复制型腺病毒的检测方法及试剂盒

技术领域

本发明属于生物制品领域和基因检测领域，具体地，本发明提供了对腺病毒载体制品中复制型腺病毒(RCA)进行定量检测的方法、引物对和探针组合，及相应试剂盒。

背景技术

重组腺病毒载体因其高的生物安全性、对人无致病性而成为一种应用广泛的基因治疗载体。目前通常所用的腺病毒载体是去除了E1/E3等与腺病毒复制相关的基因，由包装细胞如HEK293提供E1等基因来保证非复制型的腺病毒的包装和扩增，从而增加了使用的安全性。

尽管如此，在病毒基因治疗载体的生产过程中，可能因随机突变或其他事件形成不需要的具有复制能力的病毒(“RCA”)。例如，E1a缺失的腺病毒载体可以在HEK293细胞中生产，该细胞包含功能性E1A区域。自发重组理论上可以将功能性E1A区域重新添加回腺病毒中，创建具有复制能力的腺病毒(“RCA”)。RCA代表生物危害，因为如同野生型Ad，它可以在感染的宿主中复制且潜在地可能引起疾病。

因此，病毒基因治疗载体生产商测定复制缺陷病毒载体是否存在污染性RCA。目前大部分监管机构要求通过使用通常A549细胞培养的方法测定，这种方法操作复杂，需要连续培养10天获得结果，结果评价方法为观察噬斑，结果受人为因素影响较大。

为了得到改进型的替代方法，本领域已经进行了诸多尝试，其中，实时定量PCR技术具有检测微量杂质所需的灵敏度。例如，参见于雷等，Q-PCR法检测腺病毒基因治疗产品中的复制型腺病毒，生物技术通讯第28卷第3期(2017年5月)，该文献中建立了一种探针法qPCR体系，对腺病毒载体制品中RCA的拷贝数进行相对定量测定。上述方法的不足之处是，仅扩增单个目的基因E1A，不能准确评估RCA相对于腺病毒载体制品的含量。

因此本领域急需开发一种高灵敏度、高特异性、低变异性的可靠的腺病毒载体制品中RCA含量的检测方法。

发明概述

本发明提供了一种对腺病毒载体制品中复制型腺病毒(RCA)进行定量检测的方法，及相应试剂盒。

在一个方面，本发明提供了一种对腺病毒载体制品中RCA进行定量检测的方法，所述方法包括步骤：(1)获取包含腺病毒载体制品的样品；(2)提取样品的总DNA；(3)以腺病毒hexon和E1A基因为待扩增靶基因，进行双重荧光实时定量PCR，从而实现对腺病毒载体制品中RCA进行相对定量检测。在一个优选的实施方案中，所述腺病毒载体制品不能和/或不应当在正常人细胞中复制，优选地所述腺病毒载体制品还包含野生型腺病毒基因组的至少一部分，以及外源基因。

在一些具体的实施方案中，所述方法的步骤(3)包括可用于绘制标准曲线的阳性对照。在一些具体的实施方案中，所述阳性对照是质粒构建体pJET1.2-Hexon-E1A-E1B55K。

在一些具体的实施方案中，所述方法的步骤(3)包括用于扩增检测hexon靶基因的引物，其中所述引物包含hexon特异性正向引物和hexon特异性反向引物的引物对，所述正向引物在其3’最末端包含与hexon基因的核苷酸序列中至少15个连续核苷酸相同的序列，所述反向引物在其3’最末端包含与hexon基因的核苷酸序列中至少15个连续核苷酸反向互补的序列。在另一个实施方案中，所述正向引物的长度是15至100个核苷酸，或16至35个核苷酸、优选地17至25个核苷酸、更优选地18至22个核苷酸、最优选地18个核苷酸；所述反向引物的长度是15至100个核苷酸，或16至35个核苷酸、优选地17至25个核苷酸、更优选地18至23个核苷酸。

在一些优选的实施方案中，所述方法的步骤(3)包括选自以下的用于扩增hexon靶基因的引物对：

a)

CGCATGTACTCCTTCTTTAGA(SEQ ID：4)

CTGTTGGTAGTCCTTGTATTTAG(SEQ ID：5)

b)

GACCGCATGTACTCCTTC(SEQ ID：6)

GTTGGTAGTCCTTGTATTTAGT(SEQ ID：7)

c)

CCGCATGTACTCCTTCTT(SEQ ID：8)

CCTGTTGGTAGTCCTTGTATT(SEQ ID：9)

在一些具体的实施方案中，所述方法的步骤(3)包括用于扩增检测E1A靶基因的引物，其中所述引物包含E1A特异性正向引物和E1A特异性反向引物的引物对，所述正向引物在其3’最末端包含与E1A基因的核苷酸序列中至少15个连续核苷酸相同的序列，所述反向引物在其3’最末端包含与E1A基因的核苷酸序列中至少15个连续核苷酸反向互补的序列。在另一个实施方案中，所述正向引物的长度是15至100个核苷酸，或16至35个核苷酸、优选地17至25个核苷酸、更优选地18至22个核苷酸、最优选地18个核苷酸；所述反向引物的长度是15至100个核苷酸，或16至35个核苷酸、优选地17至25个核苷酸、更优选地18至23个核苷酸。

在一些优选的实施方案中，所述方法的步骤(3)包括选自以下的用于扩增E1A靶基因的引物对：

a)

5’-ACACCTCCTGAGATACACCCG-3’(SEQ ID：10)

5’-GCAAGTCCTCGATACATTCCACA-3’(SEQ ID：11)

b)

5’-ATAGCTGTGACTCCGGTCCTTC-3’(SEQ ID：13)

5’-AGCAAGTCCTCGATACATTCCA-3’(SEQ ID：14)

c)

5’-CTTGGGTCCGGTTTCTATGC-3’(SEQ ID：15)

5’-TTCATCCTCGTCGTCACTGG-3’(SEQ ID：16)

