用于T细胞和肿瘤浸润淋巴细胞的扩增的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年1月19日提交的美国临时申请号63/139,305；2021年2月24日提交的美国临时申请号63/153,367；2021年7月27日提交的美国临时申请号63/226,114；2021年9月14日提交的美国临时申请号63/244,166的优先权，这些临时申请的全部内容特此通过引用并入用于所有目的。

背景技术

使用T细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的过继细胞疗法(ACT)正在成为一种用于治疗免疫缺陷患者或癌症患者的临床工具。由外周血单核细胞(PBMC)制备的T细胞或由肿瘤制备的TIL已在ACT中使用，并取得了不同程度的成功。通常，在输注到受试者中之前需要体外扩增细胞群体。常规扩增包括两步过程：称为快速扩增方案前(REP前)步骤的第一步和称为快速扩增方案(REP)步骤的第二步。REP前步骤要求分离的细胞在存在白细胞介素2(IL2)但不存在饲养细胞的情况下进行培养，而REP步骤通常需要饲养细胞(例如外周血单核细胞(PBMC))、高剂量IL2和任选地抗CD3抗体(OKT3)。虽然常规扩增适用于大多数T细胞或TIL，但经基因修饰的细胞可能需要修改的扩增过程，以便选择性地扩增经修饰的T细胞或TIL的群体。此外，当被施用给患者时，经扩增的T细胞或TIL通常同时接受用于在体内激活和扩增T细胞或TIL群体的IL2的施用。但是，IL2显示出剂量依赖性毒性，该剂量依赖性毒性可以在多个器官系统(最重要的是心脏、肺、肾脏和中枢神经系统)中表现出来。IL-2毒性最常见的表现是导致低血容量状态和血管外空间的液体积聚的毛细血管渗漏综合征。大量患者不能耐受辅助IL2治疗，并且因此必须被排除在TIL治疗之外。需要在该领域进行改进，以使ACT成为一种安全且更有效的治疗工具。

发明内容

本公开涉及用于体外扩增经修饰的T细胞或TIL的组合物和方法。在REP阶段中，可使用被工程化成表达共刺激分子(例如41BB配体(41BBL))和白细胞介素21(IL21)或白细胞介素7(IL7)的K562饲养细胞来扩增经修饰的T细胞或TIL，特别是在常规REP条件下不能很好地扩增的T细胞和TIL。因此，本文提供了包含经修饰的T细胞或TIL和经修饰的K562饲养细胞的培养物。K562饲养细胞任选地是无复制能力的，并且包含编码选自肿瘤坏死因子超家族(例如41BBL)的共刺激分子的第一外源性核酸序列和编码IL21或IL7的第二外源性核酸序列。T细胞或TIL是经修饰的T细胞或TIL。例如，培养物可包含被修饰成表达细胞因子(诸如IL15或膜结合IL15(mbIL15))、嵌合抗原受体(CAR)和/或T细胞受体(TCR)的T细胞或TIL。任选地，CAR、TCR或mbIL15中的一者或多者任选地可操作地连接到药物响应结构域(DRD)，并且K562饲养细胞任选地表达41BBL和IL21(例如，膜结合IL21)。

DRD是在与配体结合后可以调节有效载荷(如mbIL15)的丰度和/或活性的多肽。多个DRD(例如串联的)可以调节单个有效载荷。一个或多个DRD可操作地连接到mbIL15、CAR或TCR有效载荷，使得DRD与有效量的配体在适当条件下的相互作用导致有效载荷的生物活性或量的改变。

还提供了一种通过在经修饰的K562饲养细胞群体存在下培养经修饰的T细胞或TIL来扩增该经修饰的T细胞或TIL的方法，其中经修饰的K562饲养细胞包含编码选自肿瘤坏死因子超家族(例如41BBL)的共刺激分子的第一外源性核酸序列和编码IL21或IL7的第二外源性核酸序列。该方法允许在不存在外源性IL2的情况下进行REP阶段。用这种方法扩增的T细胞或TIL被修饰(被工程化)。例如，该方法可用于扩增被修饰成表达膜结合IL15的TIL，该IL15可操作地连接到DRD；或扩增被修饰成表达细胞因子、CAR和/或TCR的T细胞，该细胞因子、CAR和/或TCR中的任一者都可以可操作地连接到DRD。

在扩增经修饰的T细胞或TIL的方法中，经修饰的K562饲养细胞可以是无复制能力的，并且可以被工程化成表达IL21(例如，分泌的IL21或膜结合IL21)。此外，K562饲养细胞可以被工程化成表达41BBL。

本文还提供一种通过在经修饰的K562饲养细胞存在下培养被工程化成表达mbIL15的TIL来扩增该TIL的方法。被工程化成表达mbIL15的TIL在不存在外源性细胞因子(例如，外源性白细胞介素如IL2、IL7、IL15，或它们的变体)的情况下扩增。经修饰的K562饲养细胞可以是无复制能力的，被修饰成表达选自肿瘤坏死因子超家族(例如41BBL)的共刺激分子，以及/或者被修饰成表达IL21或IL7。任选地，在扩增TIL的方法中，K562饲养细胞被修饰成表达mbIL21。

