一种构建Igf2bp1基因敲除小鼠胚胎干细胞系的方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体而言，涉及一种构建Igf2bp1基因敲除小鼠胚胎干细胞系的方法。

背景技术

胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell,ESC)来源于早期囊胚的内细胞团，是一类多潜能干细胞，具备自我更新和分化的双重能力。ESC能够定向分化为多种细胞类型，例如心肌细胞、神经细胞和肌肉细胞等，在组织修复和再生医学中具有广阔的应用前景。通过对小鼠ESC的研究，我们可以更深入地了解胚胎发育过程中细胞命运决定和分化调控的分子机制。此外，胚胎干细胞系还可应用于建立疾病模型和药物筛选。利用其建立的疾病模型，我们可以更好地理解疾病的发生机制，并加快新药研发和药效评估的进程。总体而言，对小鼠ESC的相关研究对于深入了解发育生物学、疾病发生机制及药物筛选等研究具有重要的科学意义和应用价值。

Igf2bps(Insulin-like growth factor 2mRNA-binding proteins,Igf2bps)家族是一类RNA结合蛋白，包括Igf2bp1、Igf2bp2和Igf2bp3。Igf2bps通过结合mRNA的3'非翻译区(3’untranslated region,3’UTR)以参与转录后调控。研究还发现，Igf2bps通过识别RNAm

目前，研究人员主要利用小干扰RNA(siRNA)和反义RNA(shRNA)等方法挖掘特定基因的新功能和调控机制，然而这些方法通常存在效率不高且不稳定的问题。特别是在干细胞研究中，由于其特殊的细胞膜特性、DNA修饰酶活性及免疫反应，外源基因转染效率非常低，致使基因功能的研究更具挑战性。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，该系统利用Cas9蛋白与特定的引导RNA即sgRNA共同定位到靶基因的特定位置，引发双链断裂。细胞利用自身的修复机制进行修复，这种修复过程往往会引起碱基插入或缺失，造成移码突变从而实现对靶基因的敲除作用，从而获得特异性高、稳定的Igf2bp1基因缺失的小鼠胚胎干细胞株，为研究Igf2bp1在干细胞增殖、分化和相关疾病进展的作用机制提供了有效的细胞模型。

本发明不仅提供一种基于CRISPR/Cas9系统靶向敲除Igf2bp1基因的sgRNA序列，而且提供了构建Igf2bp1基因缺失的小鼠胚胎干细胞株的详细方案。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

第一方面，本发明提供了一种用于敲除小鼠Igf2bp1基因的sgRNA序列，所述sgRNA序列为SEQ ID NO:1所示序列。

第二方面，本发明提供了一种敲除小鼠胚胎干细胞Igf2bp1基因的方法，为利用CRISPR/Cas9慢病毒系统在小鼠胚胎干细胞中对Igf2bp1基因进行改造，具体包括如下步骤：

步骤S1，人工合成含sgRNA序列的寡核苷酸序列sg-Oligo1和sg-Oligo2形成双链DNA，sg-Oligo1序列如SEQ ID NO:2所示，sg-Oligo2序列如SEQ ID NO:3所示；将所合成的双链DNA插入到sgRNA骨架表达质粒载体的多克隆位点并转化，挑选单克隆菌株，提取sgRNA重组质粒，通过测序鉴定获得测序正确的sgRNA重组质粒，其中，sgRNA骨架表达质粒载体还表达Cas9核酸酶；

步骤S2，将sgRNA重组质粒转染HEK 293T细胞，收获病毒上清后感染小鼠胚胎干细胞，即可获得敲除Igf2bp1基因的小鼠胚胎干细胞。

优选的，所述sgRNA骨架表达质粒载体为LentiCRISPR v2；所述正确的sgRNA重组质粒简称为LentiCRISPR-bp1；

作为较佳本发明的一种较佳的实施方式，上述第二方面提供的一种敲除小鼠胚胎干细胞Igf2bp1基因的方法的具体实施方式包括步骤：

针对Igf2bp1基因的外显子设计sgRNA序列，合成sg-Oligo1和sg-Oligo2；LentiCRISPR v2质粒采用BsmBI单酶切，经琼脂糖凝胶电泳分离后，采用胶回收试剂盒纯化DNA片段；将合成的sg-Oligo1和sg-Oligo2退火形成双链DNA，经T4激酶磷酸化；然后在T4DNA连接酶的作用下将载体和退火形成的双链DNA片段连接，连接产物转化至感受态细胞中，挑选单克隆菌株，提取sgRNA重组质粒，通过测序鉴定获得测序正确的sgRNA重组质粒LentiCRISPR-bp1；

