一种肺炎诊断的临床预测模型构建方法

技术领域

本发明涉及肺炎早期诊断模型构建技术领域，具体涉及一种肺炎诊断的临床预测模型构建方法。

背景技术

社区获得性肺炎(CAP)的发病率及死亡率在全球感染性疾病中稳居高位，严重影响人们的健康。尽管社区获得性肺炎已有公认的诊断标准，包括症状、体征、实验室指标及影像学上的变化，但由于疾病的异质性及病理的复杂性，CAP的早期精准诊断仍然是一个值得重视的临床问题，尤其是对于重症肺炎患者。疾病早期不明显的症状，非特异的实验室指标变化，以及重症患者肺部CT检查的难以实现，都为肺炎早期准确诊断带来困难。如果诊断不及时或诊断错误，可能会延误病人的治疗，加重病人的病情，对于非细菌感染性肺部疾病，错误的诊断还导致抗生素药物的滥用，进一步导致耐药性的产生。因此，找到一种特异性高、敏感性高、更加个体化且易于推广的诊断方法，对提高肺炎患者的早期诊断率及诊断正确率有很大的帮助，是实施个体化治疗及精准治疗、改善预后的关键。

高特异性及高敏感性的生物标记物对于早期精准诊断有很大帮助。但现有的血清炎症标记物，如降钙素原、C反应蛋白等，均缺乏良好的特异性，只能作为一种辅助检查手段，不能用于精准识别肺炎患者。血清代谢组学分析也许对找到肺炎诊断标志物有一定的帮助，但也不能准确反映肺部的炎症变化。因此，筛选特异性强、敏感度高的下呼吸道代谢物诊断标志物，建立一种更全面、更个体化的肺炎早期诊断模型，将推进精准医学的实现，具有重要的临床应用价值。

为此，本发明旨在提供一种肺炎诊断的临床预测模型构建方法，以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种肺炎诊断的临床预测模型构建方法。

为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：一种肺炎诊断的临床预测模型构建方法，通过医院病历系统收集纳入研究对象的临床资料，根据参考范围及最佳截止值，将实验室炎性指标及7种差异代谢物的表达量转换为分类变量，分三步构建临床预测模型，具体包括以下步骤：

S1、对炎症指标及差异代谢物转换为分类变量后的虚拟变量进行单因素logistic回归分析；

S2、对步骤S1中单因素分析中P＜0.05的变量，采用向后逐步回归的方法进行多因素logistic回归分析，得到关于CAP诊断的独立危险因子；

S3、基于多元逻辑回归模型绘制列线图，通过1000次bootstrap重抽样方法，从区分度、校准度、临床适用度三个方面，对预测模型进行内部验证；

对步骤S1至S3采用SPSS 26.0和R软件V.3.6.2进行统计分析，得到3个关于CAP诊断的独立危险因子，分别为：甘油磷酸(20:4/2:0)[PA(20:4/2:0)]、N-乙酰基神经氨酸(N-Acetyl-a-neuraminic acid)、CRP(C反应蛋白)，并通过列线图对预测模型进行可视化。

进一步地，还包括对CAP患者及健康人的BALF样本进行代谢组学分析，得到7种在CAP患者中显著差异表达的代谢物，即7种差异代谢物。

进一步地，7种所述差异代谢物分别为：二甲基二硫醚浓度(Dimethyldisulfide)、溶血磷脂胆酰(12:0/0:0)[LPC(12:0/0:0)]、甘油磷酸(20:4/2:0)[PA(20:4/2:0)]、胆碱(Choline)、嘧啶(Pyrimidine)、油酸(Oleic acid)、N-乙酰基神经氨酸(N-Acetyl-a-neuraminic acid)。

进一步地，所述模型用于区分健康人和CAP患者。

与现有技术相比，本方案的有益效果：

1、本发明通过对CAP患者及健康人的BALF样本进行代谢组学分析，确定了7种在CAP患者中显著差异表达的代谢物，不同于现有的血清代谢物或其他炎症标记物，这些代谢物能更直接地反映CAP患者下呼吸道的代谢变化，特异性及灵敏性更高，作为CAP生物标记物应用于临床具有很大潜力，并且可能为CAP发病机制提供新的认识。

2、本发明除了挖掘更适用于CAP的生物标记物，还构建了关于CAP诊断的临床预测模型，模型包含的变量不仅包括常用的实验室炎症指标，还纳入了新发现的代谢标记物，通过验证，该模型具有良好的预测能力。

3、相对于现有的诊断标准，本发明方法构建的该预测模型更具特异性、灵敏性，简易的列线图评分系统更易于临床实践的推广，为完善CAP的早期诊断、严重程度评估方法提供新的可能，对促进精准医学、个体化有效治疗有着重要意义。