在一些具体的实施方案中，所述方法的步骤(3)包括用于检测提取的DNA或实时定量PCR测定法的提取物或扩增产物之中的hexon基因和/或E1A基因的探针，其中探针的长度是16至35个核苷酸、优选地18至27个核苷酸、最优选地20-25个核苷酸。在一个优选的实施方案中，探针带有荧光报告基团和/或荧光淬灭基团。在一个更优选的实施方案中，荧光报告基团是Hex或FAM，荧光淬灭基团是BHQ1或TAMRA。

在一些优选的实施方案中，所述方法的步骤(3)包括选自以下的用于检测hexon靶基因的探针：

Hex-CATCCACCACCTGACGGCTC-BHQ1(SEQ ID：3)

在一些优选的实施方案中，所述方法的步骤(3)包括选自以下的用于检测E1A靶基因的探针：

a)

5’-FAM-CTGTGCCCCATTAAACCAGTTGCCG-3’-BHQ1(SEQ ID：12)

b)

FAM-5’-ACCTGCCACGAGGCTGGCTTTCC-3’TAMRA-3’(SEQ ID：17)。

在一些实施方案中，本发明的对腺病毒载体制品中RCA进行定量检测的双重荧光实时定量PCR方法具有选自以下一项或多项的特性：

(1)具有约90％-约110％之间的扩增效率；

(2)具有大于0.99的相关系数R

(3)具有良好的重现性，例如体现为变异度CV％小于40％，优选小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、或小于10％；

(4)具有不高于5拷贝/μL的最低检测限。

因此，在另一个方面，本发明涉及引物对，探针，和/或包含引物对和探针的组合，其中引物对和探针具有如上文所述的含义和重要性。例如，在一个实施方案中，本发明提供了引物对，其选自以下任一组：

a)

CGCATGTACTCCTTCTTTAGA(SEQ ID：4)

CTGTTGGTAGTCCTTGTATTTAG(SEQ ID：5)

c)

GACCGCATGTACTCCTTC(SEQ ID：6)

GTTGGTAGTCCTTGTATTTAGT(SEQ ID：7)

d)

CCGCATGTACTCCTTCTT(SEQ ID：8)

CCTGTTGGTAGTCCTTGTATT(SEQ ID：9)

优选地，所述引物对用于在PCR(例如，荧光实时定量PCR)方法中扩增腺病毒的hexon基因或其片段。

在一个实施方案中，本发明提供了引物对，其选自以下任一组：

a)

5’-ACACCTCCTGAGATACACCCG(SEQ ID：10)

5’-GCAAGTCCTCGATACATTCCACA(SEQ ID：11)

b)

5’-ATAGCTGTGACTCCGGTCCTTC-3’(SEQ ID：13)

5’-AGCAAGTCCTCGATACATTCCA-3’(SEQ ID：14)

c)

5’-CTTGGGTCCGGTTTCTATGC-3’(SEQ ID：15)

5’-TTCATCCTCGTCGTCACTGG-3’(SEQ ID：16)

优选地，所述引物对用于在PCR(例如，荧光实时定量PCR)方法中扩增腺病毒(例如，复制型腺病毒)的E1A基因或其片段。

在一个实施方案中，本发明提供了探针，其具有序列：Hex-CATCCACCACCTGACGGCTC-BHQ1(SEQ ID：3)，优选地，所述探针用于在核酸杂交(例如，荧光实时定量PCR)方法中检测腺病毒的hexon基因或其片段。

在一个实施方案中，本发明提供了探针，其具有选自以下的序列：

a)

5’-FAM-CTGTGCCCCATTAAACCAGTTGCCG-3’-BHQ1(SEQ ID：12)

b)

FAM-5’-ACCTGCCACGAGGCTGGCTTTCC-3’TAMRA-3’(SEQ ID：17)

优选地，所述探针用于在核酸杂交(例如，荧光实时定量PCR)方法中检测腺病毒(例如，复制型腺病毒)的E1A基因或其片段。

在一个实施方案中，本发明提供了通过PCR检测RCA的方法，所述方法包括使用样品中污染的RCA基因组作为模板、使用反向引物和正向引物的引物对。在一个实施方案中，所述方法使用包含引物对和探针的组合。其中引物对(包括正向引物和反向引物)和探针具有如上文所述的意思。在一些实施方案中，样品具有不低于5拷贝/μL的E1A基因含量，从而被本发明的方法检测出。在一些实施方案中，样品具有不低于50拷贝/μL的E1A基因含量，从而被本发明的方法检测出。在一个实施方案中，样品中不含有任何污染的RCA基因组，因而没有RCA基因组被检出。

在一个实施方案中，本发明提供了一种评价腺病毒载体制品质量的方法，其中所述方法能够检测任何污染的RCA基因组，如果其存在的话。

在一个实施方案中，本发明提供了组合物，以及组合物在用于评价腺病毒载体制品质量中的用途，其中，组合物由正向引物和反向引物的引物对，和/或探针组成，其中正向引物和反向引物和探针具有如上文所述的意思。

在一个实施方案中，本发明提供了正向引物和反向引物的引物对，和/或探针在制备检测剂中的用途，所述检测剂用于评价腺病毒载体制品质量，其中正向引物和反向引物和探针具有如上文所述的意思。

在另一方面，本发明提供了用于通过双重实时荧光定量PCR方法对腺病毒载体制品中复制型腺病毒(RCA)进行定量检测的试剂盒，所述试剂盒包含特异性扩增检测hexon靶基因的引物和探针，以及特异性扩增检测E1A靶基因的引物和探针。本发明相应地提供了对腺病毒载体制品中复制型腺病毒(RCA)进行定量检测的方法，包括步骤：对待测样品使用本发明的试剂盒进行双重实时荧光定量PCR方法。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于评价腺病毒载体制品质量的试剂盒，所述试剂盒包含正向引物和反向引物组成的引物对，或探针，或其组合，其中反向引物、引物对和组合具有如上文所述的意思。在一个优选的实施方案中，试剂盒进一步包含多种实时定量PCR所使用的通用常规试剂。在一个优选的实施方案中，试剂盒进一步包含定量对照标准品。在一个优选的实施方案中，所述对照标准品是质粒构建体pJET1.2-Hexon-E1A-E1B55K。

