一种具有抗炎功效的中药组合物及其制备方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种具有抗炎功效的中药组合物及其制备方法。

背景技术

炎症(inflammation)是具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的防御反应，是机体对于刺激的一种防御反应，表现为红、肿、热、痛和功能障碍。炎症，可以是感染引起的感染性炎症，也可以不是由于感染引起的非感染性炎症。在炎症过程中，一方面损伤因子直接或间接造成组织和细胞的破坏，另一方面通过炎症充血和渗出反应，以稀释、杀伤和包围损伤因子。同时通过实质和间质细胞的再生使受损的组织得以修复和愈合。因此可以说炎症是损伤和抗损伤的统一过程。主要的细胞天然宿主防御机制是中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞对细菌和真菌的吞噬和杀灭，以及自然杀伤(NK)细胞对病毒感染细胞的裂解。一旦识别微生物，就会分泌促炎细胞因子，这些细胞因子激活中性粒细胞和巨噬细胞吞噬入侵的病原体，释放有毒的氧和氮自由基。在众多炎症细胞因子中，起主要作用的是TNF-α(肿瘤坏死因子-α)、IL-1β(白介素-1β)、IL-6(白介素-6)等。

TNF-α是炎症反应过程中出现最早、最重要的炎性介质，能激活中性粒细胞和淋巴细胞，使血管内皮细胞通透性增加，调节其他组织代谢活性并促使其他细胞因子的合成和释放。其主要由巨噬细胞产生，LPS是诱导其产生的较强刺激剂，T细胞和NK细胞在某些刺激因子(如PMA)作用下也可分泌TNF－α；IL-1β通过非常规的蛋白质分泌途径分泌，可以旁分泌或系统分泌，主要由先天免疫系统的前哨细胞：单核细胞和巨噬细胞产生，也可以从上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、滑膜细胞、神经元、肥大细胞以及胶质细胞如小胶质细胞和星形胶质细胞等细胞中释放。IL-6主要由巨噬细胞、T细胞、B细胞等多种细胞产生，是一种多功能的细胞因子，调节免疫应答、血细胞生成、组织损伤时的急性时相反应、炎症反应等。在心脑血管疾病、肾脏疾病、肿瘤、关节炎、创伤、感染等疾病发生时，IL-6水平增高。IL-6和呼吸道疾病、肾脏疾病、肿瘤等疾病密切相关。

以TNF-α(肿瘤坏死因子-α)、IL-1β(白介素-1β)、IL-6(白介素-6)为代表的炎症细胞因子介导和参与许多疾病的病理生理过程。不仅急性感染中炎症因子大量表达，糖尿病、心血管疾病及肿瘤等慢性疾病也被认为有慢性炎症的参与。因此，需要进一步开发具有抑制炎症细胞因子、炎性介质表达的药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抗炎功效的中药组合物及其制备方法，该组合物具有良好的抗炎功效，同时制备方法简单，原料易得，具有很好的应用前景。

为实现上述发明目的，本发明技术方案如下：

一方面，本发明提供一种具有抗炎功效的中药组合物，包括以下成分：芍药苷、洋蓟酸、迷迭香酸、罗汉松脂苷、木犀草素4’-O葡萄糖苷、野尾鸢苷、牛蒡子苷、印度榅桲甙、牡荆素、牡丹皮苷J、丙二酰染料木苷、麻因脂肪酸F、松油酸、甘草皂苷A3、甘草皂苷G2和甘草次酸。

优选地，按照重量百分数，包括以下成分：0.1-25％芍药苷、0.1-20％洋蓟酸、0.1-30％迷迭香酸、0.1-15％罗汉松脂苷、0.1-40％木犀草素4’-O葡萄糖苷、0.1-30％野尾鸢苷、0.1-50％牛蒡子苷、0.1-20％印度榅桲甙、0.1-15％牡荆素、0.1-10％牡丹皮苷J、0.1-15％丙二酰染料木苷、0.1-25％甘草次酸、0.1-15％橙黄决明素-6-o-葡萄糖苷和0.1-15％异野鸢尾黄素。