提供了经扩增的T细胞或TIL群体。经修饰的T细胞或TIL的群体是在K562饲养细胞的存在下扩增的，该饲养细胞是无复制能力的，被修饰成表达选自肿瘤坏死因子超家族(例如41BBL)的共刺激分子，以及/或者被修饰成表达IL21(例如，mbIL21)或IL7(例如，mbIL7)。通过本文所述的方法扩增的经修饰的T细胞和TIL具有某些有利的性质。REP步骤中不存在IL2的优点是产生比在IL2存在下扩增的未工程化TIL或T细胞更少地分化或耗竭的TIL或T细胞。此外，根据本文所述的方法产生的TIL可以被施用给有需要的患者，而无需伴随IL2疗法，该IL2疗法对许多患者是有毒的并且也耗竭T细胞或TIL。例如，经扩增的经修饰的T细胞或TIL比未工程化细胞存活(持续存在)更久。与未经扩增的T细胞或TIL的对照群体中CD8+细胞和CD4+细胞的比例相比，经扩增的T细胞或TIL的群体具有更高比例的CD8+细胞和更低比例的CD4+细胞。因此，经扩增的T细胞或TIL的群体的CD4:CD8比率低于未经扩增的TIL或在同种异体PBMC上扩增的TIL或T细胞的对照群体的CD4:CD8比率。此外，与REP前T细胞或TIL中的T

本文提供了一种治疗受试者癌症的方法，其通过向受试者施用根据本文所述方法扩增的经修饰的T细胞或经修饰的TIL的扩增群体来实现。任选地，该T细胞或TIL是在K562饲养细胞的存在下扩增的，该饲养细胞是无复制能力的，被修饰成表达选自肿瘤坏死因子超家族(例如41BBL)的共刺激分子，以及/或者被修饰成表达IL21(例如，mbIL21)或IL7(例如，mbIL7)。扩增步骤任选地在不存在IL2的情况下进行。此外，可以将经扩增的细胞施用于受试者而无需施用外源性IL2。与免疫疗法伴随地或者在免疫疗法之后对癌症患者进行的IL2全身施用常常会对已经身体虚弱的患者造成毒性。许多患者在施用IL2后出现严重的、危及生命的副作用，包括低血压和毛细血管渗漏综合征引起的休克。已经尝试了具有低剂量伴随IL2的TIL疗法，但该免疫疗法不如IL2以更高剂量施用时有效。因此，根据本文所述的方法扩增的经修饰的T细胞或经修饰的TIL可用于被证明对患有癌症的受试者的毒性小于需要使用外源性IL2的当前治疗方案的治疗方案。根据本文教导的方法扩增并施用于受试者的T细胞或TIL可以被进一步工程化成使得T细胞被工程化为表达可操作地连接到一个或多个DRD的细胞因子(例如IL15)、CAR或TCR，或者使得TIL被工程化为表达可操作地连接到一个或多个DRD的mbIL15。

所鉴定的实施方案仅是示例性的并且因此是非限制性的。本发明的一个或多个非限制性实施方案的细节将在附图和以下说明中阐述。在考虑了本公开之后，本发明的其他实施方案对于本领域的普通技术人员来说应该是显而易见的。

附图简述

图1示出了新鲜肿瘤消化物和3周REP前TIL培养后CD45+细胞(左)和CD45+细胞内CD3+T细胞(右)的频率。

图2示出了在转导后第5天通过流式细胞术测量的IL15-293构建体在两个黑色素瘤TIL供体中的转导效率。

图3A-B示出了表达mbIL15的TIL的抗原和IL2非依赖性扩增和存活。图3A示出用组成型mbIL15或GFP转导并在存在或不存在6000IU/mL IL2的情况下在REP中扩增12天的TIL供体006细胞(TIL 006)。图3B示出了用组成型mbIL15(在不存在IL2的情况下在REP中扩增)或GFP(在存6000IU/mL IL2的情况下在REP中扩增)转导，并在存在和不存在6000IU/mL IL2的情况下在14天抗原非依赖性存活测定中进行计数的TIL 006。

图4示出快速扩增方案(REP)后的抗原非依赖性TIL扩增。REP后，将未工程化TIL和mbIL15工程化TIL(组成型或调节型mbIL15)与或不与外源性IL2或乙酰唑胺(ACZ)一起铺板，并且每3天收获新孔以评估细胞计数和表型。

图5示出了抗原依赖性环境中的TIL扩增。在快速扩增方案(REP)后，在存在和不存在外源性IL2、乙酰唑胺或媒介物(DMSO)的TIL：肿瘤共培养测定中，将未工程化TIL和经mbIL15工程化TIL与HLA匹配的丝裂霉素C处理的黑色素瘤细胞一起铺板，每3天收获孔以评估细胞计数和表型。

图6A-B示出快速扩增方案(REP)后TIL的肿瘤反应性。图6A示出TIL 006和TIL005，它们都用调节型mbIL15和未工程化对照转导，并与HLA匹配的丝裂霉素C处理的黑色素瘤细胞共培养24小时。通过MSD测定法测量上清液中的IFNγ。图6B示出共培养中TIL的细胞毒性，其由荧光素酶标记的HLA匹配的黑色素瘤系的发光损失来度量。

图7A-B示出输注到动物体内进行体内过继细胞疗法实验之前的TIL扩增和转导效率。图7A示出了用于体内过继细胞转移(ACT)的未工程化TIL和经mbIL15工程化TIL的TIL供体006的细胞扩增。图7B示出了快速扩增方案(REP)后的转导效率；评估未工程化TIL和经mbIL15工程化TIL的IL15和IL15RaFc表达作为转导效率的量度。

图8A-C示出了用于体内过继细胞疗法实验的TIL计数和IL15表达的分析。图8A示出了通过流式细胞术从外周血样中对过继转移的未工程化TIL和经mbIL15工程化TIL的计数。TIL在下颌下静脉血样中被鉴定为活的人CD3+鼠CD45-细胞。图8B和图8C示出ACT后14天或53天分离的脾和骨髓样品的TIL计数(hCD3+mCD45-)和IL15表达(IL15+IL15RaFc+)。

