct cctgccgaaa tcgacctgag acagatgcgc 360

accgtgaccc ctattcgtat gcaaggcggc tgcggctcct gctgggcttt ctctggtgtg 420

gctgctactg agtccgcata cctggcttac cgtaaccagt ccttggacct ggccgagcag 480

gagttggtgg actgcgcgtc ccagcacggt tgtcacggtg ataccatccc tcgtggtatc 540

gagtacattc agcacaacgg tgtggtgcag gagagctact accgctacgt tgcacgcgag 600

cagagttgcc gtaggccaaa cgctcagagg ttcggtattt ccaactactg ccaaatctac 660

cctcccaacg tcaacaagat cagggaggca ctggcccaga cccactccgc tatcgcagtc 720

atcattggta tcaaggacct ggacgcattc cgccactacg acggtcgcac catcatccaa 780

cgcgacaacg gctaccagcc caactaccac gctgtgaaca tcgtgggtta cagtaacgcc 840

cagggtgtgg actactggat cgtgcgcaac tcctgggaca ccaactgggg tgacaacggt 900

tacggctact tcgccgctaa catcgacctg atgatgattg aggagtaccc atacgtggtg 960

attctgggtt ctcatcatca ccaccaccac taaggtacc 999

<210> 2

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atacggacct ttaattcaac ccaac 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acccgtgcgt tttattctgt ctttt 25

<210> 4

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccggctcgta tgttgtgtgg aatt 24

<210> 5

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgtggacaa aatacctggt taccc 25