将重组质粒LentiCRISPR-bp1转染HEK 293T细胞，收集48h病毒上清，取适量病毒上清感染小鼠胚胎干细胞，24h后，加入嘌呤霉素筛选一周。将筛选后的阳性细胞制成细胞悬液，利用有限稀释法筛选单克隆，收集单克隆细胞并提取基因组DNA，采用PCR扩增DNA产物并进行测序鉴定基因型变化；

所述重组质粒转染HEK 293T细胞收集48h病毒上清的步骤具体包括：细胞汇合度达到70％左右，将LentiCRISPR-bp1、包装质粒VSVG和PSPAX共同转染至细胞中，24h更换完全培养基，48h后收集病毒上清，采用0.45μm滤膜过滤。

所述小鼠胚胎干细胞为J1细胞系，购自于中国科学院细胞库，采用无饲养层细胞培养。所述取适量病毒上清感染小鼠胚胎干细胞，24h后加入嘌呤霉素筛选一周的步骤具体包括：小鼠胚胎干细胞ESC密度生长至30％-40％，加入病毒上清感染24h，感染期间添加8μg/ml的聚凝胺，48h后加入1.0μg/ml的嘌呤霉素筛选一周，收集蛋白样品利用Westernblotting进行初步验证。

所述利用有限稀释法筛选单克隆，收集单克隆细胞并提取基因组DNA，采用PCR扩增DNA产物并进行测序鉴定基因型变化的具体步骤包括：利用有限稀释法将混合敲除的细胞悬液接种至96孔板中培养10-15天，挑取单克隆接种至24孔板中继续培养。传代过程中收取细胞并用于基因组抽提，根据sgRNA位点在前后两端200bp设计上下游引物，PCR产物进一步克隆至pUCm-T载体中，测序比对后获得基因型改变的克隆。

第三方面，本发明提供了一种构建Igf2bp1基因敲除小鼠胚胎干细胞系的方法，为采用有限稀释法对第二方面所得的敲除Igf2bp1基因的小鼠胚胎干细胞进行传代筛选，获得稳定敲除Igf2bp1基因的小鼠胚胎干细胞系。

第四方面，本发明提供了一种Igf2bp1基因缺失的小鼠胚胎干细胞株，为如采用第三方面所述的构建Igf2bp1基因敲除小鼠胚胎干细胞系的方法所获得。

第五方面，本发明提供了一种用于在小鼠基因组中进行Igf2bp1基因定点敲除的试剂盒，包括如下(1)～(2)中的任意一种：

(1)如第二方面所述的含sgRNA序列的编码链模板和非编码链模板形成双链DNA；

(2)如第二方面所述的的sgRNA重组质粒。

本发明与现有技术相比，具有如下优点及效果：本发明提供了一种用于敲除小鼠Igf2bp1基因的sgRNA序列设计，是针对Igf2bp1第一个外显子的sgRNA设计方案，该sgRNA能够靶向Igf2bp1基因，实现Igf2bp1基因的有效敲除及其编码蛋白的功能丧失；利用本发明提供的敲除小鼠胚胎干细胞Igf2bp1基因的方法实现了在基因组水平对基因的沉默作用，有效改进了现有技术中采用siRNA在mRNA或蛋白水平的沉默不彻底或者无法沉默基因表达的缺点，还提供了一种能够获得连续传代的Igf2bp1基因缺失的小鼠胚胎干细胞株的构建方法、获得了Igf2bp1基因缺失的小鼠胚胎干细胞株模型。Igf2bp1基因在干细胞生物学中具有潜在的调控作用，本发明构建的Igf2bp1基因缺失的小鼠胚胎干细胞株模型，可用于研究Igf2bp1在干细胞增殖与分化、转录和翻译调控等方面的功能。胚胎干细胞可以在体外进行定向分化，用于疾病模型构建。因此，利用Igf2bp1基因缺失的小鼠胚胎干细胞株模型，可以探索Igf2bp1基因在发育相关疾病中的调控作用。

