一种生物制剂及缓解麻疯树镉胁迫和提高镉修复效率的方法

技术领域

本发明涉及生物制剂制备技术领域，尤其涉及一种生物制剂及缓解麻疯树镉胁迫和提高镉修复效率的方法。

背景技术

镉是农业和工业活动中释放到环境中的两种最常见的重金属污染物，对植物造成毒性效应影响植物的生长发育，也可通过生物链进入人体，对人体造成伤害，因此镉污染引起了世界的广泛关注。污染土壤的植物修复技术与传统的化学、物理修复技术相比，具有非破坏性、安全性、原位性、无二次污染和经济性等优点，在污染土壤修复方面具有广阔的前景。成功的植物修复需要植物具有多种特征，如能生长在重金属污染土地上、快速生长、具有高的生物量、能在易于收获的部分累积重金属等。

麻疯树(Jatropha curcas L.)为大戟科(Euphorbiaceae)麻疯树属(JatrophaL.)植物，落叶灌木或小乔木，种仁含油率可高达63％，并在凝固点等关键指标上接近或优于0

因此，如何缓解重金属对麻疯树的毒害以及生长抑制作用，提高其对土壤的修复效率，是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生物制剂及缓解麻疯树镉胁迫和提高镉修复效率的方法，本发明通过菌根真菌(AMF)、生物炭、堆肥的使用，可以减弱重金属对麻疯树生长的抑制作用。具体可以减轻镉的毒害效应，促进麻疯树的生长，增加麻疯树对镉的富集能力，为麻疯树修复镉污染土壤提供参考。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种生物制剂，包括：AMF菌剂、生物炭和秸秆堆肥；

所述AMF菌剂中有效菌种为异形根孢囊霉；所述AMF菌剂中繁殖体数≥70个/mL。

优选的，所述生物炭为玉米秸秆生物炭。

优选的，所述秸秆堆肥的制备方法为：向秸秆中喷洒石灰水，然后加入尿素、过磷酸钙和发酵助剂，得混合物料，调节混合物料的含水率为55～65％，并调节pH至7.5～8.5，堆置发酵，当混合物料温度达到63～67℃时，第一次翻堆；经3～4d发酵后第二次翻堆；再经3～4d发酵后第三次翻堆，再经3～4d发酵后，经二次发酵获得发酵产物。

优选的，所述石灰水的质量浓度为0.5～1.5％。

优选的，所述尿素的质量浓度为0.5～1.5％；所述过磷酸钙的质量浓度为8～12％。

优选的，所述发酵助剂的用量为秸秆质量的0.1～0.3％；所述二次发酵的时间为20～40d。

本发明还提供了一种缓解麻疯树镉胁迫和提高镉修复效率的方法，包括如下步骤：

(1)将所述AMF菌剂与沙壤土混合得育苗基质；

(2)将麻疯树种子种植在步骤(1)得到的育苗基质中，得麻疯树菌根化苗；

(3)待麻疯树根化苗长出5片真叶后，将步骤(2)得到的麻疯树菌根化苗移栽到栽培基质中。

优选的，所述沙壤土为土壤和沙，所述土壤和沙的质量比为0.5～1.5：0.5～1.5。

优选的，所述栽培基质包括所述生物炭和秸秆堆肥；所述生物炭和秸秆堆肥的用量分别为镉污染土壤质量的6～10％。

优选的，所述AMF菌剂与沙壤土的质量比为0.5～1.5：98.5～99.5。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明通过盆栽实验，研究AMF、生物炭和秸秆堆肥对镉胁迫下麻疯树生长和镉富集能力的影响，为麻疯树修复重金属污染土壤提供参考。结果表明：AMF(T1)、AMF+生物炭(T2)、AMF+秸秆堆肥(T3)，AMF+生物炭+秸秆堆肥(T4)均能减弱铜锌铅镉复合胁迫的毒害效应，其中以T4处理的效果最好。与重金属土壤(CK2)相比，T4处理后CAT、POD活性增加、全株镉的含量增加30.87倍。AMF+生物炭+秸秆堆肥(T4处理)促进了镉胁迫下麻疯树的生长，增加了生物量，增加全株镉的富集，提高了麻疯树对镉污染土壤的修复能力，该研究可为重金属富集植物修复重金属污染土壤提供参考。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为AMF侵染情况图(20×10倍)；

