一种毛细管电泳串联质谱检测血清蛋白质的方法

技术领域

本发明涉及生物化学检测技术领域，尤其涉及一种毛细管电泳串联质谱检测血清蛋白质的方法。

背景技术

血清蛋白电泳是对血清中蛋白质(白蛋白、α-蛋白、β-蛋白以及M蛋白)进行变异体鉴定和定量筛查的一种常见方法，尤其在肾病(如肾病综合征、单克隆免疫球蛋白相关肾损伤)、肝硬化和浆细胞病(如多发性骨髓瘤)患者最具有特征性的变化，其临床诊断上意义重大。目前采用的电泳法检测血清蛋白的技术，包括醋酸纤维素薄膜电泳(Celluloseacetate film electrophoresis，CAE)、琼脂糖凝胶电泳(Agarose gel electrophoresis，AGE)和毛细管电泳(Capillary electrophoresis，CE)。毛细管电泳因其对血清蛋白分离效率高，现在已经成为临床分析血清蛋白的一种常规的分离方法，常用的检测血清蛋白电泳技术是毛细管电泳与紫外检测结合，只能得到蛋白的紫外吸收峰，但是无法对每个蛋白进行在线鉴定，且紫外检测器灵敏度低、准确度低且对样本需求量大。液相色谱与质谱联用方法是将液相色谱分离技术与质谱的精确蛋白质分子质量检测技术相结合的联用技术，目前也可以对血清蛋白进行分离和精确鉴定，但是液相色谱对血清蛋白分离效果不佳，且需要复杂的样本前处理如亲和免疫富集和固相萃取等，造成样本需求量大，复杂的处理步骤造成检测成本高，误差率大且效率低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种毛细管电泳串联质谱检测血清蛋白质的方法，可以实现人血清蛋白的高效分离和高准确度鉴定，且样本处理简单。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种毛细管电泳串联质谱检测血清蛋白质的方法，包括以下步骤：

将血清样本和缓冲液混合，得到待测样品液；

将所述待测样品液进行毛细管电泳质谱联用在线分析检测，根据质谱所得分子量鉴定血清蛋白；

所述毛细管电泳质谱联用在线分析检测中毛细管电泳的条件包括：分离缓冲液为30wt％醋酸水溶液，分离电压为30kV，进样方式为压力进样，压力进样的压力为100mbar，进样时间为7s；

所述毛细管电泳质谱联用在线分析检测中质谱的条件包括：正离子扫描模式，干燥气流速为6L/min，干燥温度为380℃，碎裂电压365V，分流器电压为65V，MS扫描范围m/z800～3200，扫描速率为1spectrum/s。

优选的，所述缓冲液为乙酸铵溶液，所述乙酸铵溶液的浓度为100mmol/L。

优选的，所述乙酸铵溶液所用溶剂为4wt％乙酸水溶液。

优选的，所述血清样本与缓冲液的体积比为1:19；所述毛细管电泳的进样量为40μL。

优选的，所述毛细管电泳所用分离毛细管为长度100cm的中性涂层毛细管。

优选的，所述毛细管电泳质谱联用在线分析检测中离子源条件包括：电渗流驱动同轴鞘流液电喷雾离子源，鞘流液为含有体积分数0.5％的甲酸和10％异丙醇的混合水溶液。

优选的，所述毛细管电泳质谱联用在线分析检测中离子源条件包括：电喷雾针的材质为硼酸硅盐玻璃；喷雾电压为2.2kV，电喷雾针距离质谱的距离为4.0mm，毛细管距离喷针的距离为0.67mm。

优选的，所述电喷雾针的外径为1.5mm，内径为1.17mm，开口直径为20μm。

优选的，所述毛细管电泳-质谱检测中质谱应用飞行时间质谱系统进行检测。

本发明提供了一种毛细管电泳串联质谱检测血清蛋白质的方法，本发明将人血清与缓冲液混合后，直接进行毛细管电泳与质谱联用的在线分析(样本先通过CE进行分离，分离得到蛋白经过离子化后变成离子，直接进质谱分析检测)，通过毛细管电泳分离实现了血清中高丰度蛋白(白蛋白、转铁蛋白和免疫球蛋白)的有效分离，利用毛细管电泳与质谱联用的在线分析技术，将各个蛋白质通过质谱离子源电离用于质谱分析，能够有效降低样本需求量，降低样本前处理难度，增加蛋白质的在线分离度，准确鉴定出血清蛋白质的数量和种类。本发明所采用的样本前处理方法过程简易，成本低，样本需求量少，同时采用CE-MS联用离子源的毛细管电泳-飞行时间质谱联用技术，可以实现对人血清样品的高效分离及高灵敏度的检测，实现人血清蛋白的高效、高准确度鉴定，为进一步开展血清蛋白电泳在临床的应用研究工作提供了依据。