在另一方面，本发明提供了腺病毒载体制品，其特征在于，其中的RCA含量利用本发明的方法检测，或使用本发明的引物探针组合和/或试剂盒检测，可确认污染的RCA含量少于50(copies/μL)/腺病毒基因组浓度(copies/μL)，即相对于非复制型腺病毒制品基因组含量而言，RCA含量低于50copies/μL。在一个实施方案中，非复制型腺病毒制品基因组浓度是1×10

附图说明

图1为质粒构建体pJET1.2-Hexon-E1A-E1B55K的酶切鉴定结果。“M”道为DNALadder，“1”道为未酶切的环状载体，“2”道为酶切产物，均符合预期大小。

图2所示为所构建获得的pJET1.2-Hexon-E1A-E1B55K质粒图谱，所述质粒包含1个拷贝的hexon基因和1个拷贝的E1A基因，作为扩增的阳性对照标准品，并可用于绘制标准曲线。

发明详述

本发明的发明人出人意料地证明，通过使用引物和探针组合，在双重荧光实时定量PCR中扩增腺病毒的hexon基因和E1A基因，能够达到对复制型腺病毒(RCA)进行定量检测的目的。相比于现有技术中的普通单重荧光实时定量PCR检测方法，本发明的检测方法耗时短，通过一次反应完成检测目的；结果准确，同时检测复制型和非复制型腺病毒基因组的数量，最大程度避免实验体系误差影响，一次结果给出RCA准确含量；同时通过优化引物和探针的选择，提高实验体系的检测准确度和稳定性。

除非另外规定，否则本文中所用的全部术语及科学术语具有与本发明相关领域的技术人员通常理解的相同意义。尽管基本上与本文所述的那些方法和材料相似的任意方法和材料可以用于本发明的实施或检测，然而仅描述示例性的方法和材料。为了本发明的目的，下文定义以下术语。

除非上下文另外清楚地指明，否则术语“核苷酸”应当在本文中理解为除了指天然存在的核糖核苷酸单体或脱氧核糖核苷酸单体之外，还指相对于正在使用的核苷酸的特定上下文(例如，杂交至互补碱基)，在功能上等同的其相关的结构变体，包括衍生物和类似物。术语“核酸”或“核酸序列”指单或双链形式的脱氧核糖核酸或核糖核酸寡核苷酸。该术语包含核酸，例如包含天然核苷酸的已知类似物的寡核苷酸。该术语还包含具有合成主链的核酸样结构。

在两个或更多个核酸序列或多肽序列的情境下，术语“同一性”指相同的两个或更多个序列或子序列。如果在比较窗口或指定区域范围内为最大对应性而进行比较和比对时，如使用本领域通用的序列比较算法之一或通过手工比对和目视审查所测量，各序列具有指定百分数的相同核苷酸(例如，在指定区域范围内至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性)，则它们是彼此“基本上同一的”。这些定义同样包含了被比对序列的反向互补序列。

如无特别说明，如本文所用的术语“Ad”、“AdV”是腺病毒的缩写。术语“腺病毒”如本文使用的意欲包含所有腺病毒，包括腺胸腺病毒属(Atadenovirus)、哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)和禽腺病毒属(Aviadenovirus)。迄今为止，已鉴定超过51种人血清型的腺病毒，主要分为血清群A、B、C、D、E或F。本发明的腺病毒载体可以属于血清型2(Ad2)、血清型11(Ad11)、血清型35(Ad35)、血清型7(Ad7)或优选地，血清型5(Ad5)，或嵌合血清型Ad5F35，但不限于这些类别。

腺病毒是无包膜DNA病毒。来源于腺病毒的载体具有使得它们对于基因转移特别有用的众多特征。如本文使用的，“重组腺病毒载体”是携带一种或多种异源核苷酸序列(例如，2、3、4、5或更多种异源核苷酸序列)的腺病毒载体。例如，腺病毒的生物学被详细表征，其几乎不会引起严重的人病理变化，而且该病毒在将其DNA导入宿主细胞内方面非常高效，该病毒可以感染广泛多样的细胞且具有广泛的宿主范围，该病毒可以相对容易地大量产生，且可以通过缺失病毒基因组早期区1(“E1”)而赋予复制缺陷。

腺病毒(“Ad”)的基因组是大约36,000个碱基对(“bp”)的线性双链DNA分子，具有与每条链的5’末端共价结合的55-kDa末端蛋白质。Ad DNA包含约100bp的相同末端反向重复序列(“ITRs”)，确切长度取决于血清型。病毒复制起点位于正好在基因组末端处的ITR内。DNA合成在2个阶段中发生。首先，复制通过链置换进行，从而产生子代双链体分子和亲本置换链。置换链是单链的且可以形成所谓的“锅柄(panhandle)”中间物，这允许复制起始和产生子代双链体分子。复制也可以从基因组的2个末端同时进行，此时无需形成锅柄结构。

腺病毒的E1区是感染靶细胞后腺病毒表达的第一个区域。这个区域由2个转录单位——E1A和E1B基因组成，这2种基因都是原代(胚胎)啮齿类动物培养物致癌性转化所需的。

与例如逆转录病毒相反，腺病毒不整合到宿主细胞基因组内，能够感染不分裂细胞，且能够在体内有效转移重组基因，这些特征使得腺病毒成为用于将例如目的异源核酸转移到有此需要的细胞、组织或受试者体内的有力工具。

