一种小球藻活性肽及其在制备抗衰老精华液中的应用

技术领域

本发明属于活性肽应用技术领域，具体涉及一种小球藻活性肽及其在制备抗衰老精华液中的应用。

背景技术

皮肤老化是一个复杂的过程，皮肤衰老按其产生机制不同，可分为自然衰老和光老化。由机体内无法抗拒因素如年龄、重力、机体内分泌及免疫功能随机体衰老而改变及遗传因素引起的衰老，称为自然衰老；由环境因素如风吹、紫外线、化学物质、烟尘等外源性因素引起的老化，称为光老化。紫外线照射会引起皮肤损伤，破坏皮肤屏障功能，诱导氧化应激和炎症的产生，引起真皮细胞外基质降解、表皮出现增生，促进机体的皱纹形成。皮肤衰老主要表现为胶原蛋白减少，真皮层变薄，皮肤出现松弛和皱纹。

小球藻提取的活性肽成分，具有促进正常细胞增殖、保护细胞、清除毒素抗氧化、抗辐射等作用。小球藻活性肽提取物能够抑制由于紫外照射导致的基质金属蛋白酶MMP-1活性增强，从而减少胶原蛋白降解，还能够与体内常见的自由基发生反应，防止脂质过氧化，增强皮肤抗氧化能力。小球藻活性肽提取物应用到化妆品上能保护皮肤不受氧自由基过度氧化的影响，增加皮肤胶原蛋白的含量，促进细胞代谢，增加水分循环，给予皮肤良好的微环境，提高皮肤抗性，起到祛斑、防皱和抗衰老的作用。

人们始终在追求美丽和健康，对于具有抗衰和抗氧化功效化妆品的期待不断升级。随着皮肤老化机理研究的深入和新型原料开发、提取纯化技术的增强，越来越多的抗衰老化妆品被投放市场。小球藻活性提取物来源广、价格低，具有抗氧化、促细胞增殖等作用，将其活性提取物进行纯化，增强其抗氧化功效，并与其他护肤原料物质进行复配，生产出具有保湿、修复、抗衰老功效的护肤品。

发明内容

本发明提供了一种小球藻活性肽及其在制备抗衰老精华液中的应用，所制备的具有皮肤抗衰功效的精华液能够抵抗过度氧化造成的皮肤自然老化和光老化，同时促进细胞增殖，增强皮肤代谢，延缓皮肤衰老。

本发明提供首先提供一种小球藻活性肽，是将小球藻藻粉溶解于热水中进行萃取，萃取液加入木瓜蛋白酶进行酶解，酶解液经过超滤分离后进行纯化，收集液体冻干制成小球藻活性肽冻干粉。

所述的酶解，作为实施例的具体记载，是在50℃下进行酶解；

所述的超滤，是使用分子量不超过1KDa的超滤管进行超滤；

所述的活性肽，其中一种肽段的氨基酸序列为LNGDVW。

本发明提供的小球藻活性肽用于制备抗衰老制品

所述的制品，优选为化妆品。

本发明再一个方面提供一种抗衰老制品，其制备原料中使用了小球藻活性肽提取物与虾青素；

所述的化妆品，还添加有其它的化妆品常用的组分；

所述的组分，包含1,3丁二醇、透明质酸钠、甘油、乙基己基甘油、积雪草提取物、苯氧乙醇、视黄醇、PEG40氢化蓖麻油、香叶天竺葵提取物中的任一种或几种。

与现有的常规成分化妆品相比，本发明具有以下优势：

1、本发明提供具有抗衰老作用的化妆品，其活性成分包含小球藻活性肽提取物，将小球藻热水提取物活性成分进行分离纯化，添加到化妆品中，能够抵抗氧化应激，减少胶原蛋白降解，增强皮肤细胞代谢，促进皮肤水分循环，延缓衰老。