图9显示乙酰唑胺(ACZ)对冷冻保存的调节型mbIL15 TIL中IL15表达和信号传导的调节以剂量依赖性方式发生。将来自四名患者(患者1-4)的调节型mbIL15 TIL解冻并且在无ACZ培养基中静置24小时，然后在0.1、1、2.5、5、10、25、100μM ACZ中调节18小时。然后收集调节型mbIL15 TIL，并使用基于磷酸化流式细胞术的测定法分析该mbIL15 TIL的IL15表达和信号传导。图9A示出了作为CD3+细胞百分比的IL15+TIL的频率。图9B-9E示出了每个患者的结果：在这里，在IL15+上对细胞进一步门控，然后计算每个pSTAT5(空心正方形)和pS6(实心圆形)的几何平均荧光强度。示出的值是相对于媒介物对照设置的。N＝4个人类供体。

图10示出了患者1-4中pSTAT5和pS6的平均荧光强度(MFI)。图10A示出了pSTAT5的MFI。图10B示出了pS6的MFI。

图11显示组成型mbIL15表达和ACZ对调节型mbIL15 TIL的调节参与IL15信号传导通路。在这里，将来自患者1-3的未工程化TIL和调节型mbIL15 TIL解冻并且在无ACZ培养基中静置24小时，然后用IL2或ACZ调节18小时。然后收集细胞并使用基于磷酸化流式细胞术的测定法分析该细胞的IL15表达和信号传导。在活细胞上对未工程化TIL和调节型mbIL15TIL+媒介物进行门控，随后对单线态进行门控，随后对CD3+进行门控。在IL15+染色上进一步对组成型IL15 TIL和调节型mbIL15 TIL+ACZ条件进行门控。计算每个pSTAT5和pS6的几何平均荧光强度。N＝3个人类供体。

图12示出在不存在外源性细胞因子的情况下经调节型mbIL5修饰的TIL比未工程化TIL+IL2表现出更大的多功能性。将未工程化TIL和调节型mbIL15 TIL解冻并且在无ACZ培养基中静置24小时；接下来，用以下浓度的IL2：20、200、1000和6000IU/mL IL2，或媒介物处理未工程化TIL；并用以下浓度的ACZ：0.1、1、5、10、25、100μM ACZ，或媒介物处理调节型mbIL15 TIL。处理时间为18小时。在布雷菲尔丁A和莫能菌素存在下用PMA和离子霉素刺激细胞6小时。未经刺激的TIL用作对照(数据未示出)。刺激后，使用基于流式细胞术的测定法分析细胞中IL15和细胞内TNFα和IFNγ的表达。在活细胞上对TIL进行门控，随后对单线态进行门控，随后对CD3+进行门控，并且另外在IL15+上对调节型mbIL15 TIL进行门控。图12A示出了具有IL2的未工程化TIL，以及具有ACZ的调节型mbIL15 TIL的TNFα和IFNγ双阳性群体。图12B示出了调节型mbIL15 TIL培养物中的IL15表达。图12C示出了对选定IL2(200IU/mL)和ACZ(25μM)剂量的比较。

图13示出了患者来源的异种移植物(PDX)功效模型的结果。在快速扩增方案(REP)结束时，将未工程化TIL和调节型mbIL15 TIL(+/-乙酰唑胺(ACZ))过继转移到荷有人黑色素瘤PDX的小鼠中。评价平均肿瘤体积(+/-SEM)。图13A示出过继细胞转移(ACT)后几天给定治疗的平均肿瘤体积。图13B示出ACT后几天无TIL(左上)；未工程化TIL+IL2(右上)；调节型mbIL15 TIL+媒介物(左下)；和调节型mbIL15TIL+ACZ(右下)的肿瘤体积。在这里，调节型mbIL15 TIL+ACZ表现出与未工程化TIL+IL2相比显著优越的抗肿瘤功效(*p<0.05；Mann UWhitney)。

图14示出了SK-MEL-1异种移植癌症模型的结果。在快速扩增方案(REP)结束时，将未工程化TIL和调节型mbIL15 TIL(+/-乙酰唑胺(ACZ))过继转移到荷有SK-MEL-1肿瘤的小鼠中。评价平均肿瘤体积(+/-SEM)。图14A示出过继细胞转移(ACT)后几天给定治疗的平均肿瘤体积。图14B示出ACT后几天无TIL(左上)；未工程化TIL+IL2(右上)；调节型mbIL15 TIL+媒介物(左下)；和调节型mbIL15TIL+ACZ(右下)的肿瘤体积。在这里，调节型mbIL15 TIL+ACZ表现出与未工程化TIL+IL2相比显著优越的抗肿瘤功效(*p<0.05；Mann U Whitney)。

图15显示调节型mbIL15 TIL在体外实现了增强的MHC-I依赖性的针对黑色素瘤的细胞毒性。在这里，未工程化TIL和调节型mbIL15 TIL在快速扩增方案(REP)结束时被冷冻保存。将冷冻保存的TIL解冻并且在无细胞因子条件下静置过夜，并然后以1:1和5:1效应物与靶标(TIL:黑色素瘤)的比率与Cell Trace Violet标记的黑色素瘤细胞(SK-MEL-1)共培养。为了控制MHC-1依赖性细胞毒性，在测定前用80μg/mL HLA ABC MHC封闭性抗体预处理黑色素瘤细胞2小时。共培养3小时后，通过流式细胞术评价SK-MEL-1细胞的细胞内切割的半胱天冬酶3(一种不可逆地致力于细胞死亡的标记物)的表达。将定量切割的半胱天冬酶3针对单独靶细胞(自发或背景释放)作归一化。条形图示出当与来自6名个体患者的TIL共培养时切割的半胱天冬酶3在靶肿瘤细胞上的表达。