本发明的使用腺病毒重组体的实施方案优选包含E1突变、缺陷或缺失，这提高了载体的安全极限，因为E1缺陷型腺病毒突变体是复制缺陷型的，且高度减毒。

本发明的使用腺病毒重组体可以在293细胞中快速产生重组Ad载体。然而，可能存在的低水平RCA污染了在293细胞中产生的Ad载体。RCA的产生是由于Ad载体和293细胞基因组之间的重叠序列。

腺病毒的基本信息和综述可以在病毒学领域的教科书中容易地找到。

术语Hexon是指腺病毒基因组中的Hexon基因，其编码是腺病毒最大和最丰富的衣壳蛋白——Hexon(六邻体)蛋白，占衣壳蛋白的83％以上。本发明适用的Hexon基因序列可参见GenBank ID：AC_000008.1(Human adenovirus 5基因组)中注释的Hexon编码区段。

术语E1A是指腺病毒基因组中的早期区域1A基因，其位于腺病毒基因组左侧，与病毒的细胞转化有关。目前本领域使用的非复制型腺病毒载体通常为删除了E1、E13区域，使其失去复制功能。在AdV的增殖是在293T细胞中进行，293T细胞与野生型腺病毒在E1区域附近具有同源序列，因此AdV在增殖过程中，可能会与293T细胞发生同源重组，重新获得复制能力，即产生复制型腺病毒RCA。本发明适用的E1A基因序列可参见GenBank ID：AC_000008.1(Human adenovirus 5基因组)中注释的E1A编码区段。

如本文所用的术语“PCR”指聚合酶链反应。术语“实时定量PCR”通常指称作实时定量聚合酶链反应、定量聚合酶链反应或动力学聚合酶链反应的PCR技术，在本领域还经常被称作“荧光定量PCR”、“Real-time PCR”、“quantitative PCR”或“qPCR”等等。这项技术利用PCR同时地扩增并定量地测量靶核酸，大多数时候借助嵌入性荧光染料、或序列特异性探针定量，其中所述序列特异性探针含有仅与靶核酸杂交时才可检出的荧光报道分子。本文中的“双重实时荧光定量PCR”、“双重qPCR”等术语指同时在同一管反应体系中扩增检测两个靶标的实时荧光定量PCR反应。虽然其反应原理、反应试剂和操作过程与单重qPCR相同，但由于同时使用了更多的引物和探针组合，需要在设计实验时充分考虑寡核苷酸分子(引物、探针)的退火温度搭配和序列互补性，以及不同荧光分子的搭配使用等因素，因此其反应体系和反应条件受到的制约因素远高于单重PCR反应。实时荧光定量PCR应当理解为也包括了能够实时跟踪扩增反应进展的任何扩增技术，即在功效上与实时荧光定量PCR等同的检测方法。

术语“定量”在本文中可以指绝对定量，即准确或基本准确地测得待测物质的质量或质量浓度；也可以指相对定量，即相对于某项对照物质的质量或浓度的倍数或百分比；还可以指半定量，即虽然无法精确地或基本精确地测得待测物质的质量或质量浓度，但可以在一定程度上测得其大概的数字范围或变化趋势。

如本文所用的术语“引物”指能够在qPCR反应中充当DNA复制反应起始子的寡核苷酸DNA，其可在严格条件下与模板核酸分子杂交。

术语“探针”指的是一个具有特定序列的可以和核苷酸的互补序列杂交的寡核苷酸，它可以通过特异性杂交，用来检测和鉴定核苷酸中的互补或者充分互补序列。探针分子通常具有荧光报告基团和/或荧光淬灭基团，所述荧光基团能够改变荧光强度，其中荧光强度的变化与反应中存在的与探针互补的DNA水平增加相关。能够用于实时定量PCR的探针有多种结构类型，例如taqman探针、分子信标和蝎形探针等等。出于本发明的目的，可以使用任意类型的探针。在本文所述理想的实验条件下，本发明优选使用taqman探针。Taqman探针在序列上与扩增产物反向互补杂交，并在与靶分子杂交后被PCR中所用taq酶的5’-3’的外切活性水解，3’端荧光淬灭基团被切割下来，引起荧光共振能量转移(FRET)作用消失，荧光报告基团在入射光的激发下发射出特定波长的荧光，从而被检测到。

本发明探针的长度可以在一个相当宽的范围内波动，但由于实践因素在实际应用中偏好于短探针，典型探针由15到30个碱基之间组成，其中碱基数在20到25个之间(例如，23个)最适合。使用较长或较短的探针将不会影响本技术的灵敏度和特异性，但是可能要求通过改变融合温度和GC含量等方法，对技术实施的条件进行一系列的修改，其中GC含量的改变将根本上影响杂交温度和时间。

术语“FAM”指作为荧光染料的6-羧基荧光素，产品的光谱学相关参数为Ex＝494nm/Em＝522nm，其荧光能够被荧光淬灭基团例如TAMRA在接近时淬灭。

术语“TAMRA”指作为染料的5-羧基-四甲基罗丹明N-琥珀酰亚胺酯。当其接近荧光分子例如FAM时，能够作为荧光淬灭基团使得后者的荧光不能被检测到。

术语“Hex”指作为荧光染料的6-羧基-2',4,4',5',7,7'-六氯荧光素，产品的光谱学相关参数为Ex＝535nm/Em＝556nm，其荧光能够被荧光淬灭基团例如TAMRA和BHQ1在接近时淬灭，因此常与这二者，尤其是BHQ1搭配。

术语“BHQ1”指作为荧光染料的Black Hole Quencher 1，其能够淬灭FAM、Hex等荧光基团。

如本文使用的，“重组体”指在体外合成或以其他方式操作的多核苷酸(例如重组多核苷酸)，使用重组多核苷酸在细胞或其他生物学系统中生产基因产物的方法，或由重组多核苷酸编码的多肽(“重组蛋白质”)。“重组手段”还包含将来自不同来源、具有各种编码区或结构域或启动子序列的核酸切除和连接到表达盒或载体内，用于在本发明的载体中表达例如诱导型或组成型表达多肽编码序列。

