一类特异性分子靶标及其用于快速检测粪肠球菌的方法

技术领域

本发明属于微生物检验技术领域，具体涉及一类特异性分子靶标及其用于快速检测粪肠球菌的方法。

背景技术

肠球菌属(Enterococcus spp.)为革兰氏阳性球菌，外形呈圆形或卵圆形、单个或短链状分布，是人和动物肠道的正常菌群。目前，肠球菌属主要包括粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、鸟肠球菌(Enterococcusavium)、酪黄肠球菌(Enterococcus casseliflavus)等19个种，在临床样本分离株中粪肠球菌所占比例最高，其次为屎肠球菌(李金钟,肠球菌分类与鉴定新进展.临床检验杂志，2006,24(5),228-230)。作为人和动物肠道的正常菌群，一般情况下肠球菌不会引起疾病，但在机体免疫力下降时，它就会成为条件致病菌引起多种感染，如泌尿系统感染、伤口感染、脑膜炎、心内膜炎等，严重时可危及生命(Maekawa,T.；Fukaya,R.；Takamatsu,S.；Itoyama,S.；Miyoshi,E.,Possible involvement of Enterococcus infection in thepathogenesis of chronic pancreatitis and cancer.Biochemical and BiophysicalResearch Communications 2018,506,962-969)。有研究表明，在2011-2014年期间，肠球菌是造成院内感染的第二大病原菌，占到总人数的14％，其检出率仅次于大肠杆菌，超过铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌(Lindsey M.W.；Amy K.W.；Brandi L.；Margaret A.D.；JeanP.；Alexander J.K.；Jonathan R.E.；Dawn M.S.,Antimicrobial-resistant pathogensassociated with healthcare-associated infections:summary of data reported tothe national healthcare safety network at the centers for disease control andprevention,2011-2014.Infect Control Hosp Epidemiol 2016,37,1288-1301.)。其中粪肠球菌感染比例最高，约占80-90％，屎肠球菌约占10％，鸟肠球菌、鸡肠球菌、棉子糖肠球菌等也可引起感染，但是感染几率相对较低(Vinodkumar,C.S.；Srinivasa,H.；Basavarajappa,K.G.；Geethalakshmi S.；Bandekar,N.,Isolation of bacteriophagesto multi-drug resistant Enterococci obtained from diabetic foot:a novelantimicrobial agent waiting in the shelf？Indian Journal of Pathology&Microbiology 2011,54(1),90-95)。肠球菌的广泛分布和较强的环境适应能力可能是其能造成临床感染的重要原因。

粪肠球菌的检测方法主要有传统的生理生化反应、API生化鉴定条、微生物自动鉴定仪等，这些方法存在不同的优缺点，如：传统的生理生化反应结果相对准确，但其操作步骤相对繁琐，有时需要补加试验进行鉴别，耗时长；API生化鉴定条具有微量简易鉴测技术的优点，可鉴定几乎所有的细菌，其缺点是各系统差异较大，价格偏贵，同时检测结果的假阳性较多；微生物自动鉴定仪操作相对简便，但价格较昂贵。以PCR为主的分子生物学检测方法以其快速、准确、简便的特点逐渐成为取代传统检测方法最具潜力的检测技术之一，而靶标序列的特异性是PCR检测技术的关键。因此，系统性的挖掘特异性新靶标，建立准确、快速的PCR检测方法，对于粪肠球菌的临床检测及流行传播规律调查研究具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一类特异性分子靶标及其用于快速检测粪肠球菌的方法，可具有检测时间短、检测成本低、操作简单、特异性强等优点，无需经过生化鉴定即可检测到粪肠球菌，更加具有实用性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一类特异性分子靶标，所述特异性分子靶标的核苷酸碱基序列如SEQ ID No.1-SEQ IDNo.20所示。

本发明还提供了上述特异性分子靶标用于快速检测粪肠球菌的方法，具体方法步骤如下：

(1)根据碱基序列SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.20中的任一个特异性分子靶标来设计特异性扩增引物对；

(2)提取样品DNA，采用PCR法扩增；

(3)凝胶电泳检测扩增产物，当电泳结果出现相应的单一扩增条带，则判断样品中含有目标菌，反之则判断样品中不含目标菌。

优选的，步骤(1)中，碱基序列SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.20分别对应设计的特异性扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.1F-SEQ ID NO.1R、SEQ ID NO.2F-SEQ IDNO.2R、……、SEQ ID NO.19F-SEQ ID NO.19R、SEQ ID NO.20F-SEQ ID NO.20R所示。