进一步优选地，按照重量百分数，包括以下成分：0-10％芍药苷、5-15％洋蓟酸、5-15％迷迭香酸、0-5％罗汉松脂苷、0-10％木犀草素4’-O葡萄糖苷、0-10％野尾鸢苷、30-40％牛蒡子苷、0-5％印度榅桲甙、5-15％牡荆素、0-5％牡丹皮苷J、0-5％丙二酰染料木苷、5-15％甘草次酸、0-10％橙黄决明素-6-o-葡萄糖苷和0-10％异野鸢尾黄素。

进一步优选地，按照重量百分数，包括以下成分：2.91-3.59％芍药苷、10.83％洋蓟酸、5.74-9.74％迷迭香酸、0.39-1.89％罗汉松脂苷、3.62％木犀草素4’-O葡萄糖苷、5.05-5.49％野尾鸢苷、24.01-34.01％牛蒡子苷、2.53-3.00％印度榅桲甙、9.26-9.99％牡荆素、2.23-5.22％牡丹皮苷J、2.30-5.30％丙二酰染料木苷、7.73-8.41％甘草次酸、4.88-8.66％橙黄决明素-6-o-葡萄糖苷和3.38-5.41％异野鸢尾黄素。

最优选地，按照重量百分数，包括以下成分：2.91％芍药苷、10.83％洋蓟酸、9.74％迷迭香酸、0.39％罗汉松脂苷、3.62％木犀草素4’-O葡萄糖苷、5.05％野尾鸢苷、34.01％牛蒡子苷、3.00％印度榅桲甙、9.26％牡荆素、2.23％牡丹皮苷J、2.30％丙二酰染料木苷、8.41％甘草次酸、4.88％橙黄决明素-6-o-葡萄糖苷和3.38％异野鸢尾黄素。

另一方面，本发明上述中药组合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将牛蒡子、射干、桔梗、白芍、紫苏叶、金银花、焦山楂、黄芪、虎杖、甘草、浙贝、菊花、红茶制备成混合物母液；

(2)将步骤(1)所得混合物母液上柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，洗脱条件为：0min：4-6％乙腈、15min：13-17％乙腈、30min：18-22％乙腈、45min：28-40％乙腈、55min：90-100％乙腈、70min：95-100％乙腈；

(3)取45min-60min洗脱段流份，减压浓缩，除去乙腈得所述中药组合物。

优选地，步骤(1)中，按照重量份为牛蒡子5-15份、射干5-15份、桔梗5-15份、白芍5-15份、紫苏叶5-20份、金银花5-15份、焦山楂5-10份、黄芪5-15份、虎杖5-10份、甘草5-15份、浙贝10-20份、菊花3-12份、红茶40-80份。

进一步优选地，步骤(1)中，按照重量份为牛蒡子10份、射干10份、桔梗10份、白芍10份、紫苏叶10-15份、金银花10份、焦山楂8份、黄芪10份、虎杖10份、甘草8-10份、浙贝15份、菊花5-10份、红茶60份。

优选地，步骤(1)中，所述混合物的制备方法为：药材混合粉碎，过筛成最粗粉，混有能通过四号筛不超过40％的粗粉，过筛后总混，灭菌，加入十倍量水；回流提取，冷却补足失重，离心，取上清得到混合物母液。

进一步优选地，步骤(1)中，所述混合物的制备方法为：药材混合，2000-8000r/min粉碎30-120分钟，过筛成最粗粉，但混有能通过四号筛不超过40％的粗粉，过筛后通过槽型混合机混合20-50分钟进行总混，50-80℃辐照灭菌，称取药材粉末，加入8-15倍量超纯水；回流提取0.5-2小时，冷却后称重补足失重，3000-6000rpm离心5-20分钟，取上清得到供试母液。

作为本发明的一个具体实施例，步骤(1)中，所述混合物的制备方法为：对药材进行称重、混合，4800r/min粉碎60分钟，过筛成最粗粉，但混有能通过四号筛不超过40％的粗粉，过筛后通过槽型混合机混合30分钟进行总混，60℃辐照灭菌，称取药材粉末，加入十倍量超纯水(称重并记录)；回流提取1小时，冷却后称重补足失重，4000rpm离心10分钟，取上清得到供试母液。

优选地，步骤(2)中，所用柱子选自Agilent InfinityLab Poroshell 120 HPH-C18(21.2×150mm，5μm)、Agilent ZORBAX SB-C18(21×250mm，7μm)、Polaris