图2为各处理麻疯树幼苗生长情况比较。

具体实施方式

本发明提供了一种生物制剂，包括：AMF菌剂、生物炭和秸秆堆肥；

所述AMF菌剂中有效菌种为异形根孢囊霉；所述AMF菌剂中繁殖体数≥70个/mL；优选为70～90个/mL；进一步优选为75～85个/mL；更优选为80个/mL。

在本发明中，所述生物炭为玉米秸秆生物炭。

在本发明中，所述秸秆堆肥的制备方法为：向秸秆中喷洒石灰水，然后加入尿素、过磷酸钙和发酵助剂，得混合物料，调节混合物料的含水率为55～65％，并调节pH至7.5～8.5，堆置发酵，当混合物料温度达到63～67℃时，第一次翻堆；经3～4d发酵后第二次翻堆；再经3～4d发酵后第三次翻堆，再经3～4d发酵后，二次发酵；

在本发明中，调节含水率优选为57～63％；进一步优选为60％。

在本发明中，调节pH优选为8.5。

在本发明中，优选当混合物料温度达到65℃时，第一次翻堆；经4d发酵后第二次翻堆；再经4d发酵后第三次翻堆，再经4d发酵后，二次发酵。

在本发明中，所述石灰水的质量浓度为0.5～1.5％；优选为0.7～1.3％；进一步优选为0.9～1.1％；更优选为1％。

在本发明中，所述尿素的质量浓度为0.5～1.5％；优选为0.7～1.3％；进一步优选为0.9～1.1％；更优选为1％。

在本发明中所述过磷酸钙的质量浓度为8～12％；优选为9～11％；进一步优选为10％。

在本发明中，所述发酵助剂的用量为秸秆质量的0.1～0.3％；优选为0.2％。

在本发明中所述二次发酵的时间为20～40d；优选为24～36d；进一步优选为28～32d；更优选为30d。

本发明还提供了一种缓解麻疯树镉胁迫和提高镉修复效率的方法，包括如下步骤：

(1)将所述AMF菌剂与沙壤土混合得育苗基质；

(2)将麻疯树种子种植在步骤(1)得到的育苗基质中，得麻疯树菌根化苗；

(3)待麻疯树根化苗长出5片真叶后，将步骤(2)得到的麻疯树菌根化苗移栽到栽培基质中。

在本发明中，所述沙壤土为土壤和沙，所述土壤和沙的质量比为0.5～1.5：0.5～1.5；优选为0.7～1.3：0.7～1.3；进一步优选为0.9～1.1：0.9～1.1；更优选为1：1。

在本发明中，所述栽培基质包括所述生物炭和秸秆堆肥；所述生物炭和秸秆堆肥的用量分别为镉污染土壤质量的6～10％；优选为7～9％；进一步优选为8％。

在本发明中，所述AMF菌剂与沙壤土的质量比为0.5～1.5：98.5～99.5；优选为0.7～1.3：98.7～99.3；进一步优选为0.9～1.1：98.9～99.1；更优选为1：99。

本发明所述AMF菌剂可以为现有技术中所记载的普通菌根真菌；优选为北京金必来生物科技有限公司生产的AMF菌剂。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

以下实施例所用到的AMF菌剂来自于北京金必来生物科技有限公司。发酵助剂为金宝贝肥料发酵剂。

实施例1

一种缓解麻疯树镉胁迫和提高镉修复效率的方法，步骤如下：

(1)将AMF菌剂(有效菌种为异形根孢囊霉；繁殖体数70个/mL)与沙壤土(包括土壤和沙，质量比为0.5：1.5)混合得育苗基质；AMF菌剂与沙壤土的质量比为0.5：99.5；

(2)将麻疯树种子种植在步骤(1)得到的育苗基质中，得麻疯树菌根化苗；

(3)待麻疯树根化苗长出5片真叶后，将步骤(2)得到的麻疯树菌根化苗移栽到栽培基质中；

所述栽培基质为玉米秸秆生物炭、秸秆堆肥和土壤；所述玉米秸秆生物炭和秸秆堆肥的用量分别为镉污染土壤质量6％；

所述秸秆堆肥的制备方法为：向粉碎成2cm的秸秆中喷洒0.5％石灰水，然后加入0.5％尿素、8％过磷酸钙和0.1％发酵助剂(提前按照1:10的比例采用玉米面进行稀释)，得混合物料，调节混合物料的含水率为55％，并调节pH至8，堆置发酵，堆体用直径10cm的尖头木棒均匀打孔通气，用厚膜覆盖。当混合物料温度达到63℃时，第一次翻堆；经3d发酵后第二次翻堆；再经3d发酵后第三次翻堆，再经3d发酵后，将主发酵物堆成1-2米高的堆垛进行二次发酵并腐熟，当温度稳定在40℃左右时即达腐熟，获得试验用的秸秆堆肥。