附图说明

图1为LentiCRISPR-bp1重组质粒构建模式图；

图2为单克隆Igf2bp1-B2(bp1-B2)的基因组DNAPCR扩增产物。泳道M：DNAMarker；泳道WT：野生型基因组DNAPCR产物；泳道bp1-B2：编号为B2克隆的基因组DNAPCR产物；

图3为单克隆bp1-B2基因组DNAPCR产物的Sanger测序结果。

图4为野生型与单克隆bp1-B2的基因组比对分析。WT代表野生型ESC基因组DNA序列；bp1-B2代表敲除Igf2bp1单克隆B2基因组DNA序列；虚线代表缺失片段。

图5为Westernblot验证Igf2bp1基因敲除的蛋白水平变化。WT代表野生型ESC的Igf2bp1蛋白表达；bp1-B2代表敲除克隆B2的Igf2bp1蛋白的表达。

图6为qPCR检测单克隆bp1-B2的mRNA表达水平。

图7为单克隆Igf2bp1-C1(bp1-C1)的基因组DNAPCR扩增产物。泳道M：DNAMarker；泳道WT：野生型基因组DNAPCR产物；泳道bp1-C1：编号为C1克隆的基因组DNAPCR产物。

图8为单克隆bp1-C1基因组DNAPCR产物的Sanger测序结果。

图9为野生型与单克隆bp1-C1的基因组比对分析。WT代表野生型ESC基因组DNA序列；bp1-C1代表敲除Igf2bp1单克隆C1基因组DNA序列；虚线代表缺失片段。

图10为Westernblot验证Igf2bp1基因敲除的蛋白水平变化。WT代表野生型ESC的Igf2bp1蛋白表达；bp1-C1代表敲除克隆C1的Igf2bp1蛋白的表达。

图11为qPCR检测单克隆bp1-C1的mRNA表达水平。

具体实施方式

以下是对本发明的具体实施方式的详细描述。提供的实施例仅用于澄清本发明，并不对本发明的范围进行限制。所述实施例可作为本领域普通技术人员进一步改进的参考，不以任何方式构成对本发明的限制。

本发明实施例中无特别说明外，所用试剂及耗材均为市售商品。

本发明技术方案可通过如下实施例实现：

1、sgRNA序列设计

根据NCBI数据库，查询并下载Igf2bp1基因组DNA序列：物种：鼠源，基因名：Igf2bp1，基因ID：140486，根据Igf2bp1的第一个外显子设计sgRNA序列即SEQ ID NO:1所示序列，其序列为GGATTGCCCCGACGAGCACT。

2、构建重组质粒LentiCRISPR-bp1

(1)根据上述sgRNA序列即SEQ ID NO:1所示序列设计寡核苷酸链，设计的寡核苷酸链序列详见表1，具体是通过在编码链模板5′端添加CACCG，在非编码链模板5′端添加AAAC以及3′端添加C，以与BsmBI酶切后形成的粘性末端互补，合成sgRNA寡核苷酸链sg-Oligo1和sg-Oligo2；

表1 Igf2bp1靶向位点及sgRNA寡核苷酸序列

(2)配制LentiCRISPR v2载体酶切体系，LentiCRISPR v2载体酶切体系具体包括1μg的LentiCRISPR v2、2.5μl的BsmBI(购自NEB)、5μl的NEBufferTM r3.1(购自NEB)并补足50μl的ddH