图16是显示当在存在IL21和41BBL介导的共刺激的情况下用K562饲养细胞产生mbIL15 TIL(组成型)时REP中发生最大TIL扩增的图。

图17是显示当用表达膜结合IL21和41BBL的汇集PBMC饲养细胞或K562饲养细胞产生未工程化TIL时，REP中发生最大TIL扩增的图。

图18显示，当用K562饲养细胞产生具有mbIL15(组成型)的TIL并使其接受IL21和41BBL介导的共刺激时，REP中发生最大IL15+TIL扩增。从左到右示出第8、11、15和18天的饲养细胞结果：PBMC饲养细胞、K562亲代饲养细胞、K562+41BBL、具有重组人IL21的K562+41BBL饲养细胞、K562+mbIL21饲养细胞、K562+41BBL+mbIL21饲养细胞。

图19是显示在用K562饲养细胞产生并接受IL21和41BBL介导的共刺激的mbIL15TIL(组成型)中通过REP过程富集IL15表达的图。

图20是显示在存在IL21和41BBL介导的共刺激的情况下用K562饲养细胞产生的经扩增的具有mbIL15的TIL在整个REP中具有降低的CD4:CD8比率的图。因此，与用汇集的PBMC饲养细胞、未经修饰的K562饲养细胞或在不存在IL21的情况下表达41BBL的K562饲养细胞产生的经扩增的具有mbIL15的TIL相比，在存在K562饲养细胞以及IL21和41BBL刺激的情况下扩增的具有mbIL15的TIL富集CD8+细胞毒性效应细胞。从左到右示出第8、11、15和18天的CD4:CD8比率：PBMC饲养细胞、K562亲代饲养细胞、K562+41BBL、具有重组人IL21的K562+41BBL饲养细胞、K562+mbIL21饲养细胞、K562+41BBL+mbIL21饲养细胞。

图21是显示与用PBMC饲养细胞或未经修饰的K562饲养细胞产生的mbIL15 TIL相比，用表达mbIL21和41BBL的K562喂养细胞产生的经扩增的mbIL15 TIL中TNFα+干扰素γ+细胞的百分比更高的图。TNFα+干扰素γ+TIL的较高百分比表明用表达mbIL21和41BBL的K562饲养细胞产生的经扩增的mbIL15 TIL中的多功能性增强。

图22是示出用PBMC饲养细胞、未经修饰的K562饲养细胞、仅表达mb41BBL的K562饲养细胞、仅表达mbIL21的K562饲养细胞、表达41BBL和mbIL21的K562饲养细胞以及在重组人IL21存在下表达41BBL的K562饲养细胞产生的mbIL15 TIL的10天存活测定结果的图。与用未经修饰或被修饰成独立地表达mbIL21或41BBL的PBMC饲养细胞或K562饲养细胞产生的mbIL15 TIL相比，用K562饲养细胞产生并接受IL21和41BBL介导的共刺激的经扩增的mbIL15TIL显示出改善的REP后抗原非依赖性存活。

图23示出了在PBMC饲养细胞、K562饲养细胞、K562+mbIL21饲养细胞、K562+41BBL饲养细胞、K562+41BBL+mbIL21饲养细胞，或K562+41BBL+rhIL21饲养细胞下扩展的未工程化TIL和mbIL15TIL中TCRVβ亚家族的相对比例。经扩增的mbIL15 TIL和未工程化TIL保持多样化的亚家族分布，无论饲养细胞或条件如何。

图24示出了如在未经扩增的TIL，以及用PBMC饲养细胞、K562亲代饲养细胞、K562+41BBL饲养细胞、具有重组人IL21的K562+41BBL饲养细胞、K562+mbIL21饲养细胞，和K562+41BBL+mbI L21饲养细胞产生的经扩增的TIL中从左到右在活CD3+细胞上经受门控的mbIL15 TIL的表面上的PD1的表达。PD1表达在未经扩增的mbIL15 TIL中最高，并且在存在41BBL和IL21介导的信号传导的情况下下mbIL15 TIL的扩增产生具有接近基线的PD1表达的TIL。

图25示出了将REP前TIL(如实施例1所述)与工程化mbIL15TIL(如实施例3所述)进行比较的表型。如实施例13所述，使用针对CD3、CD4、CD8和PD1的抗体通过流式细胞术对REP前和REP后TIL进行表型分析。如图25A所示，与来自相同TIL供体的相应REP前TIL相比，REP后mbIL15 TIL的CD8+T细胞频率更高，以及CD4+T细胞频率更低。在图25B中，REP后mbIL15TIL表达的PD1水平低于来自相同TIL供体的相应REP前TIL。图25C示出了在被鉴定为作为CD4+被门控并且进一步被分类为CD25和FoxP3双阳性细胞的CD3+T细胞的mbIL15 TIL中调节性T细胞群体的百分比。与工程化步骤之前的REP前TIL相比，mbIL15 TIL具有降低比例的调节性T细胞。

图26示出了如通过流式细胞术确定的保守的黑色素瘤相关抗原MART-1和gp100在A375黑色素瘤细胞系和患者来源的异种移植物(PDX)细胞(PDX163A，如实施例11中所述)上的表达。

图27示出了衍生自HLA与PDX 163A匹配的四个不同TIL供体的mbIL15 TIL中MART-1四聚体阳性TIL和gp100四聚体阳性TIL的百分比。四聚体阳性群体表明TIL含有通过HLA:A2:01基因座对相应的黑色素瘤相关抗原具有反应性的细胞中的一部分。如图30所描绘，在PDX功效研究中利用了用*表示的供体。