术语“异源的”当关于核酸使用时指核酸在它通常在自然界中未发现的细胞或病毒中；或包含2个或更多个子序列，所述子序列不是以与自然界中通常发现的相同的彼此关系发现，或被重组工程改造，从而使得其表达水平、或与细胞中的其他核酸或其他分子的物理关系、或结构通常在自然界中未发现。例如，异源核酸一般由重组产生，具有来自无关基因、以自然界中未发现的方式排列的2个或更多个序列；例如，插入本发明的基于腺病毒的载体内与启动子序列可操作连接的人基因。

基因或核酸的“表达”不仅包含细胞基因表达，而且还包含核酸在克隆系统和任何其他背景中的转录和翻译。

术语“基因产物”主要指由其他核酸(例如，非编码和调节RNAs例如tRNA、sRNPs)编码的蛋白质和多肽。

如本文使用的，“载体”是允许或促进实体从一种环境转移到另一种环境的工具。例如，在重组DNA技术中使用的某些载体允许实体例如DNA区段(例如异源DNA区段)被转移到靶细胞内。本发明包含重组腺病毒载体。

术语“质粒”指DNA转录单位，其包含根据本发明的多核苷酸和其重组、复制到Ad内、且在宿主中表达转基因所需的元件。优选环状质粒形式，它可以是超螺旋的或不是超螺旋的。线性形式也包括在本发明的背景中。

关于在载体中表达的外源DNA(例如编码目的表位和/或抗原和/或治疗剂)和提供此类外源DNA的文件，以及关于用于增强核酸分子表达的转录和/或翻译因子的表达，以及关于术语例如“目的表位”、“治疗剂”和其他的事物，参考本领域所公知的含义。

当两个核酸分子在适宜条件下彼此复性时，杂交出现。同样，这里所用的术语“杂交”指的是两个核苷酸基于互补碱基对的双螺旋结构的形成。杂交可以发生在完全互补核苷酸链之间，或者包含少量不配对区域的“充分互补”核苷酸链之间。完全互补核苷酸链杂交的条件指的是“严格的杂交条件”或者“序列特异性杂交条件”。有时，充分互补稳定的核苷酸双链在严格性较低的杂交条件下仍可以得到，在这种情况下错误匹配的忍受程度可以通过对杂交条件的适当调整而得到调整。核酸杂交是DNA操作领域技术人员公知的技术。给定的核酸对的杂交特性是其相似性或同一性的指标。两个核酸序列基本上相同的另一个指标是这两个分子在严格条件下彼此杂交。短语“特异性杂交”指某分子在严格条件下仅与特定核苷酸序列结合、形成双链体或杂交，当该序列存在于复杂混合物(例如，总细胞的)DNA或RNA中。“基本上结合”指探针核酸和靶核酸之间的互补性杂交并且包括可以通过降低杂交介质的严格性而容许的少量错配以实现所需的对靶核酸序列的检测。在核酸杂交实验如DNA印迹和RNA印迹杂交的情况下，“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下不同。高严格性洗涤条件的实例是在72℃时0.15M NaCI持续约15分钟。严格性洗涤条件实例是在65℃时0.2XSSC洗涤15分钟。经常地，高严格性洗涤之前是低严格性洗涤以移除背景探针信号。用于例如多于100个核苷酸的双链体的中等严格性洗涤实例是在45℃时1X SSC持续15分钟。用于例如多于100个核苷酸的双链体的低严格性洗涤实例是在40℃时4X至6X SSC持续15分钟。对于短探针(例如，约10个至50个核苷酸)，严格条件通常涉及在pH 7.0至8.3时小于约1.5M、更优选地约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)的盐浓度，并且温度一般是至少约30℃并且对于长探针(例如，>50个核苷酸)，是至少约60℃。也可以通过添加去稳定剂如甲酰胺实现严格性条件。通常，特定杂交分析中对不相关探针所观察的2X(或高于)信噪比表示检出特异性杂交。如果严格条件下彼此不杂交的核酸编码的蛋白质基本上相同，则核酸也基本上相同。例如，当使用遗传密码允许的最大密码子简并性产生核酸副本时，这种情况出现。对于特定探针，选择T

术语“常规”指基于本领域充分认可的已出版参考文献的实验方法和材料。

“受试者”在本发明的上下文中可以是脊椎动物，例如哺乳动物、鸟、爬行动物、两栖动物或鱼；更有利地，人、或伴侣或驯养或生产食物或生产饲料或家畜或狩猎或竞赛或运动动物，例如但不限于牛、犬、猫、山羊、绵羊、猪、马和禽类。优选地，脊椎动物是人。因为所有脊椎动物的免疫系统类似地运作，所以描述的应用可以在所有脊椎动物系统中实现。

本发明涉及对腺病毒载体制品中RCA进行定量检测的方法。

有利地，引物和/或探针的序列具有与靶序列或其反向互补序列至少80％同一性，优选地所述靶序列存在于腺病毒的hexon基因和E1A基因中。

有利地，所述的引物和/或探针寡核苷酸分子包含至少15个核苷酸，优选地，探针的理论解链温度Tm高于引物的理论Tm约10℃±0.5。

优选地用于本发明的酶可以是具有聚合酶活性，在PCR操作条件下可使用的任何酶，例如，优选地，Taq聚合酶，更优选地高保真的Taq聚合酶。

本发明还涉及用于检测复制型腺病毒(RCA)的实时荧光定量PCR型扩增反应试剂盒，其特征在于它包含上述引物对和探针。所述试剂盒有利地还包含阳性对照。因此本发明还提供了使用所述试剂盒进行检测的方法。

不同血清型的腺病毒基因组中，hexon和E1A基因的核苷酸序列可以由例如Genbank等生物信息学数据库得到，尽管存在差异，本领域技术人员仍然能够以出人意料的方式检测这些血清型的hexon和E1A基因的核苷酸序列。