2、本发明提供具有抗衰老作用的化妆品，其成分包含虾青素，虾青素具有强大自由基清除活性，有效防止细胞膜和组织的脂质过氧化和氧化损伤，抵御紫外线对皮肤的伤害，防止皮肤癌的产生及皮肤光老化，与小球藻活性肽提取物协同作用，增强皮肤抗氧化能力，减少对氧化应激对皮肤的损伤，具有良好的抗衰效果。

3、本发明提供具有抗衰老作用的化妆品，其成分含有多元醇、植物提取物、生物多糖、维生素等物质，能够增强皮肤屏障功能，增加皮肤含水量，改善皮肤缺水老化状态，增强皮肤抗氧化能力，改善皮肤微环境，使皮肤莹润有光泽。

附图说明：

图1实施例1不同分子量小球藻活性肽提取物对DPPH自由基清除率图；

图2：实施例1小球藻活性肽提取物对氧化损伤细胞增殖率的影响图；

图3：实施例1小球藻活性肽提取物对氧化损伤细胞MDA、SOD、ROS含量的影响图；

图4：实施例1小球藻活性肽提取物对光损伤细胞增殖率影响图；

图5：实施例1小球藻活性肽提取物对光损伤细胞MDA、SOD、ROS含量的影响图；

图6：实施例2小球藻活性肽提取物精华液对小鼠光老化皮肤含水率、MDA、SOD、Hyp含量的影响图；

图7：实施例2小球藻活性肽提取物精华液对小鼠自然衰老皮肤含水率、MDA、SOD、Hyp含量的影响图。

具体实施方式

本发明采用自然界中含量丰富的小球藻提取物作为活性物质，并将活性肽成分进行纯化，制备护肤品，同时复配虾青素、1,3丁二醇、透明质酸钠、甘油、乙基己基甘油、积雪草提取物、视黄醇、香叶天竺葵提取物等物质增加抗氧化、抗衰老功效，为开发亲肤性好、来源广泛、功效明显、天然安全的抗衰老护肤品提供新思路。

以下将结合具体实施例对本发明及其效果进行进一步说明，但发明的具体实施方式不局限于此。

实施例1：小球藻活性肽提取物的制备方法

将10g小球藻粉溶于100mL、95℃的热水中，溶解30min。将混合液置于高压锅中，120℃加热40min，进行萃取。取出样品在室温下冷却后进行离心(10000rpm，40min)，离心后弃去沉淀取上清液。向上清液中加入木瓜蛋白酶，PH＝6，50℃条件下酶解4h，酶解结束后升温100℃灭酶10min，得到的酶解液采用多级膜分离技术，利用不同孔径的超滤膜制备分子量区间分别为5～10KDa、3.5～5KDa、1～3.5KDa、0～1KDa的小球藻多肽，得到不同分子量区间的小球藻多肽。

DPPH自由基清除能力测定。将DPPH溶于无水乙醇，配置成0.1mmol/L的DPPH溶液，取各样品溶液2mL，加入2mLDPPH溶液，混合均匀后，暗室静置30min，于517nm处测定吸光值，计算DPPH自由基清除能力。以VC作为阳性对照，评价小球藻多肽清除DPPH自由基的能力。

清除率计算公式：DPPH清除率(％)＝[1-(A1-A2)/A0]*100％

式中，A1为样品与DPPH反应的吸光值；A2为乙醇代替样品的吸光值；A0为蒸馏水代替样品的吸光值。

在相同浓度时，分子量在0～1KDa和1～3.5KDa的多肽清除DPPH自由基能力显著，与其他组具有显著性差异(P＜0.05)，其中分子量为0～1KDa的多肽对DPPH自由基清除率最高(图1)。

选取分子量0～1KDa的小球藻活性肽滤液，缓慢加入至已平衡好的Sephadex G-15葡聚糖凝胶柱柱床表面，以纯水进行洗脱，流速为0.3mL/min，收集具有最佳抗氧化活性的峰，得到本发明的抗氧化多肽，将滤液收集冻干干燥，制备成小球藻活性肽提取物干粉。