附图说明

图1是本发明实施例中无监督的主成分分析中正离子和负离子模式下肺炎组和健康对照组BALF代谢谱；

图2是本发明实施例中有监督的正交偏最小二乘法判别分析中正离子和负离子模式下肺炎组和健康对照组间的代谢差异；

图3是本发明实施例中7种差异性代谢物与KEGG数据库参考谱图对比；

图4是本发明实施例中7种差异代谢物对CAP的诊断效能的

图5是本发明实施例中对预测模型进行可视化的列线图；

图6是本发明实施例中预测模型的ROC曲线；

图7是本发明实施例中预测模型的校准曲线；

图8是本发明实施例中预测模型的决策曲线分析。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明的实施例及附图，对本发明的技术方案进行进一步详细地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

实施例：

本发明实施例提供的方案为：一种肺炎诊断的临床预测模型构建方法，通过医院病历系统收集纳入研究对象的临床资料，根据参考范围及最佳截止值，将实验室炎性指标及7种差异代谢物的表达量转换为分类变量，分三步构建临床预测模型，具体包括以下步骤：

S1、对炎症指标及差异代谢物转换为分类变量后的虚拟变量进行单因素logistic回归分析；

S2、对步骤S1中单因素分析中P＜0.05的变量，采用向后逐步回归的方法进行多因素logistic回归分析，得到关于CAP诊断的独立危险因子；

S3、基于多元逻辑回归模型绘制列线图，通过1000次bootstrap重抽样方法，从区分度、校准度、临床适用度三个方面，对预测模型进行内部验证；

对步骤S1至S3采用SPSS 26.0和R软件V.3.6.2进行统计分析，得到3个关于CAP诊断的独立危险因子，分别为：甘油磷酸(20:4/2:0)[PA(20:4/2:0)]、N-乙酰基神经氨酸(N-Acetyl-a-neuraminic acid)、CRP(C反应蛋白)，并通过列线图对预测模型进行可视化。

本发明实施例方案的具体实施过程为：

1、肺泡灌洗液(BALF)样本的代谢组学分析

1.1BALF样本预处理

取50mg BALF样本至于EP管中，添加1000μL提取溶剂(乙腈-甲醇-水，2:2:1，含内标物)，涡旋振荡30s，45Hz下均匀化4min，并在冰水浴中超声处理5min，均匀化与超声处理循环重复3次后，-20℃下静置1h，4℃下12000rpm离心15min。将上清液转移到LC-MS进样瓶中，并在-80℃下储存，直到UHPLC-QE Orbitrap/MS分析。质量控制(QC)样品是通过从所有样品中混合等量的上清液制备的。

1.2LC-MS/MS检测

色谱条件：仪器采用Agilent 1290超高效液相色谱仪。色谱柱：UPLC HSS T3柱(2.1mm×100mm，1.8μm)。流速为0.5ml/min。进样体积为2μL。流动相：正离子模式：流动相：0.1％甲酸水溶液(A)，乙腈(B)；负离子模式：55mmol/L醋酸铵水溶液(A)；乙腈(B)。洗脱梯度设置如下：0min，1％B；1分钟，1％B；8分钟，99％B；10分钟，99％B；10.1分钟，1％B；12分钟，1％B。

质谱条件为：采用Q Exactive(Orbitrap MS,Thermo)质谱仪获得MS/MS光谱。ESI源条件设置如下：喷雾电压：3800V(正离子模式)，-3100V(负离子模式)；毛细管温度：320℃；鞘气流速：45Arb；辅助气流速：15Arb；扫描范围：70-1000m/z；一级分辨率：70000；二级分辨率：17500；分步碰撞能量的强度取值为3；分步碰撞能量为20/40/60eV。

1.3数据处理

MS原始数据文件(.raw)使用ProteoWizard软件转换为mzML格式，并由R包XCMS(3.2版)处理，得到一个由保留时间(RT)、质荷比(m/z)值和峰值强度组成的数据矩阵。在使用内部MS/MS数据库进行数据处理后，使用OSI-SMMS(版本1.0，大连化学数据解决方案信息技术有限公司)进行峰值注释。

1.4多元统计学分析

采用无监督的主成分分析(PCA)来考察样本的总体分布情况，正离子和负离子模式下均能观察到肺炎组和健康对照组BALF代谢谱有较明显的分离趋势(如图1所示)。然后采用有监督的正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)来进一步区分肺炎组和健康对照组间的代谢差异，如图2所示，正离子和负离子模式下均表现出显著的组间分类趋势。正离子模式下模型的R2X＝0.62，R2Y＝0.592，Q2Y＝0.344；负离子模式下模型的R2X＝0.937，R2Y＝0.68，Q2Y＝0.614。

1.5确定差异代谢物

结合多元统计分析OPLS-DA的VIP值和单变量统计分析student′st检验的P值来筛选两组间的显著差异代谢物，阈值为：VIP≥1且P＜0.05。基于以上方法，可以得到正负离子模式下7种差异性代谢物，通过与KEGG数据库参考谱图对比后最终鉴定7种差异性代谢物的分子式及名称，如下表1所示。

表1

CAP，community-acquired pneumonia；ESI mode，election spray ionizationmode；FC，fold Change；VIP，variable importance in the project ion；Status，theexpression of metabolites in CAP patients increased or decreased comparedwith healthy controls；↑，increased；↓；decreased.