优选地，步骤(2)中，洗脱条件为：0min-5％乙腈、15min-15％乙腈、30min-20％乙腈、45min-30％乙腈、55min-100％乙腈、70min-100％乙腈。

再一方面，本发明提供上述中药组合物在制备抗炎药物中的应用。

最后，本发明提供一种药物，其有效成分包括上述中药组合物。

所述药物可制备成丸剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、粉剂、片剂、锭剂、糖锭剂等给药剂型，针对不同的剂型可选择本领域合适的药物载体。

所使用的药物载体可以是固体、液体或气体。固体载体示例包括乳糖、白陶土、蔗糖、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁和硬脂酸。液体载体的例子包括糖浆、花生油、橄榄油和水。气体载体的例子包括二氧化碳和氮气。

在制备口服剂型的组合物时，可以使用任何方便的药物介质。例如，水、乙醇、油、醇、调味剂、防腐剂、着色剂等可用于形成口服液体制剂，如混悬剂、剂和溶液；而载体，如淀粉、糖类、微晶纤维素、稀释剂、制粒剂、乳化剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂可用于形成口服固体制剂，如粉剂、胶囊剂和片剂。由于其易于给药，片剂和胶囊是使用固体药物载体的优选口服剂量单位。可选择使用标准水性或非水性技术对片剂进行包衣。

含有本发明中药组合物的片剂可以通过压片或模塑制备，可选择使用一种或多种辅助成分或佐剂。可通过在适当的机器中以自由流动的形式(如粉末或颗粒)压片活性成分，可选择与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性物质或分散剂混合来制备压片。模制片剂可在适当的机器中模制，即用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物混合物。每片优选含有约0.05mg至约5g活性成分，每个小袋或胶囊优选含有约0.05mg至约5g活性成分。例如，拟用于人体口服给药的制剂可能含有约0.5mg至约5g活性药物，与适量且方便的载体材料混合，其可能约占总组成的5％至95％。单位剂型通常含有约1mg至约2g活性成分，通常为25mg、50mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、800mg或1000mg。

本发明中适用于胃肠外给药的药物组合物可制备为活性化合物的水溶液或混悬液。可以包括适当的表面活性剂，例如羟丙基纤维素。也可以在甘油、液体聚乙二醇和其油混合物中制备分散体。此外，可以加入防腐剂以防止微生物的有害生长。

本发明中适用于注射使用的药物包括无菌水溶液或分散体。此外，该药物可以无菌粉末的形式，用于临时制备此类无菌注射液或分散体。在所有情况下，最终注射形式必须是无菌的，并且必须是有效的液体，以便于可注射性药物成分必须在生产和储存条件下保持稳定；因此，最好应保存，以防止微生物(如细菌和真菌)的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，例如含有水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、植物油及其合适的混合物。

本发明的药物可以是适合局部使用的形式，例如气雾剂、乳膏、软膏、洗剂、粉剂或类似物。此外，组合物可以是适当的形式用于透皮给药装置。可以使用本发明的中药组合物，通过常规处理方法制备这些处方。例如，通过混合亲水性材料和水，以及约5wt％至约10wt％的化合物，制备具有所需稠度的乳膏或软膏。

本发明的药物可以是适用于直肠给药的形式，其中载体是固体。最好将混合物制成单位剂量栓剂。合适的载体包括可可脂和其他本领域中常用的材料。栓剂可通过首先形成混合含有软化或熔化载体的组合物，随后在模具中冷却和塑形。

除上述载体成分外，上述药物制剂可能包括(如适用)一种或多种额外的载体成分，如稀释剂、缓冲液、矫味剂、粘合剂、表面活性剂、增稠剂、润滑剂、防腐剂(包括抗氧化剂)等。此外，可加入其它辅料，例如乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸等、着色剂和矫味剂等。使制剂与预期受体的血液等渗。还可以粉末或浓缩液形式制备含有本发明中药组合物的组分。

本发明的有益效果为：

(1)本发明制备的中药组合物具有优异的抗炎效果，显著抑制显著抑制细胞上清液中NO及炎性因子的释放。小鼠实验表明，本发明制备的中药组合物能一定程度改善急性肺炎引起的病理形态学异常，具体表现为炎性浸润减少，细胞壁间隔减小，组织形态规则，间质水肿程度降低等。同时，显著减少了斑马鱼巨噬细胞向损伤部位募集的数量，抑制了剪尾诱导的斑马鱼免疫细胞趋化作用。