利用蛋白/多肽序列分析仪测定，一个具体肽段的氨基酸序列为：LNGDVW。

用本发明所制备小球藻活性肽提取物进行细胞氧化损伤影响试验。用PBS将小球藻活性肽提取物冻干粉稀释浓度为10mg/mL的活性肽稀释液。96孔细胞培养板每孔加入HSF人皮肤成纤维细胞100μL，其中细胞密度为1×10

细胞增殖抑制率检测。分别在孵育0h、24h、48h、72h每孔加入20μL MTT，放入细胞培养箱继续培养4h；吸出上清液，每孔加入150μL DMSO混匀，置于摇床上轻轻摇匀10min，酶标仪读取波长490nm处各孔吸光度(A)值，计算细胞增殖抑制率。

细胞增殖抑制率＝(A空白组－A观察组)/A空白组×100％。

结果显示，小球藻活性肽提取物能够显著降低由化学氧化剂造成的人皮肤成纤维细胞增殖抑制率(图2)。

丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧(ROS)表达检测。上述各试验组细胞在孵育24h后，采用硫代巴比妥酸法检测MDA表达，采用氯化硝基氮蓝四唑光还原法检测SOD表达，采用DCFH-DA探针检测ROS表达(以A值表示)。具体步骤均严格参照试剂盒说明书操作。

结果显示，与H

用本发明所制备小球藻活性肽提取物进行紫外光诱导人皮肤成纤维细胞氧化损伤的影响试验。取传代培养好的人皮肤成纤维细胞，随机分为空白组、对照组和试验组。空白组细胞不作任何处理，正常培养。对照组采用紫外照射(UVB+UVA)细胞，剂量选择15mJ/cm

细胞增殖抑制率＝(A空白组－A观察组)/A空白组×100％。

结果显示，紫外光照射可抑制人皮肤成纤维细胞增殖，小球藻活性肽能够显著降低由于紫外光照引起的人皮肤成纤维细胞增殖抑制率(图4)。

丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧(ROS)表达检测。取上述各组细胞，培养24h后，采用硫代巴比妥酸法检测MDA表达，采用氯化硝基氮蓝四唑光还原法检测SOD表达，采用DCFH-DA探针检测ROS表达(以A值表示)。具体步骤均严格参照试剂盒说明书操作。

结果显示，经小球藻活性肽提取物处理的细胞中SOD表达升高，MDA和ROS的表达下降，小球藻活性肽提取物有明显的抗人皮肤成纤维细胞光损伤的作用(图5)。

实施例2小球藻活性肽提取物的抗衰精华液

化妆品的抗衰老作用不仅仅是抗皱，同时还有保湿、提供皮屏障等更多功效，能够起到增强细胞的增殖和代谢能力，提高胶原蛋白和弹力蛋白的合成能力。小球藻活性肽提取物，复配具有保湿、滋润等多种功效成分，使皮肤水分含量提高、弹性提高、纹理均匀、皱纹减少、皮肤颜色及亮度提高、肤色均匀、皮肤水油达到平衡，变得年轻活力。

将10g小球藻粉溶于100mL、95℃的热水中，溶解30min。将混合液置于高压锅，120℃加热40min，进行萃取。取出样品在室温下冷却后进行离心(10000rpm，40min)，离心后弃去沉淀取上清液。向上清液中加入木瓜蛋白酶，PH＝6，50℃条件下酶解4h，酶解结束后升温100℃灭酶10min，用超滤管进行超滤，截留分子量0～1KDa的将滤液收集缓慢加入至已平衡好的Sephadex G-15葡聚糖凝胶柱柱床表面，以纯水进行洗脱，流速为0.3mL/min，收集具有最佳抗氧化活性的峰，得到本发明的抗氧化多肽，将滤液收集冻干干燥，制备成小球藻活性肽提取物干粉，备用。