与现有技术所述方法相比，本发明检测和/或定量测定复制型腺病毒(RCA)的方法的优点之一是呈现显著的检测灵敏度，其检测限为50拷贝/μL。

在本发明的优选的实施方案中，实时荧光定量PCR是“热启动”的，从而更大程度避免了非特异性扩增。

在一个具体的实施方案中，实时定量PCR完成后，根据标准品DNA浓度与检测获得Ct值结果，拟合标准曲线，进而通过标准曲线计算得到待测样本中RCA的含量。

在本发明的一些实施方案中，提供了试剂盒，其包含本发明的方法所使用的除了待测样本之外的全部或部分试剂，包括引物和/或探针。

在本发明的一个尤其具体的实施方案中，提供了一种试剂盒，其包含：PCR扩增反应液、标准品、阴性对照以及DNA稀释液。所述PCR扩增反应液包括Taq酶、dNTPs、Mg

其中，所述特异性扩增Hexon基因的引物对可以选自以下任一组：

a)

CGCATGTACTCCTTCTTTAGA(SEQ ID：4)

CTGTTGGTAGTCCTTGTATTTAG(SEQ ID：5)

b)

GACCGCATGTACTCCTTC(SEQ ID：6)

GTTGGTAGTCCTTGTATTTAGT(SEQ ID：7)

c)

CCGCATGTACTCCTTCTT(SEQ ID：8)

CCTGTTGGTAGTCCTTGTATT(SEQ ID：9)。

其中，所述特异性扩增E1A基因的引物对可以选自以下任一组：

a)

5’-ACACCTCCTGAGATACACCCG-3’(SEQ ID：10)

5’-GCAAGTCCTCGATACATTCCACA-3’(SEQ ID：11)

b)

5’-ATAGCTGTGACTCCGGTCCTTC-3’(SEQ ID：13)

5’-AGCAAGTCCTCGATACATTCCA-3’(SEQ ID：14)

c)

5’-CTTGGGTCCGGTTTCTATGC-3’(SEQ ID：15)

5’-TTCATCCTCGTCGTCACTGG-3’(SEQ ID：16)。

其中，所述特异性检测Hexon基因扩增产物的探针序列如Hex-CATCCACCACCTGACGGCTC-BHQ1(SEQ ID：3)所示。

其中，所述特异性检测E1A基因扩增产物的探针可以选自以下任一组：

a)

5’-FAM-CTGTGCCCCATTAAACCAGTTGCCG-3’-BHQ1(SEQ ID：12)

b)

FAM-5’-ACCTGCCACGAGGCTGGCTTTCC-3’TAMRA-3’(SEQ ID：17)。

本发明的另一个实施方案是一种评价腺病毒载体制品质量的方法，其中所述方法能够检测任何污染的RCA存在与否及其含量，所述方法包括使用具有如上文定义的意思的方法。

本发明的另一个实施方案是组合物，以及组合物在用于评价腺病毒载体制品质量中的用途，或在用于检测腺病毒载体制品中的任何污染的RCA的存在中的用途，其中，组合物由正向引物和反向引物的引物对，和/或探针组成，其中正向引物和反向引物和探针具有如上文定义的意思。

本发明的另一个实施方案是正向引物和反向引物的引物对，和/或探针在制备检测剂中的用途，所述检测剂用于评价腺病毒载体制品质量中的用途，或在用于检测腺病毒载体制品中的任何污染的RCA的存在中的用途，其中正向引物和反向引物和探针具有如上文定义的意思。

在本发明的一些实施方案中，样品通过例如蛋白酶K法、苯酚法、CTAB法、SDS裂解法、试剂盒(磁珠或非磁珠)法、二氧化硅吸附法、商品化吸附膜式柱提取试剂盒法和碱裂解法等常规方法处理以提取总DNA。本文所述的这些方法具有与本领域技术人员所常规使用的相同的含义、适用情形和效果，其具体步骤可参见例如本领域常用的那些教科书，诸如J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社；李钧敏著，《分子生物学实验》，浙江大学出版社，第一版，等。在一些具体的实施方案中，本发明的方法选择裂解法裂解病毒以获取DNA。

以下通过一些说明性但非限制性的实施例来具体解释本发明的技术方案，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域技术人员能够理解的是，一些未记载在以下实施例中但属于常规或简单或等同替代方式也落入本发明的保护范围。

具体实施方式：

实施例1：材料和方法

所用供试品腺病毒制品为非复制型腺病毒AdV5(批号2022101701)，其通过AdMAX腺病毒系统(加拿大Microbix Biosystems Inc.，包含pBHGlox(delta)E13Cre和pDC316质粒)制备。首先将外源基因EGFP基因(EGFP：增强型绿色荧光蛋白)插入穿梭质粒pDC316获得pDC316-EGFP，再将腺病毒基因组骨架质粒pBHGlox(delta)E13Cre和穿梭质粒pDC316-EGFP共感染HEK293细胞，获得AdV5-EGFP腺病毒毒种。毒种在悬浮的HEK293细胞中扩增获得AdV5-EGFP病毒。

以待扩增基因为模板，PCR所用的上游、下游引物及探针利用Beancon designer软件进行设计，根据软件评分高低，并综合扩增区域和针对两个靶标的引物探针之间的配合程度，选择适合的候选物，委托擎科生物科技有限公司公司合成。引物纯度级别为PAGE，探针纯度级别为HPLC。初步选用的引物对及探针序列如表1、表2所示。

