一种用于检测高度近视的检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体地说，是关于一种用于检测高度近视的检测试剂盒及其应用。

背景技术

高度近视(high myopia,HM)是屈光度为-6.00D以上或眼轴≥26mm的一种屈光不正，在东南亚青年的患病率高达10-20％。除造成视功能的严重损害外，高度近视还常伴有其他眼底的退行性改变如黄斑病变等，而高度近视的并发症如视网膜脱离等是致盲的重要原因之一。目前研究认为，近视是一种由多种因素决定的疾病，主要成因包含遗传因素和环境因素，而遗传因素在高度近视中发挥着至关重要的作用。

群体和家系研究显示高度近视的遗传方式主要为单基因遗传，有常染色体隐性遗传、常染色体显性遗传、性连锁隐性遗传等各种遗传方式。目前已开始应用检测单核苷酸多态性的方法和全基因组扫描等技术进行高度近视的基因定位和候选基因的克隆筛查工作，但PCR-RFLP操作复杂耗时，结果可信度差，扩增条件要求严格，操作繁琐；基因芯片快速高效，但其造价高；Sanger测序费用较高，且杂合体不易分型。除了检测方法本身的弊端之外，研究体系的设立或评估方法的差异也会导致结果的大相庭径。如已有专利申请文献(申请号为CN202010903371.6)建立了高度近视易感基因与遗传风险的关联分析通过SNP位点的全面Meta分析构建了配套的高度近视遗传风险评估体系，技术的实现是借助质谱法。该方法较为繁琐，且耗时长。

高度近视在临床上可通过验光、测眼轴明确诊断。针对目前高度近视相关基因定位技术的不足及判别体系的复杂情况，急需提出新的检测思路和方案，尽早进行高度近视基因筛查，了解自身高度近视的遗传风险，可针对性地进行早期预防和治疗。特别是当下疫情肆虐，线上授课模式的开展使得近视防控面临巨大挑战的。因此有必要建立一种效能好、通量高、成本低的高度近视评估方法，以实现快速大规模人群高度近视风险的普筛。

鸟苷酸结合蛋白(GBPs)是干扰素(IFN)诱导的GTPases大家族，由人类中十个高度同源的GBP成员组成，称为GBP-1至GBP-10。GBPs最初被发现参与抗病原体的细胞自主免疫。几项研究还表明GBPs对肿瘤细胞具有抗血管生成活性和抗肿瘤发生作用。最近研究发现，GBP6有望作为口腔鳞状细胞癌患者的新型诊断和预后生物标志物。

IGFN1，即免疫球蛋白样和纤连蛋白III型结构域1，是真核翻译延伸因子1A(eEF1A)的结合蛋白。IGFN1在眼部组织广泛表达，如RPE，视网膜中央凹和黄斑以及晶状体。人IGFN1包含四个纤连蛋白III和四个免疫球蛋白结构域。当神经元细胞中的eEF1A1表达下降时，敲除小鼠Eefla2基因会导致运动神经元的变性。eEF1A的活性可能通过与IGFN1结合而下调，这暗示着IGFN1在蛋白质合成调节过程中的调节作用。已在中国人群中发现，IGFN1与息肉样脉络膜血管病变的相关。

发明内容

基于多年的临床研究经验，本发明的发明人首次发现了GBP6基因和IGFN1基因突变可以作为揭示高度近视易感性的生物标志物。因此，本发明公开了相关实验方法、检测位点、引物信息及反应体系，旨在为及时诊断高度近视的遗传性，及早进行临床干预提供一新思路。因此，本发明的第一个目的在于提供一种用于检测高度近视的检测试剂盒，采用该检测试剂盒进行检测，可以解决大规模人群的高度近视遗传风险水平普筛，做到近视的早发现、早治疗，具有检测效率高、成本低的特点，更利于推广。本发明的第二个目的是在于提供一种用于检测高度近视的检测试剂盒的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

作为本发明的第一个方面，一种用于检测高度近视的检测试剂盒，包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的特异性引物对以及核苷酸序列分别如SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4所示的特异性引物对。

根据本发明，所述检测试剂盒还包括反应体系，所述反应体系为30μL，包括LongAmp Taq DNA聚合酶1μL，5x GC buffer 5μL，10mM dNTPs 0.75μL，DNA样本1μL，10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，余量为水。

根据本发明，所述PCR检测试剂盒还包括扩增程序：98℃变性3min；进入循环，98℃变性10s，54℃～56℃退火和延伸10s，72℃，10s，共35个循环；72℃延伸2min，4℃保持温度不变。

作为本发明的第二个方面，一种用于检测高度近视的检测试剂盒的应用，其用于检测GBP6基因和/或IGFN1基因是否发生突变。

进一步的，所述的用于检测高度近视的检测试剂盒的应用，其用于检测GBP6基因的位点89845995的胞嘧啶C是否突变成胸腺嘧啶T，和/或，

用于检测IGFN1的位点201182066的胞嘧啶C是否突变成胸腺嘧啶T。

作为本发明的第三个方面，一种用于检测高度近视的检测试剂盒，包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的特异性引物对。