图28示出用于准确地预测对PDX有反应的TIL供体的TIL：肿瘤细胞共培养后的干扰素γ(IFNγ)产量。该体外测定表明，TIL供体006、39A和41A是响应于PDX产生最高量IFNγ的供体，这从而支持了它们作为供体来检查体内功效的候选资格，如实施例15所述。

图29是示出用表达可操作地连接到CA2 DRD和CA2配体ACZ的mbIL15的经扩增TIL处理的示例性黑色素瘤患者来源的异种移植物模型的示意图。

图30显示根据图29中所示的治疗范例的患者来源的异种移植物模型的治疗导致与用未工程化TIL和伴随IL2治疗进行的治疗相比优越的抗肿瘤功效。在快速扩增方案(REP)结束时，将未工程化TIL和调节型mbIL15 TIL(+/-乙酰唑胺(ACZ))过继转移到荷有人黑色素瘤PDX的小鼠中。评价平均肿瘤体积(+/-SEM)。

图31A-B示出表达可操作地连接到CA2 DRD的mbIL15的TIL显示出比未工程化TIL+IL2显著更多的肿瘤内浸润。图31A是对人CD3进行免疫组织化学染色的肿瘤切片的显微照片，其显示出用未工程化TIL和IL2处理的动物、在存在和不存在CA2配体ACZ的情况下用表达可操作地连接到CA2 DRD的mbIL15的TIL处理的动物中TIL的肿瘤内浸润。图31B是显示基质+肿瘤、仅基质和仅肿瘤中TIL数目的图。

具体实施方式

目前用于扩增TIL和T细胞的方法需要基于白细胞介素2(IL2)的TIL扩增(快速扩增方案前或REP前)和随后的快速扩增方案(REP)。在REP前阶段，TIL或T细胞与外源性IL2一起培养，并且在解剖的肿瘤组织块中存在肿瘤抗原。因此，REP前在不存在饲养细胞的情况下需要IL2。REP步骤通常需要添加饲养细胞以支持快速TIL或T细胞扩增。REP饲养细胞和TIL或T细胞刺激物通常是经辐照的外周血单核细胞(PBMC)和高剂量的IL2。然而，REP期间，IL2倾向于耗竭细胞，导致TIL或T细胞产物的效力降低。在使用当前方法的体外REP之后，将经扩增的TIL或T细胞与IL2一起施用于患者，IL2可以在TIL/T细胞施用之前、期间和/或之后给予，从而再次将细胞推向耗竭。目前用于TIL疗法的一般方案要求在TIL输注的同一天或第二天开始施用高剂量IL2。例如，高剂量IL2方案可以由以下组成：每8小时静脉推注一次直至耐受，最多14剂，休息9天，以及再重复14剂。其他IL2方案可由每28天重复一次持续最多四个周期的四天IL2施用周期或持续长达21天的聚乙二醇化IL2方案组成。

除了促进TIL或T细胞的耗竭外，高剂量的IL2可引起癌症患者的严重副作用，并且往往不能被那些需要ACT的患者所耐受。本发明组合物和方法提供了一种TIL或T细胞疗法，其任选地在TIL或T细胞施用之前、期间或之后不需要施用外源性细胞因子，诸如白细胞介素(如IL2)。换句话说，使用本发明方法，不需要伴随的利用TIL或T细胞输注的白细胞介素疗法。例如，受试者任选地不需要在TIL或T细胞输注之前，或者在TIL输注后5天、7天、10天、14天、21天或28天施用外源性IL2。类似地，本发明方法消除了输注经修饰的IL2或其他经修饰的细胞因子(诸如经修饰的IL7或IL15)的需要。例如，经修饰的白细胞介素可以是IL2、IL7或IL15的突变体或片段，该突变体或片段保留了IL2、IL7或IL15的一个或多个功能，但对某些受体(诸如可以促进CD4+T

如本文所用的扩增是指数目或量的增加。当本文在提及T细胞或TIL的群体或亚群体时使用术语扩增时，该术语是指REP之后的细胞群体。该群体的大小(即REP后的T细胞或TIL的数目)大于未经扩增的群体(即，REP前T细胞或TIL的数目或在导致细胞没有功能性扩增的不成功的REP之后T细胞或TIL的数目)。当术语扩增在提及细胞(诸如经扩增的T细胞或经扩增的TIL)时使用时，它是指已经历导致TIL群体的功能性扩增的REP(即具有饲养细胞和选定刺激因子的培养物)并且是该REP的产物或结果的T细胞或TIL。因此，如本文所用，经扩增的T细胞或TIL是在导致功能性扩增的REP下培养的T细胞或TIL(例如，经修饰的T细胞或经修饰的TIL)的后代。类似地，如本文中使用的未经扩增的T细胞或TIL是指尚未经历REP的T细胞或TIL。然而，此种未经扩增的T细胞或TIL可能已经经历了最初的IL2 REP前步骤或导致细胞没有功能性扩增的失败的REP。

如本文所用，术语扩增可以被定量地使用，例如扩增得更多、扩增得更少、更大的扩增、更少的扩增等。此类相对术语通常是指群体或亚群体中T细胞或TIL的数目相较于不同的群体或亚群体的更大或更小的增加倍数(例如，经修饰的T细胞或TIL的扩增相较于未经修饰的亚群体的扩增)。因此，例如，经修饰的T细胞或TIL的亚群体与未经修饰的T细胞或TIL相比的更大扩增意味着经修饰的T细胞或TIL相较于未经修饰的T细胞或TIL的更大的增加倍数，诸如1.5倍相较于1.25倍增加、2倍增加相较于1.5倍增加、5倍增加相较于2倍增加、10倍增加相较于5倍增加、40倍增加相较于10倍增加等。