实施例2

一种缓解麻疯树镉胁迫和提高镉修复效率的方法，步骤如下：

(1)将AMF菌剂(有效菌种为异形根孢囊霉；繁殖体数90个/mL)与沙壤土(包括土壤和沙，质量比为1.5：1.5)混合得育苗基质；AMF菌剂与沙壤土的质量比为1.5：98.5；

(2)将麻疯树种子种植在步骤(1)得到的育苗基质中，得麻疯树菌根化苗；

(3)待麻疯树根化苗长出5片真叶后，将步骤(2)得到的麻疯树菌根化苗移栽到栽培基质中；

所述栽培基质为玉米秸秆生物炭、秸秆堆肥和土壤；所述玉米秸秆生物炭和秸秆堆肥的用量分别为镉污染土壤质量的10％；

所述秸秆堆肥的制备方法为：向粉碎成5cm的秸秆中喷洒1.5％石灰水，然后加入1.5％尿素、12％过磷酸钙和0.3％发酵助剂(提前按照1:10的比例采用玉米面进行稀释)，得混合物料，调节混合物料的含水率为65％，并调节pH至9，堆置发酵，堆体用直径10cm的尖头木棒均匀打孔通气，用厚膜覆盖。当混合物料温度达到67℃时，第一次翻堆；经4d发酵后第二次翻堆；再经4d发酵后第三次翻堆，再经4d发酵后，将主发酵物堆成1-2米高的堆垛进行二次发酵并腐熟，当温度稳定在40℃左右时即达腐熟，获得试验用的秸秆堆肥。

实施例3

一种缓解麻疯树镉胁迫和提高镉修复效率的方法，步骤如下：

(1)将AMF菌剂(有效菌种为异形根孢囊霉；繁殖体数80个/mL)与沙壤土(包括土壤和沙，质量比为1：1)混合得育苗基质；AMF菌剂与沙壤土的质量比为1：99；

(2)将麻疯树种子种植在步骤(1)得到的育苗基质中，得麻疯树菌根化苗；

(3)待麻疯树根化苗长出5片真叶后，将步骤(2)得到的麻疯树菌根化苗移栽到栽培基质中；

所述栽培基质为玉米秸秆生物炭、秸秆堆肥和土壤；所述玉米秸秆生物炭和秸秆堆肥的用量分别为镉污染土壤质量8％；

所述秸秆堆肥的制备方法为：向粉碎成3cm的秸秆中喷洒1％石灰水，然后加入1％尿素、10％过磷酸钙和0.2％发酵助剂(提前按照1:10的比例采用玉米面进行稀释)，得混合物料，调节混合物料的含水率为60％，并调节pH至8.5，堆置发酵，堆体用直径10cm的尖头木棒均匀打孔通气，用厚膜覆盖。当混合物料温度达到65℃时，第一次翻堆；经4d发酵后第二次翻堆；再经4d发酵后第三次翻堆，再经4d发酵后，将主发酵物堆成1-2米高的堆垛进行二次发酵并腐熟，当温度稳定在40℃左右时即达腐熟，获得试验用的秸秆堆肥。

实验例1

1材料与方法

1.1实验材料

实验所用麻疯树种子采集于四川省凉山州德昌县麻栗镇。

AMF菌剂(繁殖体数≥70个/mL，有效菌种名称：异形根孢囊霉)：由北京金必来生物科技有限公司赠送。

玉米秸秆生物炭：购于河南立泽环保科技有限公司。

秸秆堆肥：晒干的玉米秸秆，采用秸秆粉碎机粉碎成3cm左右的节段，按照预湿、拌料、建堆、翻堆的方法进行培养料的主发酵。过程如下：将粉碎的玉米秸秆摊在水泥地上，喷洒1％的石灰水，使其慢慢吸进大部分的水分。加入1％的尿素、10％的过磷酸钙、同时加入稀释的发酵助剂(发酵助剂按照玉米秸秆干物质量0.2％加入，并按照1:10的比例采用玉米面进行稀释)，调节混合物料含水率为60％，用石灰将pH值调至8。按照堆置法堆置，堆体用直径10cm的尖头木棒均匀打孔通气，用厚膜覆盖。用温度计测得堆料温度为65℃时，第一次翻堆；经4d发酵后第二次翻堆；再经4d发酵后第三次翻堆，再经4d发酵后，完成主发酵。将主发酵物堆成1-2米高的堆垛进行二次发酵并腐熟，当温度稳定在40℃左右时即达腐熟，获得试验用的秸秆堆肥。试验所得秸秆堆肥理化性质如下：pH值7.3，有机质40％，氮2.08％，五氧化二磷1.25％，氯化钾1.84％，总砷2mg/kg，总汞1mg/kg，总铅22mg/kg，总镉<0.4mg/kg，总铬120mg/kg，上述指标均符合有机肥料NY/T525-2021的标准。