由表1所示，分别为：二甲基二硫醚浓度(Dimethyldisulfide)、溶血磷脂胆酰(12:0/0:0)[LPC(12:0/0:0)]、甘油磷酸(20:4/2:0)[PA(20:4/2:0)]、胆碱(Choline)、嘧啶(Pyrimidine)、油酸(Oleicacid)、N-乙酰基神经氨酸(N-Acetyl-a-neuraminic acid)，如图3所示，溶血磷脂胆酰(12:0/0:0)[LPC(12:0/0:0)]、甘油磷酸(20:4/2:0)[PA(20:4/2:0)]在CAP患者中表达量下降，其余5种代谢物表达量上升。

1.6差异代谢物对CAP的诊断效能分析

为了进一步了解上述7种差异代谢物对CAP的诊断效能，利用SPSS26.0进行ROC曲线分析，如下表2所示。

表2

ROC curve analyss，receiver operating cnaracteristic curve analysis；CAP，community-acquired pneumonia；AUC，area under the curve.

通过表2及图4可知，上述7种代谢物AUC均＞0.7，且对应的敏感度及特异性都较高，说明其对CAP的诊断效能较高，这7种差异代谢物将联合相关实验室炎症指标，进一步构建关于肺炎诊断的临床预测模型。

2、临床预测模型的构建及验证

通过医院病历系统收集纳入研究对象的临床资料，根据参考范围及最佳截止值将实验室炎性指标及7种差异代谢物的表达量转换为分类变量。分三步构建临床预测模型：(1)对炎症指标及差异代谢物转换为分类变量后的虚拟变量进行单因素logistic回归分析；(2)对单因素分析中P＜0.05的变量，采用向后逐步回归的方法进行多因素logistic回归分析，得到关于CAP诊断的独立危险因子；(3)基于多元逻辑回归模型绘制列线图。通过1000次bootstrap重抽样方法，从区分度、校准度、临床适用度三个方面，对预测模型进行内部验证。以上步骤使用SPSS 26.0和R软件V.3.6.2进行统计分析。

经过以上分析，最终得到3个关于CAP诊断的独立危险因子，如下表3所示。

表3

由表3知：最终得到3个关于CAP诊断的独立危险因子：甘油磷酸(20:4/2:0)[PA(20:4/2:0)]、N-乙酰基神经氨酸(N-Acetyl-a-neuraminic acid)、CRP(C反应蛋白)，并通过列线图对预测模型进行可视化(如图5所示)。预测模型的ROC曲线如图6所示，1000次bootstrap得到的C-指数为0.984，该模型用于区分健康人和CAP患者的准确性较高。Hosmer-Lemeshow检验的P值为0.701，校准曲线的预测概率与与实际概率基本吻合(如图7所示)，说明通过列线图模型得到的CAP预测概率与实际概率差别不大，模型准确度较高。从决策曲线分析(DCA)(如图8所示)可以看出，在很大范围内，对预测模型帮助诊断的CAP患者进行干预比全部治疗或全部不治疗的获益大，该模型的临床适用度较高。

通过本发明的上述实施例，本发明通过对CAP患者及健康人的BALF样本进行代谢组学分析，发现了7种在CAP患者中显著差异表达的代谢物，不同于现有的血清代谢物或其他炎症标记物，这些代谢物能更直接地反映CAP患者下呼吸道的代谢变化，特异性及灵敏性更高，作为CAP生物标记物应用于临床具有很大潜力，并且可能为CAP发病机制提供新的认识。本发明除了挖掘更适用于CAP的生物标记物，还构建了关于CAP诊断的临床预测模型，模型包含的变量不仅包括常用的实验室炎症指标，还纳入了本发明新发现的代谢标记物，通过验证，该模型具有良好的预测能力。相对于现有的诊断标准，该预测模型更具特异性、灵敏性，简易的列线图评分系统更易于临床实践的推广，为完善CAP的早期诊断、严重程度评估方法提供新的可能，对促进精准医学、个体化有效治疗有着重要意义。

以上具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。