使用K562细胞扩增经修饰的T细胞或肿瘤浸润淋巴细胞的方法

本文提供了一种在工程化饲养细胞存在下扩增经修饰的T细胞或TIL的方法。更具体地说，提供了一种用于在REP阶段期间在经修饰的K562饲养细胞存在下、任选地在不存在外源性细胞因子(例如，白细胞介素如IL2)的情况下扩增被工程化成表达细胞因子(例如，IL15)、CAR和/或TCR的T细胞或TIL的方法。

该工程化饲养细胞是K562饲养细胞，该饲养细胞可以被修饰成包含编码选自肿瘤坏死因子超家族的共刺激分子的第一外源性核酸序列和编码IL21或IL7的第二外源性核酸序列。从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的亲代K562饲养细胞可以通过用一种或多种异源多核苷酸转导进行修饰。在一些实施方案中，通过经由病毒或非病毒载体递送方法引入多肽来修饰饲养细胞。作为非限制性实例，包含一种或多种异源多核苷酸的载体可以通过诸如针、电穿孔、声致孔(sonoporation)、水穿孔的物理方法；诸如无机颗粒(例如磷酸钙、二氧化硅、金)的化学载剂和/或化学方法引入到TIL或T细胞中。在一些实施方案中，合成或天然可生物降解剂可用于递送诸如阳离子脂质、脂质纳米乳液、纳米颗粒、基于肽的载体或基于聚合物的载体。例如，可以通过用编码41BBL(CD137L)的核酸进行的病毒(例如，逆转录病毒或慢病毒)转导来对饲养细胞进行转导。可将经转导的饲养细胞用编码mbIL21的核酸序列，例如，用表达mbIL21的睡美人转座子进一步转导。例如，该转座子可以包含编码IL21的第一核酸序列和编码跨膜结构域的第二核酸序列。该跨膜结构域任选地包括IL21受体、MHC1跨膜结构域、CD8跨膜结构域、B7-1跨膜结构域、CD4跨膜结构域、CD28跨膜结构域、CTLA-4跨膜结构域、PD-1跨膜结构域或人IgG4跨膜结构域。IL21可以直接连接到跨膜结构域，或可以经由接头或铰链连接。因此，当核酸序列表达时，IL21直接或间接连接到跨膜结构域，该跨膜结构域将IL21拴连至经转导的K562细胞的膜。任选地，饲养细胞不被修饰成表达Fc-γ受体CD32。

许多接头序列(接头)是本领域已知的。接头包括但不限于GS接头、GSG接头和GGSG接头。这些接头是亚基的一次或多次重复。因此，GS接头是GS

铰链序列是促进连接组分之间的柔性的氨基酸的短序列。铰链序列可以是衍生自或获自任何合适的分子的任何合适的序列。铰链序列可以衍生自全部或部分免疫球蛋白(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)铰链区域，即落在免疫球蛋白的CH1和CH2结构域之间的序列(例如，IgG4 Fc铰链)，或1型膜蛋白的细胞外区域(诸如CD8αCD4、CD28和CD7)，该细胞外区域可以是野生型序列或其衍生物。一些铰链区域包含免疫球蛋白CH3结构域，或CH3结构域和CH2结构域二者。在一些实施方案中，铰链衍生自跨膜结构域。

在K562饲养细胞未被修饰成表达选自肿瘤坏死因子超家族的共刺激分子和/或IL21或IL7的情况下，则可以将外源性共刺激分子和/或白细胞介素加入到培养基中。然而，将饲养细胞修饰成表达这些分子可消除或减少在REP阶段期间添加外源性共刺激分子或白细胞介素的需要。

编码IL21或IL7或者编码41BBL或两者兼而有之的核酸序列可以包含信号序列或前导序列。例如，信号序列可以是GM-CSF信号肽(SEQ ID NO:33)。

在饲养细胞被用于本发明方法中之前，首先使它们变得无复制能力。处理饲养细胞的各种手段是本领域已知的。此类方法包括辐照(例如，用伽马射线)、丝裂霉素-C处理、电脉冲、温和化学固定(例如，用甲醛或戊二醛)或用自杀基因转导饲养细胞。在一些实施方案中，饲养细胞是人细胞。例如，辐照可以是例如由铯源或X射线源递送的25-300Gy。

值得注意的是，扩增经修饰的T细胞或TIL的方法可以在REP阶段期间在不存在外源性细胞因子(例如IL2)的情况下发生。根据本文描述的方法扩增的T细胞或TIL被修饰。例如，该T细胞或TIL可以被修饰成表达mbIL15、CAR或TCR。表达的细胞因子(例如mbIL15)、CAR或TCR可以可操作地连接到DRD。

根据本发明方法的扩增任选地导致在7至21天内扩增至少10倍，但可导致扩增大于40倍、大于75倍或大于100倍。例如，经修饰的T细胞或TIL在14天内扩增500-2000倍或其间的任何量。倍数扩增可以通过将REP结束时培养物中感兴趣细胞数目除以REP开始时放入培养物中的感兴趣细胞数目来计算。

细胞培养物

本文提供了培养物，该培养物包含经修饰的T细胞或TIL和经修饰的K562饲养细胞，其中K562饲养细胞包含编码选自肿瘤坏死因子超家族的共刺激分子的第一外源性核酸序列和编码IL21或IL7的第二外源性核酸序列。T细胞或TIL可以从受试者制备，并被工程化成表达细胞因子、CAR和/或TCR。例如，T细胞或TIL可以被工程化成表达可以可操作地连接到DRD的IL15(例如，mbIL15)。