配制以下AB组分：

A：丁二醇2～10，甘油2～8，PEG40氢化蓖麻油0.5～3，虾青素0.05～2，按质量分数溶解。

B:小球藻活性肽提取物0.5～2，透明质酸钠0.4～0.8，积雪草提取物0.5～2，香叶天竺葵提取物0.5～2，视黄醇0.05～1，乙基己基甘油0.1～0.5，苯氧乙醇0.5～1，按质量分数溶解于去离子水。

将A混匀加热40～50℃，混合物以30r/min进行搅拌，匀质5～10min，再将B加入A中，搅拌混匀，冷却至室温，制成抗衰精华液。

复合化妆品的检测

小鼠光老化皮肤检测

取SPF级健康昆明小鼠，8周龄，随机分成4组，分别为空白组、模型组、样品组、对照组，每组10只。小鼠背部2.5*2.5cm

隔日进行紫外线照射和涂抹溶液处理，辐照剂量为60mj/cm

皮肤含水量检测。第八周实验结束后，小鼠颈椎脱臼处死，迅速取下背部实验处全层皮肤，剥离结蹄组织和皮下脂肪，迅速剪取0.2g皮肤，称其湿重后，放入烘箱中于80℃干燥至恒重，计算皮肤水含量：

皮肤含水率(％)＝(湿重-干重)/湿重*100％

皮肤中抗氧化酶及胶原蛋白检测。第八周实验结束后，取实验处皮肤用生理盐水制成10％的皮肤组织匀浆，以4000rpm，进行离心10min，取上清液进行检测。检测按MDA、SOD、Hyp试剂盒要求进行。

MDA含量(nmol/mg)＝{(样品管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)}×标准品浓度÷样品蛋白含量

SOD活力(UN/mg)＝{(对照管吸光度-样品管吸光度)/对照管吸光度)}÷50％×(反应总体积/取样量)÷样品蛋白含量

Hyp含量(μg/mg)＝{(样品管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)}×标准品浓度÷样品蛋白含量

结果显示，与空白组相比，模型组小鼠皮肤含水量显著下降(P＜0.05)，且眼观皮肤干燥、松弛、纹路深、弹性差，皮肤呈衰老状态，样品组和对照组皮肤含水量高于模型组，其中样品组皮肤光滑、色泽红润、有弹性，未见松弛现象，其含水量与模型组有显著差异(P＜0.05)，实施例2中精华液能够改善光老化小鼠皮肤的水分含量。模型组皮肤组织氧化程度较高，其中MDA含量显著升高(P＜0.05)，同时SOD活力显著下降(P＜0.05)，与空白组比较，样品组皮肤组织MDA无显著升高，SOD活力无显著下降，实施例2中精华液能够抵抗氧化损伤，对皮肤的光老化具有一定的保护作用。Hyp含量可以反映出皮肤中胶原蛋白含量情况，模型组小鼠皮肤组织中，胶原蛋白含量显著低于正常组，同时，样品组和对照组胶原蛋白含量显著高于模型组(P＜0.05)，实施例2中精华液可以通过增加皮肤组织中胶原蛋白含量来影响皮肤的光老化(图6)。

小鼠自然老化皮肤检测。

取SPF级8周龄健康昆明小鼠，分为青年小鼠空白组和老年小鼠模型组、样品组、对照组，每组20只。小鼠背部2.5*2.5cm

青年空白组小鼠皮肤剃毛，背部皮肤暴露，正常饲养1个月；老年模型组小鼠剃毛后，背部皮肤暴露，相同环境下饲养12个月；样品组小鼠背部剃毛，每天早晚涂敷精华液0.1mL各一次，连续给药12个月；对照组小鼠背部剃毛，每天早晚于皮肤暴露处涂抹维生素E0.1mL各一次，连续给药12个月。实验结束后，检测皮肤中含水率以及皮肤中MDA、SOD、Hyp变化情况。