本发明将毛细管电泳的高效分离和高分辨质谱的定性能力结合，采用毛细管电泳进行蛋白分离，在分离效率上优于传统的凝胶电泳；采用高分辨质谱进行蛋白检测和定性，比传统电泳通过显色法更加灵敏，使血清蛋白的定性更准确可靠。

进一步的，本发明采用特定缓冲液处理血清样品，无需通过传统的电泳手段进行血清蛋白组成的分析，解决了传统电泳方法操作复杂、定性能力不足的问题。本发明限定血清蛋白分离的毛细管和试剂，电渗流驱动同轴鞘流液CE-MS联用离子源的使用方法和试剂，实现了CE-MS对人血清蛋白整体分子量水平的鉴定分析。

与传统毛细管电泳-液相色谱质谱联用方法相比，本发明的方法无需制备特异性稀释剂，精确、高效、费用低，并且实现了人血清中高丰度蛋白有效分离和蛋白质整体分子量水平的准确鉴定，对于促进人血清中高丰度蛋白在临床诊断和治疗应用具有重要意义。

与双向电泳联合串联质谱技术进行血清蛋白质检测方法相比(通过双向电泳进行差异比较，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱(MALDI/TOF/TOF/MS)鉴定血清蛋白，步骤繁多，且样本前处理复杂，无法实现血清蛋白在线鉴定分析)，本发明的方法能够实现血清蛋白的在线鉴定分析，且样本处理简单。

附图说明

图1为本发明的方法流程图；

图2为人血清蛋白毛细管电泳质谱联用分析的总离子流色谱图；

图3为人血清蛋白毛细管电泳质谱联用分析的6个蛋白的质谱图；

图4为人血清蛋白毛细管电泳质谱联用分析的6个蛋白解卷积后精确分子量质量图。

具体实施方式

本发明提供了一种毛细管电泳串联质谱检测血清蛋白质的方法，包括以下步骤：

将血清样本和缓冲液混合，得到待测样品液；

将所述待测样品液进行毛细管电泳质谱联用在线分析检测，根据质谱所得分子量鉴定血清蛋白；

所述毛细管电泳质谱联用在线分析检测中毛细管电泳的条件包括：分离缓冲液为30wt％醋酸水溶液，分离电压为30kV，进样方式为压力进样，压力进样的压力为100mbar，进样时间为7s；

所述毛细管电泳质谱联用在线分析检测中质谱的条件包括：正离子扫描模式，干燥气流速为6L/min，干燥温度为380℃，碎裂电压365V，分流器电压为65V，MS扫描范围m/z800～3200，扫描速率为1spectrum/s。

在本发明中，若无特殊说明，所需试剂或设备均为本领域技术人员熟知的市售商品。

本发明将血清样本和缓冲液混合，得到待测样品液。

本发明对所述血清样本的来源没有特殊的限定，按照本领域熟知的方式获取即可。在本发明的实施例中，优选采用冻存在-80℃冰箱的血清，在室温下解冻，直至血清样本恢复至室温，用于制备待测样品液。

在本发明中，所述缓冲液优选为乙酸铵溶液，所述乙酸铵溶液的浓度优选为100mmol/L，所述乙酸铵溶液所用溶剂优选为4wt％乙酸水溶液。本发明对所述缓冲液的配制过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的方法配制得到上述浓度的缓冲液即可；在本发明的实施例中，具体是采用4mL乙酸、96mL水和0.77g乙酸铵混合配制而成。本发明所用缓冲液能够稀释样本基质，使待测蛋白带上电荷，也使样本可以与CE的分离缓冲液更兼容。

在本发明中，所述血清样本与缓冲液的体积比优选为1:19。

本发明优选将血清样本和缓冲液混合所得混合物采用涡旋仪振荡30s混合均匀，得到待测样品液。

得到待测样品液后，本发明将所述待测样品液进行毛细管电泳质谱联用在线分析检测，根据质谱所得分子量鉴定血清蛋白。

在本发明中，所述毛细管电泳质谱联用在线分析检测所用毛细管电泳质谱联用仪(CE-MS)为永道致远科学技术有限公司子公司美国CMP科技公司所公开的CMP ECE-001型电泳仪和CMP EMAST II型CE-MS联用离子源，具有灵敏度高、对血清蛋白分离度好，可以实现血清中蛋白的分离且对其进行实时鉴定。