培养物中经修饰的K562饲养细胞是无复制能力的，并且被工程化成表达41BBL和任选的IL21。任选地，经修饰的K562饲养细胞表达41BBL并且IL21存在于培养基中。任选地，经修饰的K562饲养细胞表达41BBL和mbIL21或分泌的IL21。IL21多肽(例如UniProtKB-A0A224B028_HUMAN))。在一个实施方案中，IL21包含对应于SEQ ID NO:35的氨基酸序列或与SEQ ID NO:35具有至少85％、90％、95％或99％同一性的多肽，其保留一个或多个IL21功能(例如，促进经修饰的T细胞或TIL的体外扩增)。任选地，IL21直接或间接结合到将IL21拴连至K562饲养细胞的膜的跨膜结构域。IL21任选地为SEQ ID NO:35。任选地，经修饰的K562饲养细胞表达41BBL(例如，SEQ ID NO:47)。示例性IL21-41BBL插入物如表3所示。核酸和氨基酸序列参见例如SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47。任选地，K562细胞不被修饰成表达Fc-γ受体CD32。

培养物还可以包含额外的组分，诸如用于允许经修饰的T细胞或TIL快速扩增的条件的限定培养基。任选地，不向培养物中添加外源性细胞因子。例如，培养物任选地不包含外源性IL2。任选地，饲养细胞与T细胞或TIL的初始比率为1:1至200:1或其间的任何比率。在一些实施方案中，饲养细胞与TIL的初始比率为5:1。然而，在REP步骤完成后，经扩增的T细胞或TIL的数目大大超过了饲养细胞的数目，特别是当使用无复制能力的饲养细胞时。

经修饰的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)

TIL包括T细胞、NK细胞、B细胞和NKT细胞，但是，至少在某些肿瘤类型中，主要包含T细胞(例如，为CD8+的细胞毒性T细胞和为CD4+的辅助T细胞)。本文描述的TIL被工程化成表达mbIL15。因此，经修饰的TIL包含编码IL15的外源性核酸序列、编码跨膜结构域的外源性核酸序列，以及任选的编码接头或铰链的外源性核酸序列。IL15通常不表达为膜结合分子，因此，为了表达mbIL15，IL15必须与跨膜结构域缔合。如本文所用的IL15是指IL15多肽(例如，UniProtKB-P40933(IL15_HUMAN))。在一个实施方案中，IL15有效载荷包含表2中提供的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)或与SEQ ID NO:12具有至少85％、90％、95％或99％同一性的多肽，其保留一个或多个IL15功能(例如，促进经修饰的TIL的体内扩增，促进T和NK细胞的细胞毒性)。

示例性跨膜结构域包括MHC1跨膜结构域、CD8跨膜结构域、B7-1(CD80)跨膜结构域、CD4跨膜结构域、CD28跨膜结构域、CTLA-4跨膜结构域、PD-1跨膜结构域、人IgG4跨膜结构域或IL15受体亚基(例如IL15αR)。IL15可以直接连接到跨膜结构域，或可以经由接头或铰链连接。

本文所述的经修饰的TIL还任选地包含编码细胞内(细胞质)尾部的外源性核酸序列。例如，细胞内尾部可以是例如B7-1(CD80)细胞内尾部。

本文所述的经修饰的TIL还任选地包含编码信号序列(前导序列)的外源性核酸序列。示例性前导序列包括MDMRVPAQLLGLLLLWL SGARC(SEQ ID NO:10)、MDWTWILFLVAAATRVHS(IgEss；SEQ ID NO:58)、MRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFS AGLPKTEA(天然IL15 LS；SEQ ID NO:59)、MGLVRRGARAGPR MPRGWTALCLLSLLPSGFMA(CD34：SEQ ID NO:60)。

此外，某些TIL还包含编码DRD的外源性核酸序列。IL15对T细胞和NK细胞增殖很重要，但持续暴露于高水平的IL15可能导致这些细胞在体内耗竭，这会降低表达IL15的TIL的功效。因此，在某些实施方案中，使DRD可操作地连接到mbIL15以在TIL免疫疗法期间提供IL15活性或丰度的调节。

药物响应结构域(DRD)是调节有效载荷的表达或活性水平的多肽。虽然被称为药物响应结构域，但DRD对其有响应的配体不一定是药物。更具体地说，DRD与配体相互作用，使得当DRD可操作性连接至有效载荷时，它赋予对有效载荷的特征(例如，活性或表达水平)的配体依赖性可逆调节。美国专利号9,487,787和10,137,180；美国公布号：2019/0192691、2020/0101142、2020/0172879、2021/0069248；以及美国专利申请号：17,251,635；和17/288,373(其中每一篇的内容特此通过引用整体并入本文)提供了根据本公开的DRD(及其配对配体)的实例。根据本公开的这些和其他示例DRD中的某些也提供在本专利说明书的其他地方中。DRD例如可以选自FKBP(SEQ ID NO:4)、ecDHFR(SEQ ID NO:1)、hDHFR(SEQ ID NO:2)、ER(SEQ ID NO:9)、PDE5全长(SEQ ID NO:6)、PDE5配体结合结构域(SEQ ID NO:5)和CA2(SEQ ID NO:7)，或前述中的任一者的维持DRD功能的部分，或与SEQ ID NO:1、2、4、5、6、7或9具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，或其DRD功能部分。例如，FKBP、ecDHFR、hDHFR、ER、PDE5和CA2的氨基酸序列中的一个或多个突变(包括截短、取代和缺失)可能有利于进一步使DRD不稳定。合适的DRD(其可被称为不稳定结构域或配体结合结构域)也是本领域已知的。例如，参见WO2018/161000；WO2018/231759；WO2019/241315；US8,173,792；US8,530,636；WO2018/237323；WO2017/181119；US2017/0114346；US2019/0300864；WO2017/156238；Miyazaki等人,J Am Chem Soc,134:3942(2012)；Banaszynski等人(2006)Cell 126:995-1004；Stankunas,K.等人(2003)Mol.Cell 12:1615-1624；Banaszynski等人(2008)Nat.Med.14:1123-1127；Iwamoto等人(2010)Chem.Biol.17:981-988；Armstrong等人(2007)Nat.Methods 4:1007-1009；Madeira da Silva等人(2009)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 106:7583-7588；Pruett-Miller等人(2009)PLoS Genet.5:e1000376；以及Feng等人(2015)Elife 4:e10606，其中每一篇的内容均特此通过引用整体并入。