皮肤含水量检测。每组实验结束后，小鼠颈椎脱臼处死，迅速取下背部实验处全层皮肤，剥离结蹄组织和皮下脂肪，迅速剪取0.2g皮肤，称其湿重后，放入烘箱中于80℃干燥至恒重，计算皮肤水含量：

皮肤含水率(％)＝(湿重-干重)/湿重*100％

皮肤中抗氧化酶及胶原蛋白检测。实验结束后，取实验处皮肤用生理盐水制成10％的皮肤组织匀浆，以4000rpm，进行离心10min，取上清液进行检测。检测按MDA、SOD、Hyp试剂盒要求进行。

MDA含量(nmol/mg)＝{(样品管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)}×标准品浓度÷样品蛋白含量

SOD活力(UN/mg)＝{(对照管吸光度-样品管吸光度)/对照管吸光度)}÷50％×(反应总体积/取样量)÷样品蛋白含量

Hyp含量(μg/mg)＝{(样品管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)}×标准品浓度÷样品蛋白含量

结果显示，与空白组相比，模型组小鼠皮肤含水量显著下降(P＜0.05)，皮肤纹路深，呈明显衰老状态，样品组和对照组皮肤含水量高于模型组，其中使用精华液的样品组皮肤有弹性、皱纹浅短，含水量与模型组有显著差异(P＜0.05)。老年模型组小鼠皮肤组织纹路明显，皮肤干燥、弹性差，与青年空白组小鼠相比，其MDA含量显著升高(P＜0.05)，同时SOD活力显著下降(P＜0.05)，提示皮肤氧化程度较高。与青年空白组小鼠相比，样品组皮肤组织MDA含量和SOD活力无显著变化，提示实施例2中精华液能够抵抗氧化损伤，对自然老化皮肤具有一定的保护作用。Hyp含量可以反映出皮肤中胶原蛋白含量情况，模型组小鼠皮肤组织中，胶原蛋白含量显著低于空白组(P＜0.05)，说明衰老会导致胶原蛋白量迅速减少，涂抹精华液的样品组胶原蛋白含量显著高于模型组，实施例2中精华液能够提高小鼠自然衰老皮肤中的含水量，并能够通过增加皮肤组织中胶原蛋白含量来改善皮肤的自然老化的状态(图7)。

肤质检测

包括经皮水分散失测定、皮肤弹性测定、皮肤皱纹测定。本测试的仪器为德国CK公司Courage+Khazaka electronic-MPA10(Tewameter TM300)进行经皮水分散失测定，Courage+Khazaka electronic-MPA580进行皮肤弹性测定，皱纹检测仪Visionline VL650进行皮肤皱纹测定。

检测方法：选择年龄在18～45岁，符合试验要求的志愿者20名作为受试者，试用实施例产品8周，每日早晚一次，期间不得涂抹除受试品之外的任何化妆品。分别在使用实施例产品的0周、2周、4周、6周、8周检测皮肤各项指标。

检测区域：面部

检测指标：数据统计，以平均值标准误差(Mean±SE，n＝20)表示，用统计数据分析方法进行分析，取相对值进行比较，相对值(％)＝(各测定值÷初始测定值)×100％。

检测条件：室内稳定环境，温度20℃±2℃，环境湿度40～60％。检测结果：结果显示，经皮水分散失量和皮肤弹性有明显的改变，到第8周实验结束，经皮水分散失量减少11％(表1)

表1：经表皮失水率变化表(TEWL)

皮肤弹性增加了14％(表2)，皮肤的屏障功能增强，肤质得到了改善。

表2：皮肤弹性变化表

试验8周内，受试者皮肤细纹总面积、平均细纹长度和平均细纹深度均有减少(表3、表4、表5)。

表3：皮肤总细纹面积变化表

表4：皮肤平均细纹长度变化表

表5：皮肤平均细纹深度变化表

该抗衰精华液具有抗氧化功能，能减少胶原蛋白降解，同时刺激细胞增殖再生，补充水分，增强皮肤屏障功能，使皮肤充盈，呈现年轻健康态。