(2)本发明的中药组合物可通过简单的提取方法、选择特定洗脱段制备得到，原料广泛易得。

附图说明

图1为本发明提取物实施例1的正、负离子模式质谱图；

图2为RAW 264.7细胞上清液中NO含量测定结果；

图3为RAW 264.7细胞上清液中IL-1β含量测定结果；

图4为RAW 264.7细胞上清液中IL-6含量测定结果；

图5为RAW 264.7细胞上清液中TNF-α含量测定结果；

图6为小鼠血清中IL-1β含量测定结果；

图7为小鼠血清中TNF-α含量测定结果；

图8为小鼠血清中IL-6含量测定结果；

图9为小鼠肺组织病理形态的变化结果；

图10为斑马鱼巨噬细胞向损伤部位募集数量结果。

图中，#代表与空白组相比，模型组具有显著性差异p＜0.05；*代表与空白组相比，实验组具有显著性差异p＜0.05。

具体实施方式

以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述内容仅仅是对本发明要求保护的范围的示例性说明，本领域技术人员可以根据所公开的内容对本发明作出多种改变和修饰，而其也应当属于本发明要求保护的范围之中。

下面以具体实施例的方式对本发明作进一步的说明。本发明实施例中所使用的各种化学试剂如无特殊说明均通过常规商业途径获得。下文中所述含量均为质量含量。

下述实施例中，牛蒡子来自安徽太和(190915)、射干来自河北安国(2005011)、桔梗来自安徽毫州(190601)、白芍来自内蒙古赤峰(2004082)、紫苏叶来自安徽太和(2001032)、金银花来自河北安国(20200701)、焦山楂来自山东临沂(200301)、黄芪来自河北安国(2004065)、虎杖来自安徽太和(2003149)、甘草来自甘肃定西(200601)、浙贝来自浙江金华(20200415)、菊花来自安徽毫州(191101)、红茶来自安徽毫州。

实施例1中药提取物的制备

(1)将牛蒡子10份、射干10份、桔梗10份、白芍10份、紫苏叶15份、金银花10份、焦山楂8份、黄芪10份、虎杖10份、甘草8份、浙贝15份、菊花5份、红茶60份按照以下方法制备成混合物：对药材进行称重、混合，4800r/min粉碎60分钟，过筛成最粗粉，但混有能通过四号筛不超过40％的粗粉。过筛后通过槽型混合机混合30分钟进行总混，60Co辐照灭菌。称取药材粉末，加入十倍量超纯水(称重并记录)；回流提取1小时，冷却后称重补足失重。4000rpm离心10分钟，取上清得到供试母液。

(2)将步骤(1)所得混合物上Agilent ZORBAX SB-C18(21×250mm，7μm)柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，洗脱条件为：0min-5％乙腈、15min-15％乙腈、30min-20％乙腈、45min-30％乙腈、55min-100％乙腈、70min-100％乙腈；

(3)取45-60min洗脱段流份，减压浓缩至近干，挥去乙腈得所述中药组合物。

实施例2中药提取物的制备

和实施例1不同的是，步骤(1)中，混合物处方为：牛蒡子10份、射干10份、桔梗10份、白芍10份、紫苏叶10份、金银花10份、焦山楂8份、黄芪10份、虎杖10份、甘草10份、浙贝15份、菊花10份、红茶60份。其余皆相同。

对比例1中药提取物的制备

和实施例1不同的是，步骤(3)中，取0-15min洗脱段流份，减压浓缩至近干，挥去乙腈得所述中药组合物。其余皆相同。

对比例2中药提取的制备

和实施例1不同的是，步骤(3)中，取15-30min洗脱段流份，减压浓缩至近干，挥去乙腈得所述中药组合物。其余皆相同。

对比例3中药提取的制备

和实施例1不同的是，步骤(3)中，取30-45min洗脱段流份，减压浓缩至近干，挥去乙腈得所述中药组合物。其余皆相同。

对比例4中药组合物的制备

和实施例1不同的是，取步骤(1)中制备的混合物。

检测例1成分测定

对实施例1制备的中药组合物进行质谱检测分析化学组成：

结果如下：

检测例2抗炎效果测定

2.1

LPS是巨噬细胞炎症反应的经典模型。RAW 264.7细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的Dulbeco改良Eagle培养基(DMEM)中培养。将细胞在37℃和5％CO2下孵育。将RAW 264.7细胞以2×10