在本发明中，所述毛细管电泳质谱联用在线分析检测中毛细管电泳的条件包括：分离缓冲液为30wt％醋酸水溶液，分离电压为30kV，进样方式为压力进样，压力进样的压力为100mbar，进样时间为7s。

在本发明中，所述毛细管电泳所用分离毛细管优选为长度100cm的中性涂层毛细管；本发明对所述中性涂层毛细管没有特殊的限定，本领域熟知的相应材料即可。

在本发明中，所述毛细管电泳的进样量优选为40μL。

本发明所述毛细管电泳质谱联用在线分析检测中，首先通过毛细管电泳进行电泳分离，再通过CE-MS离子源进行离子化，实现CE和MS联用的在线分析，进而促进样本离子化。

在本发明中，所述毛细管电泳质谱联用在线分析检测中离子源条件优选包括：电渗流驱动同轴鞘流液电喷雾离子源，鞘流液为含有体积分数0.5％的甲酸和10％异丙醇的混合水溶液；电喷雾针的材质为硼酸硅盐玻璃；喷雾电压为2.2kV，电喷雾针距离质谱的距离为4.0mm，毛细管距离喷针的距离为0.67mm；所述电喷雾针的外径为1.5mm，内径为1.17mm，开口直径为20μm。

在本发明中，所述毛细管电泳质谱联用在线分析检测中质谱的条件包括：正离子扫描模式，干燥气流速为6L/min，干燥温度为380℃，碎裂电压365V，Skimmer为65V，MS扫描范围m/z 800～3200，扫描速率为1spectrum/s。

在本发明中，所述毛细管电泳-质谱检测中质谱优选应用飞行时间质谱系统进行检测。

图1为本发明的方法流程图；本发明采用毛细管电泳质谱联用在线分析检测，对前处理后的血清样品进行毛细管电泳分离，然后通过质谱实现离子化后，进行质谱分析，从而实现血清蛋白的鉴定。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例中，所用缓冲液的配制方法为：将4mL乙酸、96mL水和0.77g乙酸铵混合，得到浓度为100mmol/L的缓冲液。

实施例1

(1)待测样品的前处理：取出冻存在-80℃冰箱的人血清，在室温下解冻，待样本恢复至室温，取2μL血清样本，然后取38μL缓冲液(4％乙酸和100mmol/L乙酸铵)稀释，利用涡旋仪振荡30s混匀，等待进样分析。

(2)毛细管电泳-质谱联用分析条件如下：

毛细管电泳条件：分离毛细管为100cm中性涂层毛细管，分离缓冲液为30wt％醋酸水溶液，分离电压为30kV，100mbar压力下进样7s；

毛细管电泳串联质谱联用离子源条件：电渗流驱动同轴鞘流液电喷雾离子源，鞘流液为含有体积分数0.5％的甲酸和10％异丙醇的混合水溶液，电喷雾针为硼酸硅盐玻璃，尺寸为外径1.5mm，内径1.17mm，开口直径为20μm；喷雾电压为2.2kV，喷针距离质谱的距离为4.0mm，毛细管距离喷针的距离为0.67mm；

质谱条件：应用飞行时间质谱系统进行检测，扫描方式：正离子扫描模式，干燥气流速为6L/min和干燥温度为380℃，碎裂电压365V，分流器电压为65V，MS扫描范围m/z 800～3200，扫描速率为1spectrum/s；

将所得质谱数据通过解卷积后，得到每个蛋白质的分子量，通过精确分子量鉴定出血清中每个蛋白质。

图2为人血清蛋白毛细管电泳质谱联用分析的总离子流色谱图；

图3为人血清蛋白毛细管电泳质谱联用分析的6个蛋白的质谱图；

图4为人血清蛋白毛细管电泳质谱联用分析的6个蛋白解卷积后精确分子量质量图。

由图2～4可知，从人血清蛋白中共鉴定出6个血清蛋白，其中3个白蛋白异质体(P1，P2，P3)，1个转铁蛋白(p4)，1个糖基化修饰的轻链(p5)和1个游离多肽(p6)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。