1.2实验方法

1.2.1供试土壤

采集西昌学院林地边缘表层土壤，放于通风处，待自然风干后过10目筛备用。土壤的理化性质如下：pH为6.43，有机质75.9mg/kg，全磷1.22g/kg，有效磷11.2mg/kg，全氮1.43g/kg，水解氮120mg/kg，全钾17.6g/kg，速效钾95mg/kg，镉0.66ug/g。试验前采用50mg/kg镉(用CdCl

1.2.1育苗、AMF侵染及移栽

麻疯树种子的预处理：选择大小均匀且饱满的麻疯树种子，用1％KMnO

麻疯树菌根化苗育苗：将AMF菌剂与沙壤土(土壤与沙按照1：1混合)按照1:99的比例混合，将处理好的麻疯树种子播种到上述基质中育苗，育成菌根化苗后进行移栽。采用不加菌根真菌菌剂的沙壤土作为对照苗的培育基质，培育与菌根化苗长势一致的对照苗。

AMF侵染情况观察方法如下：取3株长出5片真叶的麻疯树幼苗，用纯水洗净根部后剪成1cm的根断。每个样品选取10个根段放入试管中，按照10％(w/v)氢氧化钾透明、10％的过氧化氢漂白、2％HCl酸化、乳酸酚棉蓝染液染色、显微镜下观察AMF侵染情况，并计算根系侵染率。侵染率的计算公式如下：

侵染率＝(菌根侵染的根段数/镜检的根段总数)×100％

1.2.2麻疯树植株栽培

温室盆栽试验在西昌学院温室大棚中进行，采用规格直径15cm、高12.5cm的盆钵作为栽培容器(底部放托盘防止重金属流失)，每盆中加入2Kg的土壤。试验共设6个处理：CK1、CK2、T1：AMF、T2：AMF+生物炭、T3：AMF+秸秆堆肥(T3)、T4：AMF+生物炭+秸秆堆肥。其中，CK1采用未老化的土壤；CK2、T1、T2、T3、T4均采用镉污染土壤。CK1、Ck2、T1直接土壤装盆，T2处理生物炭按照土壤质量8％的比例、T3处理堆肥按照土壤质量8％的比例、T4处理生物炭、堆肥各按土壤质量8％的比例与土壤均匀混合后装盆。选取长出5片真叶长势一致的上述幼苗，移栽到盆钵中。CK1和CK2处理移栽对照苗；T1、T2、T3、T4采用菌根化苗。保持各处理土壤质量相对一致。每处理移栽8株幼苗，试验期间进行常规的管理。移栽后30天采样，测定植株的生物量及生理生化指标。

1.2.3数据测定方法

测定植株的生物量：每处理取3株植株，用纯水洗净根部后，将植株的根、茎、叶剪下并测其鲜重，将植株的根、茎、叶分别放入恒温干燥箱中80℃烘干至恒重。将每处理烘干至恒重的根、茎、叶分别混合，粉碎过筛后用于氮、磷、镉的测定，其余指标测定均采用新鲜的植株测定。植株氮含量采用奈氏比色法；植株磷含量采用钼锑抗比色法；丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法测定；过氧化物酶活性采用愈创木酚法测定；过氧化氢酶活性的测定采用紫外吸收法；镉含量测定样品经盐酸-HF高温密闭消解后采用ICP-MS测定镉含量。

1.3数据处理与分析

本次实验的实验数据主要采用Excel进行统计计算，采样SPSS 24.0进行统计分析，以及LSD法进行差异显著性分析(P＜0.05)。

2结果与分析

2.1AMF侵染麻疯树

AMF侵染情况见图1。3株麻疯树的根侵染率分别为90％，80％，90％。由图1可知，麻疯树的根部被AMF成功侵染。

2.2不同处理对麻疯树生物量的影响

由表1可知，与CK2相比，T1、T2、T3、T4显著提高了麻疯树根鲜(干)重、茎鲜(干)重、叶鲜(干)重、全株鲜(干)重。T4处理的效果优于T1、T2、T3处理，与T1、T2、T3相比，T4处理全株鲜(干)重显著提高。与CK2处理相比，T4处理全株鲜重增加502.14％，全株干重增加433.28％。