如图2-5所示，与未刺激的细胞相比，LPS诱导显着提高了细胞上清液中NO、IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌。而实施例1、实施例2与对比例4给药可以显著抑制细胞上清液中NO及炎性因子的释放，且实施例1显示出最强的抑制效果。

2.2

将64只雄性C57BL/6小鼠随机分成8组，每组8只，包括对照组、模型组、实施例1给药组、实施例2给药组、对比例1给药组、对比例2给药组、对比例3给药组和对比例4给药组。实验小鼠进行急性炎症造模前8天，各给药组小鼠分别按600mg/kg剂量灌胃预给药一周，每日给药一次，给药剂量为10mL/kg。同时，对照组、模型组小鼠均按10mL/kg给药量于造模前灌胃生理盐水。末次给药2小时后腹腔注射造模剂0.5mg/mL脂多糖(LPS)溶液诱导小鼠急性炎症，注射剂量为10mL/kg。造模后观察小鼠生存状态，6小时后对实验小鼠进行取材。

如图6-8所示，与对照组相比，模型组小鼠血清中常见炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α水品显著上升，表明LPS可以成功诱导小鼠系统性炎症。而实施例1、实施例2与对比例4给药可以显著抑制血清中炎性因子的释放，且实施例1显示出最强的抑制效果。此外，H&E染色观察各给药组对小鼠肺组织病理形态的变化，如图9所示，对照组小鼠肺组织及细胞结构正常，在显微镜下观察肺组织未见损伤，细胞间质无水肿及炎性浸润，细胞外形清晰，肺泡结构形态正常完整。然而，模型组小鼠肺组织和细胞造成了明显的损伤，肺泡壁间隔增厚，且有大量的炎性细胞浸润，淋巴细胞增多。与模型组相比，实施例1预给药均能一定程度改善急性肺炎引起的病理形态学异常，具体表现为炎性浸润减少，细胞壁间隔减小，组织形态规则，间质水肿程度降低等。该结果显示，实施例1可以有效保护小鼠因急性炎症造成的肺组织损伤。

2.3

Tg(mpeg1:EGFP)斑马鱼幼鱼在28℃恒温光照培养箱中培养至5dpf，将其置于荧光显微镜挑选带有绿色荧光蛋白的幼鱼，将挑选后带有荧光的幼鱼转移至12孔板，每孔放置20尾鱼，并设置空白对照组、模型组、实施例1给药组、实施例2给药组、对比例1给药组、对比例2给药组、对比例3给药组和对比例4给药组。每组斑马鱼置于同一孔中，除对照组外(CON)，所有斑马鱼尾部均用手术刀进行横切，诱导巨噬细胞向尾部聚集。造模后将药物配制于培养液中，实施例1、实施例2、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4分别配制浓度为100μg/mL。将各组斑马鱼置于孔中共孵育6小时。

Tg(mpeg1:EGFP)品系斑马鱼由mpeg1启动子驱动绿色荧光蛋白GFP的表达。mpeg1是编码巨噬细胞特异表达基因1(Macrophage expressed gene 1)，mpeg1启动子驱动的转基因在巨噬细胞中特异表达，用于特异性标记巨噬细胞。斑马鱼尾鳍切除后，活性氧(ROS)发出信号趋化巨噬细胞向损伤部位聚集，由于GFP荧光形态不固定且巨噬细胞堆积，难以进行有效地细胞计数，因此通过统计荧光强度作为指标体现巨噬细胞数量。在本实验中，模型组斑马鱼在剪尾后6小时巨噬细胞募集到损伤部位的数量显着增加，伤口部位荧光细胞的平均强度显著上升，如图10所示，而实施例1、实施例2与对比例4显著抑制了巨噬细胞向损伤部位的募集，且实施例1显示出最强的活性。这些结果表明，与模型组相比，实施例1显著减少了斑马鱼巨噬细胞向损伤部位募集的数量，抑制了剪尾诱导的斑马鱼免疫细胞趋化作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。