表1Hexon引物探针序列

表2E1A引物探针序列

荧光实时定量PCR所用试剂如下：

实施例2：构建对照标准品质粒pJET1.2-Hexon-E1A-E1B55K

基础质粒pJET1.2-E1A-E1B55K为发明人此前构建，其序列为SEQ ID NO:20所示。以pBHGlox(delta)E13Cre腺病毒包装质粒为模板，利用In-Fusion引物(上游引物：’-aatgcatctagatccgaattcATGGCTACCCCTTCGATGATG-3’(SEQ ID NO:18)；下游引物：5’-atgtctcatggtggcgaattcTTATGTTGTGGCGTTGCCG-3’(SEQ ID NO:19))进行PCR扩增，获得2901bphexon基因目的片段；将pJET1.2-E1A-E1B55K质粒进行EcoRI单酶切，获得5425bp的线性化载体，然后进行In-fusion克隆将目的片段插入载体，转化涂板后进行酶切、测序鉴定，结果显示与构建体设计相符，完整序列如SEQ ID NO:21所示。酶切鉴定结果如图1所示，所构建获得的质粒图谱如图2所示。

实施例3：Hexon、E1A引物探针筛选

用含0.05％ F68的RNase-Free Water将标准品质粒pJET1.2-Hexon-E1A-E1B55K以10倍比稀释：1×10

表3qPCR反应体系

表4反应条件(7500Fast Real-Time PCR System)

结果如表5、表6所示，4组Hexon引物探针序列中，第2组引物探针获得标准曲线的R

表5Hexon基因引物筛选

/>

注：Und＝Undetermined

表6E1A基因引物筛选

/>

注：Und＝Undetermined

实施例4：双重qPCR与普通qPCR可比性检测

以Hexon引物探针组合2和E1A引物探针组合2为例，对标准品质粒进行双重qPCR和普通qPCR检测，普通qPCR检测方法如实施例3所述，双重qPCR反应体系如表7所示，其余操作方法如实施例3所述。

表7双重qPCR反应体系

检测结果如表8所示，双重qPCR检测获得标准品质粒CT值与普通单重qPCR相应浓度标准品CT值无显著差异，Hexon-2/E1A-2引物对双重qPCR、普通单重qPCR检测结果R

表8-1普通qPCR检测

/>

注：Und＝Undetermined

表8-2双重qPCR检测

注：Und＝Undetermined

实施例5：双重qPCR与普通qPCR检测非复制型腺病毒载体制品中RCA效果比较

本实施例采用本发明方法(方法一)和现有技术(参见，于雷等，2017)中记载的普通单重qPCR检测E1基因的方法(方法二)分别检测非复制型腺病毒制品中RCA含量水平。

方法一：采用实施例4所述双重qPCR方法，以Hexon引物探针组合2、E1A引物探针组合2为例，检测供试品AdV5中E1A基因拷贝数、Hexon基因拷贝数，二者比值即为RCA残留水平；

方法二：采用实施例4所述普通qPCR方法，以E1A引物3为引物探针检测供试品AdV5中E1A拷贝数(拷贝/μL)，以HPLC方法检测供试品AdV5病毒颗粒滴度(vp/mL)，E1A拷贝数(拷贝/mL)/病毒颗粒滴度(vp/mL)即为RCA残留水平。

分别将供试品AdV5(同前，批号2022101701)稀释4、8、16、10倍后进行检测，并计算4次检测结果的CV％值，评价两种方法检测结果的准确性。

结果如表9、10所示，方法一的4次检测结果间CV％值为23.38％；在方法二中，HPLC法检测供试品原液病毒颗粒滴度为2.88E+10VP/mL，HPLC法检测范围为1.5E+10～1.0E+12VP/mL，因此进行4、8、16、10倍稀释后样品病毒颗粒滴度检测结果偏差较大，无法准确检测，因而无法准确评估制品中RCA残留水平，仅能检测E1A基因拷贝数。进一步利用计算获得的相应样品的病毒颗粒滴度计算方法二检测获得RCA残留水平，计算4次检测结果CV％值为82.02％，远高于方法一。

以上结果可以看出，双重qPCR法检测非复制型腺相关病毒RCA残留水平的结果准确性较高，可检测更低病毒颗粒滴度样品中RCA残留，且操作简便快捷，具有较显著优势。

表9方法1检测结果

表10方法2检测结果

实施例6：双重qPCR重复性检测

为了评估实验设计的重复性，用Hexon-引物探针组合2联合E1A-引物探针组合2、3分别进行2次双重qPCR检测，结果如表11、12所示，均符合R

表11双重qPCR检测重复1

/>

注：Und＝Undetermined

表12双重qPCR检测重复2

/>

注：Und＝Undetermined

实施例7：定量限

实施例4所述双重qPCR方法，使用Hexon引物探针组合2、E1A引物探针组合2，进行3次标准曲线测试，确定双重qPCR检测定量限。结果如表13所示，当标曲范围为1E+07～5拷贝/μL时，各浓度CV％值(CV％＝实测值/理论值×100％)均在50％～150％范围内。因此本方法可准确定量标曲范围为1E+07～5拷贝/μL，最低定量限为5拷贝/μL，比现有文献(例如于雷等，2017)提高了10倍，制备双重qPCR样品至少会被稀释10倍(详见实施例8、9、10)，因此本方法可检测样品中E1A基因低至50拷贝/μL。若样品浓度为1E+11vg/mL，本方法最低可检测到RCA残留水平低至1/2E+09。

表13-1E1A基因3次实验标准曲线回收率

/>

注：Und＝Undetermined

表13-2Hexon基因3次实验标准曲线回收率

注：Und＝Undetermined

实施例8：线性

分析方法的线性是指在给定的范围内检测结果与供试品中被分析物的成比例关系，测试本方法检测非复制型腺病毒样品(以AdV5批号Ad2022101701为例)线性范围，根据前期的检验结果，用稀释液将前处理后(完成蛋白酶K消化步骤)的供试品进行下列稀释：

