一种基于DNAzyme的多种疾病靶标检测和治疗体系及其应用

技术领域

本发明涉及临床检验领域，尤其是一种基于DNAzyme的多种疾病靶标检测和治疗体系及其应用。

背景技术

脱氧核糖核酸酶(DNA酶)是通过体外筛选出具有切割DNA或RNA活性的寡核苷酸序列，1997年有人筛选出具备高度模块化、特异性和高效的8-17和10-23DNA酶。10-23DNA酶切割示意图如图1所示，包括高度保守的15个脱氧核苷酸组成的催化结构域，其两侧有两个底物识别结构域，用于通过碱基互补配对识别RNA底物或DNA-RNA复合底物，并提供结合能以维持底物在10-23DNA酶活性位点内。二价金属阳离子作为辅助因子，底物在未配对的嘌呤(R)和配对的嘧啶(Y)之间裂解特定的磷酸二酯键，产生5′端和3′端切割产物。10-23DNA酶是切割活性最高的DNA酶之一，已经作为检测信号放大体系用于多种疾病靶标检测，为临床检验诊断提供新型技术路线。

DNA粘性末端链置换反应存在设计困难、检测靶标通用性较差等问题；分裂DNA酶存在切割活性低、信号放大效果受损等问题，同时需结合杂交链式反应(HCR)、催化发夹放大(CHA)、逆转录重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)等前置扩增体系，设计复杂、通用性差。

因此，需要设计一种基于DNAzyme的多种疾病靶标检测和治疗体系。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，提供一种基于DNAzyme的多种疾病靶标检测和治疗体系及其应用。

本发明通过下述方案实现：

一种基于DNAzyme的多种疾病靶标检测和治疗体系，该体系包括自封锁的DNAzyme(S1)、检测靶标(S2)、切割底物(S3)；所述DNAzyme(S1)包括环1和环2，所述环1为10-23DNA酶保守催化结构域，所述环2是与检测靶标(S2)完全互补配对的核酸序列；

所述DNAzyme(S1)开始时处于切割活性受抑制状态，体系中加入检测靶标(S2)，激活DNAzyme(S1)的切割活性，切割底物(S3)释放荧光通过检测荧光信号以实现检测和治疗目的。

所述DNAzyme(S1)折叠形成自封锁结构使其处于切割活性受抑制状态。

对检测靶标(S2)进行响应，引发包括但不限于荧光信号的改变。

所述DNAzyme(S1)的环1的右侧为结合域1，所述DNAzyme(S1)的环1的左侧为结合域2，所述结合域1和结合域2均由寡核苷酸构成。

所述结合域1和结合域2分别由x个寡核苷酸和y个寡核苷酸构成，x和y的范围为3-8。

在DNAzyme(S1)的环2的右侧为结合域3，所述DNAzyme(S1)的环2的左侧为结合域4；

所述结合域3和结合域4与结合域1和结合域2互补配对以抑制DNAzyme(S1)的切割活性。

所述检测靶标(S2)加入体系时，DNAzyme(S1)的环2与检测靶标(S2)形成23bp的双链DNA，所述结合域1与结合域3的碱基互补配对被破坏。

所述检测靶标(S2)为DNA或RNA单链，所述检测靶标(S2)的长度为13-60nt。

一种基于DNAzyme的多种疾病靶标检测和治疗体系的应用，该体系应用于检测和治疗多种疾病。

针对多种疾病的检测与治疗，可应用于包括但不限于病人和健康人的microRNA检测；针对病毒的检测，可以应用于检测包括但不限于病人唾液样本、血清样本、粪便样本。

本发明的有益效果为：

本申请一种基于DNAzyme的多种疾病靶标检测和治疗体系具有体系简单、通用性强、敏感性高、室温检测等优势，只需DNA酶一步放大即可实现microRNA fM级检测限(LOD)。

附图说明

图1为10-23DNA酶切割示意图；

图2为本申请一种基于DNAzyme的多种疾病靶标检测和治疗体系的结构示意图；

图3为体系检测限和体系通用性验证结果图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明优选的实施例进一步说明：

如图2所示，一种基于DNAzyme的多种疾病靶标检测和治疗体系，该体系包括自封锁的DNAzyme(S1)、检测靶标(S2)、切割底物(S3)；所述DNAzyme(S1)包括环1和环2，所述环1为10-23DNA酶保守催化结构域，所述环2是与检测靶标(S2)完全互补配对的核酸序列；

所述DNAzyme(S1)开始时处于切割活性受抑制状态，体系中加入检测靶标(S2)，激活DNAzyme(S1)的切割活性，切割底物(S3)释放荧光通过检测荧光信号以实现检测和治疗目的。。

所述DNAzyme(S1)折叠形成自封锁结构使其处于切割活性受抑制状态。

对检测靶标(S2)进行响应，引发包括但不限于荧光信号的改变。

所述DNAzyme(S1)的环1的右侧为结合域1，所述DNAzyme(S1)的环1的左侧为结合域2，所述结合域1和结合域2均由寡核苷酸构成。

所述结合域1和结合域2分别由x个寡核苷酸和y个寡核苷酸构成，x和y的范围为3-8。

在DNAzyme(S1)的环2的右侧为结合域3，所述DNAzyme(S1)的环2的左侧为结合域4；

所述结合域3和结合域4与结合域1和结合域2互补配对以抑制DNAzyme(S1)的切割活性。

所述检测靶标(S2)加入体系时，DNAzyme(S1)的环2与检测靶标(S2)形成23bp的双链DNA，由于所述双链DNA的刚性结构，所述结合域1与结合域3的碱基互补配对被破坏，从而激活DNA酶切割活性，切割底物(S3)释放荧光实现信号放大。

所述检测靶标(S2)为DNA或RNA单链，所述检测靶标(S2)的长度为113-60nt。

一种基于DNAzyme的多种疾病靶标检测和治疗体系，该体系应用于检测和治疗多种疾病。

针对多种疾病的检测与治疗，可应用于包括但不限于病人和健康人的microRNA检测；针对病毒的检测，可以应用于检测包括但不限于病人唾液样本、血清样本、粪便样本。

经过一系列优化实验，如图3(a)所示，在加入底物室温孵育1小时后，即可实现fM级miR155的检测。为了进一步证明该体系的通用性，我们同时缩短或延长环2和检测靶标(S2)的长度，如图3(b)所示，检测靶标(S2)的长度在13-60nt之间的DNA或RNA单链均可在该体系中完成检测。

因此，根据不同的检测靶标序列，只需改变S1中环2的部分，其余所有序列均保持不变，只需两条核酸链(S1、S3)即可实现检测多种疾

病靶标的目的，拥有检测体系简单、通用性强的优势。与HCR，CHA、

DNA酶连用的体系相比，不同的检测靶标序列需要重新设计多条发夹结构实现体系的工作，检测体系较复杂、通用性较弱。虽然只有一步信号放大步骤，也可以在1小时实现fM级检测，实现短时间高敏感性检测，与多种信号放大联用体系检测限接近。

尽管已经对本发明的技术方案做了较为详细的阐述和列举，应当理解，对于本领域技术人员来说，对上述实施例做出修改或者采用等同的替代方案，这对本领域的技术人员而言是显而易见，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。