根据本发明，所述检测试剂盒还包括反应体系，所述反应体系为30μL，包括LongAmp Taq DNA聚合酶1μL，5x GC buffer 5μL，10mM dNTPs 0.75μL，DNA样本1μL，10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，余量为水。

根据本发明，所述PCR检测试剂盒还包括扩增程序：98℃变性3min；进入循环，98℃变性10s，54℃～56℃退火和延伸10s，72℃，10s，共35个循环；72℃延伸2min，4℃保持温度不变。

作为本发明的第四个方面，一种用于检测高度近视的检测试剂盒的应用，其用于检测GBP6基因是否发生突变。

进一步的，所述的用于检测高度近视的检测试剂盒的应用，其用于检测GBP6基因的位点89845995的胞嘧啶C是否突变成胸腺嘧啶T。

作为本发明的第五个方面，一种用于检测高度近视的检测试剂盒，包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的特异性引物对。

根据本发明，所述检测试剂盒还包括反应体系，所述反应体系为30μL，包括LongAmp Taq DNA聚合酶1μL，5x GC buffer 5μL，10mM dNTPs 0.75μL，DNA样本1μL，10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，余量为水。

根据本发明，所述PCR检测试剂盒还包括扩增程序：98℃变性3min；进入循环，98℃变性10s，54℃～56℃退火和延伸10s，72℃，10s，共35个循环；72℃延伸2min，4℃保持温度不变。

作为本发明的第六个方面，一种用于检测高度近视的检测试剂盒的应用，其用于检测IGFN1基因是否发生突变。

进一步的，所述的用于检测高度近视的检测试剂盒的应用，其用于检测IGFN1的位点201182066的胞嘧啶C是否突变成胸腺嘧啶T。

作为本发明的第七个方面，一种用于筛选高度近视易感基因的方法，包括如下步骤：

步骤一、通过全外显子测序检测全部外显子变异位点，筛选出样本中高频变异的基因位点但该位点却在人群数据库中突变频率小于1％；

步骤二、使用SKAT-O、MiST等方法进行数据分析。

根据本发明，所述数据库包括1000g、ESP6500、ExAC(亚洲)、genomAD数据库。

本发明的用于检测高度近视的检测试剂盒及其应用，其有益效果：

1、通过检测GBP6基因和/或IGFN1基因是否突变来预测高度近视的易感性，可以在早期有效的识别发生高度近视、遗传高度近视的高危患者。

2、利用PCR扩增技术，具有检测效率高、成本低的特点，更利于推广，以解决大规模人群的高度近视遗传风险水平普筛，做到近视的早发现、早治疗。

3、本发明的用于筛选高度近视易感基因的方法，其是通过全外显子测序检测全部外显子变异位点，筛选出样本中高频变异的基因位点但该位点却在人群数据库如1000g、ESP6500、ExAC(亚洲)、genomAD数据库中突变频率小于1％，然后使用SKAT-O、MiST等方法进行数据分析。该方法相比于以往的关联分析检测结果更准确。

附图说明

图1为本发明的实施例1的样本M66的一代验证正向测序结果。

图2为实施例1的M167的一代验证正向测序结果。

图3为实施例2的样本在表6的条件下的扩增结果图；其中，从左到右分别是A01样本、A02样本；从左到右依次是IGFN1(chr1:201182066)和GBP6(chr1:89845995)引物结果图。

图4为实施例2的样本在表7的条件下的扩增结果图；其中，从左到右分别是A01样本、A02样本；从左到右依次是IGFN1(chr1:201182066-F/chr1:201182066-R)和GBP6(chr1:89845995-F/chr1:89845995-R)引物结果图。

图5为采用GBP6引物对进行扩增的扩增结果图。

图6为采用IGFN1引物对进行扩增的扩增结果图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或厂商提供的条件进行。

本发明的GBP6基因的NCBI登陆号为163351；IGFN1基因的NCBI登陆号为91156。

实施例1

本发明的实施例的病例样本来源于上海市第一人民医院。要求：(1)任一眼眼轴≥26mm，(2)患者签署知情同意。血液样本采用EDTA真空抗凝采血管采集5ml，离心后置-80℃冷冻保存。DNA样本从血样样本中分离。

本发明的样本DNA抽提采用血液基因组柱式小量提取试剂盒(Blood Genomic DNAMini Kit，品牌方康为世纪，型号CW2087M)。

本发明的实施例的DNA抽提后使用NanoDrop检测和琼脂糖凝胶电泳检测，确认DNA质量。

本实施例提供了一种用于筛选高度近视易感基因的方法。根据眼轴长度收集临床明确诊断为高度近视的患者血液样本700个，进行全外显子测序。本发明的实施例通过全外显子测序检测全部外显子变异位点，筛选出样本中高频变异的基因位点但该位点却在人群数据库如1000g、ESP6500、ExAC(亚洲)、genomAD数据库中突变频率小于1％，然后使用SKAT-O、MiST等方法进行数据分析。全外显子测序的主要技术流程包括：a.提取检测对象的基因组DNA；b.对提取的基因组DNA进行定量，并构建文库；c.对文库进行定量操作；d.上机测序。