优选的，步骤(2)中，PCR法选择任一特异性扩增引物对组成PCR检测体系，扩增参数具体为：

PCR检测体系为25μL，其中包括：2×PCR Mix 12.5μL、模板DNA 1μL、10μM上下游引物各1.0μL，灭菌双蒸水补足体积至25μL；

PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s；50-62℃退火30s；72℃延伸30-90s，共进行35个循环；72℃延伸10min。

与现有技术相比，本发明检测方法具有检测时间短、无需经过生化鉴定即可检测到粪肠球菌，降低了检测成本；同时本发明检测方法可用于检测某些种间差异不明显的菌株，避免出现假阳性或假阴性结果，更加具有实用性；本发明的特异性分子靶标即20个保守核酸具有单一的特异性，检测精准，结果判定简单。

附图说明

图1为实施例2中粪肠球菌的核苷酸碱基序列SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.20电泳图；

图2为实施例2中粪肠球菌特异性分子靶标的PCR检测电泳结果图；图中，图(a)-(t)分别为SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.20；

图3为实施例2中粪肠球菌PCR检测方法特异性评价电泳结果图；图中，图(a)-(t)分别为SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.20。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。

本发明对我国“世界长寿乡”—蕉岭县1300份人源样本中微生物分布情况进行了调查，分离并保存了228株肠球菌，其中粪肠球菌占53.51％、鸟肠球菌占13.16％、屎肠球菌占6.58％、希拉肠球菌占4.39％、酪黄肠球菌占3.51％、其它肠球菌占18.86％，为本发明特异性靶标的挖掘及验证提供了强有力的保障。因此，以下实施例中所涉及到的人源分离株均为本发明从我国广东省蕉岭县人源样本中获得的微生物分离菌株。

本实施例1

本实施例提供特异性分子靶标，所述特异性分子靶标的核苷酸碱基序列如SEQ IDNo.1-SEQ ID No.20所示。

本实施例2

本实施例提供上述特异性分子靶标用于快速检测粪肠球菌的方法，具体方法步骤如下：

(1)引物的设计：根据碱基序列SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.20中的任一个特异性分子靶标来设计特异性扩增引物对，引物对序列如下表1：

表1粪肠球菌特异性PCR检测引物序列对

(2)DNA模板制备：将粪肠球菌菌株在LB液体培养基中增菌培养，使用商品化的细菌基因组DNA抽提试剂盒提取细菌基因组DNA，作为待检模板；采用PCR法扩增，PCR检测体系及扩增程序如下：

PCR检测体系为25μL，其中包括：2×PCR Mix 12.5μL、模板DNA 1μL、10μM上下游引物各1.0μL，灭菌双蒸水补足体积至25μL；

PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸60s，共进行35个循环；72℃延伸10min。

(3)PCR方法检测结果的判定：凝胶电泳检测扩增产物，观察电泳结果扩增产物分别在293、185、919、298、851、725、533、231、1361、225、186、1064、1045、419、608、521、253、599、314、211bp位置是否存在单一扩增条带，如果存在，说明样品中含有粪肠球菌；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有粪肠球菌。

PCR检测方法的特异性评价结果

取23株粪肠球菌，酪黄肠球菌、屎肠球菌、希拉肠球菌等39株其他肠球菌，大肠埃希氏菌、志贺氏菌等16株非肠球菌按照上述方法进行PCR检测，结果如图1-3所示，20种特异性引物设计的检测方法中，只有粪肠球菌显示出特异性扩增条带，其他肠球菌及非肠球菌菌株均无特异性条带。所用菌株及检测结果如下表2所示，表中检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性，表2中显示，只有粪肠球菌的检测结果显示为阳性。由上分析可知，本实施例所得检测方法对粪肠球菌的检测具有很强的特异性。

表2实施例2中粪肠球菌特异性评价试验结果

实施例3

粪肠球菌疑似菌株的检测

利用实施例2中的粪肠球菌的PCR检测方法对73株从人源样品中分离的肠球菌疑似菌株进行检测，人源样品采集于广东省蕉岭县广福镇长寿老人的粪便及尿液，样品处理及疑似菌株的分离参见国标法(GB/T 38735-2020)。利用本发明方法，粪肠球菌检出菌株数为36株，其他疑似菌株经鉴定为其他肠球菌的种(表3)，与16s rDNA鉴定结果相一致，且进一步验证了2株经16s rDNA鉴定为粪肠球菌。通过本实施例说明本发明的粪肠球菌的20种PCR检测方法可靠性高。

表3肠球菌疑似菌株的检测