(3)使用诺唯赞胶回收试剂盒DC301-01纯化酶切质粒产物，具体步骤按诺唯赞胶回收试剂盒DC301-01的说明书进行操作；

(4)配制sg-Oligo磷酸化与退火sgRNA反应体系即引物退火体系，引物退火体系具体包括：1μl浓度为100μM的sg-Oligo 1、1μl浓度为100μM的sg-Oligo 2、1μl的10×T4 DNAligase Reaction buffer(购自NEB)、1μl的T4 PNK enzyme(购自NEB)并补足10μl的ddH

(5)将退火形成的sg-Oligo双链稀释100倍后和步骤(2)中获得的LentiCRISPR v2酶切质粒产物按照连接反应体系在室温孵育2h，获得LentiCRISPR v2酶切质粒产物与sgRNA连接产物以下简称连接产物；具体的连接反应体系包括：50ng的LentiCRISPR v2酶切质粒产物、1μl的上述稀释100倍后的sg-Oligo双链、1μl的×T4 DNA Ligase Buffer(购自NEB)、1μl的T4 DNA Ligase(购自NEB)并补足10μl的ddH20；

(6)将连接产物转化至感受态细胞DH5α(购自擎科生物)中，均匀涂至含氨苄抗性的LB固体培养基平板中，倒置于37℃培养箱中培养12-16小时；

(7)挑取单个菌落扩大培养并使用诺唯赞质粒抽提试剂盒DC201-01进行质粒抽提，按说明书进行操作，送至南京擎科生物公司进行sanger测序，测序比对完成后将含有LentiCRISPR-bp1重组质粒的菌种置于-80℃保存。如图1所示即为LentiCRISPR-bp1重组质粒构建模式图。

3、慢病毒包装与感染

(1)慢病毒包装

转染前一天接种HEK 293T至60mm细胞培养皿中，待其汇合度生长至60％-70％；次日，准备一只1.5ml EP管，加入500μl DMEM高糖培养基(购自凯基生物)，加入0.625μgVSVG、2.5μg PSPAX和5μg LentiCRISPR-bp1载体，手指轻弹混匀进行室温条件下的孵育。准备另一个1.5ml EP管，加入500μl DMEM培养基，加入35μl转染试剂ExFect TransfectionReagent(购自诺唯赞)，手指轻弹混匀。

室温孵育5min后，将上述含有待转染质粒的DMEM培养基滴加至含转染试剂的EP管中轻弹混匀，在室温孵育混合液15min。从培养箱中取出细胞，将DNA混合液小心滴入细胞培养基中，混匀后将细胞置于培养箱中继续培养，转染4h后更换成基础培养基继续培养，培养基成分：445ml DMEM高糖培养基(购自凯基生物)+50ml FBS(购自上海达特希尔生物科技)+5ml PS(购自Gibco)。转染48h后收集病毒产物并用0.45μm pvdf滤膜过滤，将病毒上清置于-80℃冻存。

(2)感染靶细胞

靶细胞即小鼠胚胎干细胞ESC细胞为J1细胞系，购自于中国科学院细胞库(目录号：SCSP-219)，采用无饲养层细胞培养；

从-80℃冰箱中取出冷冻慢病毒，在冰上解冻；弃去靶细胞原培养液，加入病毒上清，与此同时，添加10mg/ml的聚凝胺溶液(购自MCE)至终浓度为8μg/ml，将培养皿放置在培养箱中在37℃，5％CO

上述感染过程后即48h后，从培养箱中取出细胞并弃去培养液，加入含有1μg/ml嘌呤霉素溶液(购自MCE)的干细胞培养液在37℃，5％CO

4、筛选稳定的单克隆细胞株与基因型鉴定

(1)筛选稳定的单克隆细胞株

消化混合敲除的ESC细胞，细胞计数后，用干细胞培养基将细胞稀释至合适浓度；取96孔板，向左侧第一个孔A1加入4000个细胞，依次对倍稀释至第一列最后一个孔H1；然后再使用多通道移液器从左向右依次对倍稀释至最后一列。每孔加入100μl干细胞培养液，置于细胞培养箱中，在37℃、5％CO2的条件下培养10至15天；在显微镜下观察96孔板中细胞情况，挑选只有一个细胞的细胞培养孔为单克隆，胰酶消化单克隆，接种至24孔板中继续培养。待24孔板长满后，收集细胞，一部分细胞传代至6孔板中培养，另一部分细胞使用1×SDSLoadingbuffer提取蛋白，采用Western blotting检测Igf2bp1蛋白是否被完全敲除。