表1麻疯树幼苗生物量

麻疯树根系是直接接触土壤的器官，也是在根茎叶中对重金属胁迫表现最明显的植物器官。如图2，在没有重金属胁迫的情况下，CK1根系发达，并且长出了白色的新根，CK2的根在重金属的胁迫下明显受损。与CK2相比，T1、T2、T3、T4根有明显的恢复，T4处理有白色的新根长出，说明T4处理减弱了重金属对根的破坏作用。图1AMF侵染情况图(20×10倍)；图2各处理麻疯树幼苗生长情况比较。

2.2不同处理对麻疯树营养元素吸收的影响

由表2可知，与CK1相比，CK2全株氮和磷的含量显著降低，说明镉胁迫显著降低了麻疯树对氮磷的吸收；与CK2相比，T1、T2、T3、T4全株氮含量和全株磷含量均显著增加，其中T4处理全株氮和全株磷含量分别比CK2增加了52.55％和67.99％，这说明T4处理是有效的，可以促进镉胁迫下麻疯树对氮磷的吸收。

表2麻疯树幼苗营养物质含量

2.3不同处理对麻疯树丙二醛含量和抗性酶活性的影响

由表3可知，与CK1相比，CK2叶片和根系MDA含量分别提高了526.4％、227.6％，植物经过AMF、生物炭或秸秆堆肥处理后，T1、T2、T3、T4处理叶片和根系MDA含量均比CK2显著下降，其中T4下降程度最大。

与CK1相比，CK2的CAT、POD活性均有提高；与CK2相比，T1、T2、T3、T4处理叶片和根系的CAT、POD活性均显著增加，T4处理的CAT、POD活性最大，这也说明三者协同作用能显著增加抗氧化酶的活性，清除膜氧化产生的自由基，减少了膜脂的过氧化作用，增加了麻疯树对镉的抗性。

表3不同处理麻疯树抗氧化酶的浓度和含量

2.4不同处理对麻疯树植株镉含量的影响

与CK1相比，CK2、T1、T2、T3、T4处理根、茎、叶镉的含量显著增加，CK2处理全株镉含量为CK1的3.51倍，说明了麻疯树具有修复镉污染土壤的潜力。与CK2相比，T1、T2、T3、T4处理全株镉含量显著增加，其中T4处理全株镉含量增加30.87倍，显著提高了麻疯树对土壤中镉的提取率，显著增加了麻疯树对镉污染土壤的修复效率。(见表4)。

表4不同处理麻疯树的浓度和含量

3结论

高浓度的镉抑制了麻疯树的生长。与CK2相比，AMF、生物炭和秸秆堆肥联合作用(T4处理)显著提高了麻疯树根鲜(干)重、茎鲜(干)重、叶鲜(干)重、全株鲜(干)重，说明该处理是有效的。

植物体内的大量元素中，氮和磷是必不可少的，在重金属胁迫环境下，植物吸收和运输氮和磷的通道会受到破坏，植物体内的氮和磷减少。与CK2相比，T4处理的全株氮含量和全株磷含量显著增加，研究结果表明AMF+生物炭+秸秆堆肥三者协同作用可以增加重金属镉胁迫下植株的氮磷含量。

当植物受到重金属镉胁迫情况下，其植物体内会产生氧自由基，使膜脂上的不饱和脂肪酸氧化产生丙二醛。与CK2相比，处理叶片或根系的CAT、POD活性均显著增加，T4处理的CAT、POD活性最大，清除了重金属镉胁迫环境下产生的氧自由基，减少了膜脂氧化产物丙二醛的含量。研究结果表明与CK2相比，T1、T2、T3、T4处理叶片和根系MDA含量显著下降，其中T4下降程度最大，说明AMF+生物炭+秸秆堆肥三者协同作用能显著增加抗氧化酶的活性，减少膜脂氧化，增加麻疯树对镉的抗性。

麻疯树是一种极好的环境修复植物材料，可用于镉的修复，然而高浓度的镉将降低麻疯树的生长速度，降低了麻疯树对镉污染土壤的修复效率。与CK2处理相比，T1、T2、T3、T4处理全株镉含量显著增加，其中T4处理全株镉含量增加30.87倍，提高了麻疯树对土壤中镉的提取率，增加了麻疯树对镉污染土壤的修复效率，该研究成果可为麻疯树修复镉污染土壤提供参考。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。