对全外显子测序得到的数据进行过滤后，按以下标准纳入数据分析流程，筛选确定高度近视易感基因：

(1)对于罕见变异需同时满足以下条件：

a、位点覆盖度10个Reads以上(包含10个reads)；

b、变异位点的突变比例0.2以上(含0.2)，突变碱基/总碱基>＝0.2；

c、1000g、ESP6500、ExAC(亚洲)、genomAD数据库频率<0.01；

d、线粒体上位点全部去除；

e、同义突变的位点去除。

(2)对于有害变异在以上基础上，满足以下标准：

a、功能缺失的改变(包括无义突变、移码突变、剪接突变)；

b、错义突变位点；

在所有检测样本中，一个基因至少存在两个罕见有害变异才纳入统计。

通过高度近视致病基因检测对受检者的遗传信息进行纳入分析后，得到的结果如下表1所示。

表1高度近视受检者携带的突变基因频数

结果显示：IGFN1在实验中有77个样本携带罕见变异，GBP6在实验中有53个样本携带罕见变异，这两个基因在存在的罕见变异较多，可能为高度近视的易感基因。

为验证本实施例中所采用的方法筛选得到的GBP6基因和IGFN1基因突变的有效性，使用一代测序的方法进行验证，验证结果如表2、表3、图1和图2所示。

表2高度近视受检样本M66的GBP6基因的突变情况

表3高度近视受检样本M167的IGFN1基因的突变情况

样本M66和M167的一代验证正向测序结果中发现M66样本的一代测序结果中GBP6基因突变位点出现明显双峰，该位点由C变为T；M167样本的一代测序结果中IGFN1基因突变位点出现明显双峰，该位点由C变为T。

这两个样本的2个位点的基因型均能准确检出，检出率均为100％；结果和全外显子测序结果一致，说明我们的分析方法是准确的。

实施例2

本实施例的目的是根据实施例1中的致病基因位点，研发快速高效的检测方法，以期达到临床应用的目的。主要包括评估目的基因片段的扩增引物及延伸引物的有效性，摸索最适的反应条件等步骤。

本实施例中的样本来自于上海市第一人民医院眼科，根据眼轴长度选取2个明确诊断为高度近视的病例样本，分别编号为A01和A02。

通过数据库NCBI获得目的基因序列，设计了2对引物，引物信息如表4所示。

表4引物序列

利用上述引物分别对不同样本A01和A02进行PCR扩增。反应体系和反应程序表5和表6所示，结果如图3所示。

利用上述引物分别对不同样本A01和A02进行PCR扩增。反应体系和反应程序表5和表7所示，结果如图4所示。

表5反应体系

表6反应体系

表7反应体系

实验结果显示：封闭采用上述引物对IGFN1(chr1:201182066-F/chr1:201182066-R)和GBP6(chr1:89845995-F/chr1:89845995-R)进行PCR时，样本电泳结果均为单一条带，说明上述引物对的特异性好。

接着，挑选采用表5和表6的扩增条件进行扩增的扩增结果进行测序，结果汇总如表8所示。

表8疾病相关的可疑突变位点

结果显示：目的基因位置确实存在杂合变异。

实施例3

本实施例的目的是使用实施例2的检测方法，进一步扩大样本进行检测，达到临床应用的目的。本实施例中的样本来自于上海市第一人民医院眼科，编号分别为1-12。其中1-9号为临床表现为高度近视的患者，10-13号样本为正常人群样本。14号为阴性对照。结果如图5和图6所示。

由凝胶电泳图可知，1-12号样本扩增结果均为单一亮带，且阴性对照无条带，说明引物特异性好。

根据电泳结果进行一代验证，结果如表9所示。

表9疾病相关的可疑突变位点

由表9的结果可知，正常样本均无变异。在临床疑似患者中，6个患者中均检测到了杂合变异，有8个疑似患者(1-6号以及8-9号)只有一个基因存在变异(即IGFN1基因的chr1:201182066发生突变，或者，GBP6基因的chr1:89845995发生突变)，7号疑似患者的IGFN1基因的chr1:201182066发生突变和GBP6基因的chr1:89845995发生突变。

综上所述，本发明设计的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的特异性引物对以及核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的特异性引物对以及反应体系和扩增条件，用于PCR检测，可以检测GBP6基因和/或IGFN1基因是否突变来预测高度近视的易感性，可以在早期有效的识别发生高度近视、遗传高度近视的高危患者，其检测效率高、成本低的特点，更利于推广。所述特异性引物对和反应条件可采用本领域中已知的方法，进一步制成PCR检测试剂盒，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。

以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海市第一人民医院

上海昂朴生物科技有限公司

<120> 一种用于检测高度近视的检测试剂盒及其应用

<130> 211020

<141> 2021-01-26

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gttaaaggag gtctgtaagc 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cccagtgact gtgattccct c 21

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aggggcaagt caacatcag 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atctctagag gcttttctgc 20