(2)基因型鉴定

根据Western blotting检测结果，挑选Igf2bp1蛋白水平完全缺失的克隆，收集细胞后，一部分继续传代培养，另一部分细胞则依据诺唯赞基因组DNA提取试剂盒(DC102-01)抽取基因组DNA，具体步骤按说明书进行操作；在Igf2bp1基因上sgRNA靶标序列的前后200bp设计PCR引物如表2。将上述抽取的基因组DNA作为模板进行目标基因序列扩增，Igf2bp1基因上的sgRNA靶标序列的PCR反应体系具体包括：5μl的5×HF buffer、1.25μl的Igf2bp1-F(10μM)、1.25μl的Igf2bp1-R(10μM)、0.5μl的dNTP(10mm)、20ng的DNA、0.5ul的Phusion enzyme、补足25μl的ddH20，PCR程序为：98℃孵育30s；98℃孵育5s，58℃孵育30s，72℃孵育30s，扩增30个循环；72℃维持10min；基因片段富集，将扩增完成的序列进行琼脂糖凝胶电泳，将目标DNA条带切下，根据诺唯赞胶回收试剂盒说明书回收DNA并送南京擎科生物科技有限公司进行测序验证，将测序结果与野生型Igf2bp1基因进行比对，确定细胞株基因型。

表2 Igf2bp1基因上的sgRNA靶标序列PCR引物

通过测序比对发现，最终鉴定出2株具有Igf2bp1基因缺失突变的稳定细胞株。如图2所示为单克隆Igf2bp1-B2(bp1-B2)的基因组DNAPCR扩增产物。泳道M：DNAMarker；泳道WT：野生型基因组DNAPCR产物；泳道bp1-B2：编号为B2克隆的基因组DNAPCR产物。图4所示为野生型与单克隆bp1-B2的基因组比对分析。WT代表野生型ESC基因组DNA序列；bp1-B2代表敲除Igf2bp1单克隆B2基因组DNA序列；虚线代表缺失片段。图7所示为单克隆Igf2bp1-C1(bp1-C1)的基因组DNAPCR扩增产物。泳道M：DNAMarker；泳道WT：野生型基因组DNAPCR产物；泳道bp1-C1：编号为C1克隆的基因组DNAPCR产物。图9所示为野生型与单克隆bp1-C1的基因组比对分析。WT代表野生型ESC基因组DNA序列；bp1-C1代表敲除Igf2bp1单克隆C1基因组DNA序列；虚线代表缺失片段。

图3所示为单克隆bp1-B2基因组DNAPCR产物的Sanger测序结果，测序结果显示，敲除编号为bp1-B2克隆中Igf2bp1第一个外显子有2个碱基的缺失。另一个如图8所示为单克隆bp1-C1基因组DNAPCR产物的Sanger测序结果。测序结果显示，敲除编号为bp1-C1克隆的Igf2bp1第一个外显子有128个碱基的缺失。

Western blotting结果也显示，相较于野生型ESC细胞，bp1-B2克隆和bp1-C1克隆中Igf2bp1蛋白水平实现完全敲除。具体如图5所示为Western blot验证Igf2bp1基因敲除的蛋白水平变化。WT代表野生型ESC的Igf2bp1蛋白表达；bp1-B2代表敲除克隆B2的Igf2bp1蛋白的表达。图10所示为Western blot验证Igf2bp1基因敲除的蛋白水平变化。WT代表野生型ESC的Igf2bp1蛋白表达；bp1-C1代表敲除克隆C1的Igf2bp1蛋白的表达。

从mRNA表达水平来分析，如图6所示为qPCR检测单克隆bp1-B2的mRNA表达水平，图11所示为qPCR检测单克隆bp1-C1的mRNA表达水平，可以看出bp1-B2克隆和bp1-C1克隆的mRNA敲除水平分别达到了90％和70％左右。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。