线性测试液1：2倍稀释供试品；

线性测试液2：4倍稀释供试品；

线性测试液3：8倍稀释供试品；

线性测试液4：16倍稀释供试品；

线性测试液5：10倍稀释供试品；

线性测试液6：32倍稀释供试品；

线性测试液7：100倍稀释供试品；

线性测试液8：1000倍稀释供试品

上述线性测试液分别取5μL作为模板进行qPCR反应，并设置2个复孔。从上述8个线性稀释液检测结果中选择合适的至少5个点进行线性拟合，两个基因独立分析。供试品线性拟合曲线：以CT值和检测值的对数值进行拟合。三次重复实验以得到最佳线性范围。结果如表14～16所示，8个线性稀释液均符合接受标准：R

通过公式(CV％＝本线性稀释液的Quantity Mean*稀释倍数值/Quantity Mean*稀释倍数均值)计算各稀释倍数下CV％值，可初步判断样品前处理所需最小稀释倍数，如下表结果所示，将完成蛋白酶K消化步骤的样品至少稀释4倍时，可满足CV％在60％～140％。

表14线性1

注：CV％＝本线性稀释液的Quantity Mean*稀释倍数值/Quantity Mean*稀释倍数均值

表15线性2

注：CV％＝本线性稀释液的Quantity Mean*稀释倍数值/Quantity Mean*稀释倍数均值

表16线性3

实施例9：精密度

分析方法的精密度是指在规定条件下对均质供试品多次取样进行一系列检测结果的接近程度，一般表示为变异系数(CV％)，变异系数即是测定值的标准差和测定值均数的比值。从重复性和中间精密度2个方面测试本方法检测非复制型腺病毒样品(以AdV5批号Ad2022101701为例)精密度。

1.重复性

将供试品稀释为高、中、低三个浓度，同一检验人员对三个浓度进行检测，重复三次。

结果如表17～19所示，前处理样品稀释倍数至少为8倍时，3次E1A基因、Hexon基因检测结果及E1A/Hexon比值CV％均≤40％，CV％＝STDE/AVERAGE×100％。。

表17E1A基因3次检测结果CV％值

表18 Hexon基因3次检测结果CV％值

表19 E1A/Hexon3次检测结果CV％值

2.中间精密度

将供试品稀释为高、中、低三个浓度，不同检验人员对三个浓度进行检测，不同时间重复两～三次，计算所有检测结果CV％值。中间精密度结果如实施例9所示，由表20中5次实验结果的CV％值(CV％＝AVERAGE/STDEV×100％)可以看出，与单独检测E1A基因拷贝数或Hexson基因拷贝数相比，E1A/Hexson结果中间精密度更好，CV％＜20％。

实施例10：准确度

分析方法的准确度是指测定值与真实值或认可的参考值的一致性或接近程度。根据线性结果(实施例7)，确定RCA高、中、低三个浓度，其中中浓度为线性确定范围的中间值，高、低浓度则为线性确定范围的最高值和最低值，若结果不能达到接受标准，则线性确定范围的次高值和次低值做为高、低浓度，以此类推。

将供试品(同前，AdV5批号Ad2022101701)用稀释液稀释成高、中、低三个浓度(即稀释10倍、32倍、100倍)的样品分别检测三次，计算回收率。回收率％＝检测值/标准值×100％。选择数据准确性较好的3个中间值(稀释16倍、32倍、100倍)，通过2名实验员对期分别进行检测，将共5次检测结果的均值确定为供试品的标准值。

检测结果如下表所示，表20为2名实验员共5次检测结果，计算每名实验员检测16倍、32倍、100倍供试品回算浓度(回算浓度＝检测浓度×稀释倍数)所有结果的均值(见表21)，进一步计算2名实验员均值的平均值作为标准值，结果如表21所示，Hexon为1.35E+08vg/μL，E1A为346.62vg/μL，E1A/Hexon为2.5818E-06。

将供试品稀释为10倍、32倍、100倍得样品分别检测3次，计算回收率，结果如表22所示，Hexon基因回收率在25％～175％、E1A回收率在25％～175％、E1A/Hexon回收率在70％～130％。样品稀释10倍时，准确度符合可接受标准。

由以上结果可以看出，E1A/Hexon检测结果准确度较好，符合接受标准回收率在70％～130％。同时，由表20中5次实验结果的CV％值(CV％＝AVERAGE/STDEV×100％)可以看出，与单独检测E1A基因拷贝数或Hexson基因拷贝数相比，E1A/Hexson结果中间精密度更好，CV％＜20％。

由以上数据可以看出本发明中双重qPCR检测结果E1A/Hexson准确度、重复性均远优于单独检测E1A基因拷贝数或Hexson基因拷贝数。

表20两名实验员共5次检测结果

表21两名实验员检测结果均值

表22高、中、低三个浓度的样品3次检测结果回收率

实施例11：定量限

由实施例10数据可以看出，符合重复性、准确度接受标准的样品最小稀释倍数为10倍，由实施例6可以获得qPCR方法定量限为5拷贝/μL，因此本方法可检出最低RCA含量为50拷贝/样品浓度。

实施例12：专属性

分析方法的专属性是指当制品中含有其它组分，如杂质、降解物、添加物(如缓冲液、赋形剂、稳定剂)等存在时，准确可靠测定供试品的能力。在本检测方法中最有可能影响检测结果的是稀释液、CX缓冲液和宿主细胞裂解液。在一次试验中分别测定稀释液、CX缓冲液、宿主细胞裂解液及供试品，统计各样品的检测结果。稀释液、CX缓冲液应不能检出E1A和Hexon，宿主细胞裂解液的检测结果E1A可以检出，Hexon不能检出；供试品E1A和Hexon均可检出。

结果如表23，符合接受标准。

表23供试品专属性检测

注：Und＝Undetermined

根据本发明的公开内容，技术人员可以很容易地对其进行修改。例如，虽然我们实际上已经使用实施例中重组腺病毒载体测试了我们的RCA检测法，但该方法还可以在其他腺病毒载体(例如，含其他转基因的载体)中鉴定具有复制能力的污染病毒。