无意受到理论的限制，DRD被认为是不稳定的多肽，该多肽在其相应的稳定配体(也称为配对配体或配体)不存在的情况下降解，但它的稳定性通过与稳定配体结合而得到挽救。由于该配体与DRD的结合是可逆的，因此后来该配体的去除会导致DRD展开，变得不稳定，并最终被泛素-蛋白酶体系统(“UPS”)标记为用于降解。因此，据信，当DRD可操作地连接到诸如mbIL15的有效载荷时，整个构建体(即DRD加IL15)本身就会被UPS变得不稳定和降解。然而，在配对配体的存在下，构建体得以稳定化并且mbIL15有效载荷仍然可用。进一步地，据信DRD稳定性的条件性性质允许从稳定的蛋白质快速且无干扰地切换到不稳定的UPS底物，并且可以促进有效载荷活性水平的调节或调控，和/或有效载荷活性水平的调控。

因为有效载荷(例如，mbIL15)的丰度与有效载荷的活性有关，所以丰度水平和活性水平或者丰度和活性在此被称为活性或活性水平，除非在上下文中另有明确说明或无意义。进一步地，丰度的测量值被用作活性水平的代替物(proxy)，并且可以在本文中用于反映活性水平。因此，在存在有效量配体的情况下有效载荷丰度与不存在配体的情况相比的变化任选地用作用于测量活性水平变化的代替物。因此，丰度水平和活性水平在整个本公开中可互换使用。

本文描述了许多DRD，但是本领域技术人员可以鉴定出另外的DRD。例如，可以使用文库筛选和结构引导工程化(structure-guided engineering)来鉴定DRD，以选择在不存在配体的情况下具有足够的不稳定性，而在存在配体的情况下具有足够的稳定性的最佳DRD变体。通过用突变DRD候选物转导细胞(例如Jurkat细胞)，可以使用随机诱变筛选产生变体文库。为了产生富集的文库，然后通过测试报告基因在一系列配体浓度下的表达来选择具有所需特征(低基础活性/表达和高动态范围)的细胞。然后产生单细胞克隆并对其进行表征以鉴定候选DRD。DRD能够影响其可操作地连接至的有效载荷的特征，例如丰度或活性水平。进一步地，一个或多个DRD与配体相互作用以提供对有效载荷的特征的配体依赖性可逆调节。

本文描述的DRD对配对配体有响应。任选地，DRD对作为小分子药物的配对配体(诸如FDA批准的小分子)有响应。然而，本领域技术人员可以选择DRD及其配对配体来满足系统的特定需求。本文所述的稳定配体及其用于特定DRD的用途的实例显示在表1和2012年3月33日提交的美国专利号9,487,787、2013年9月6日提交的美国专利号10,137,180、2018年6月12日提交的PCT申请号PCT/US 2018/037005、2019年6月12日提交的PCT申请号PCT/US2019/036654、2019年10月23日提交的PCT申请号PCT/US2019/057698、2020年3月6日提交的PCT申请号PCT/US2020/021596和2019年9月2日提交的美国申请号16/558,224中，所有前述申请的公开内容全部通过引用并入文中。

表1.DRD和示例性配体的列表

任选地，本公开的DRD可以衍生自人碳酸酐酶2(hCA2)，其是金属酶超家族碳酸酐酶的成员。本公开的DRD可以衍生自CA2的氨基酸1-260(Uniprot ID:P00918)(SEQ ID NO:7)。任选地，该DRD衍生自包含亲代CA2序列的氨基酸2-260的CA2(例如，氨基酸2-260)。这在本文中称为CA2 M1del突变(CA2；SEQ ID NO:55)。任选地，本公开的DRD包括人碳酸酐酶2的区域或整个人碳酸酐酶2，并且还包括相对于选自M1del、L156H和S56N的全长序列的一个或多个突变。任选地，DRD选自由SEQ ID NO:7、26、55、56和57组成的群组。

例如，经修饰的TIL可以包含核酸序列，该核酸序列编码位于IL15多肽组分的C端的跨膜结构域和位于该跨膜结构域的C端的细胞内尾部。

表2中显示了经修饰的TIL的构建体和构建体组分的非限制性实例。指定为OT-IL15-292的构建体包括来自N端的信号序列、IL15、(GS)

表2：构建体和构建体组分的实例

为了创建以足够的动态范围(即，对应于配体从零到最大饱和度的变化的可接受的活性范围)可操作地连接到DRD的膜拴连细胞因子(如IL15)，多肽任选地从N端起包括有效载荷(IL15)、接头、铰链、跨膜区、尾部和DRD。尾部和/或接头以及尾部和接头长度在不存在配体的情况下可能会影响活性，并且在一些实施方案中，特定的尾部和/或接头和长度被选择为最大化导通状态(例如，最大活性水平)，同时维持低基础活性水平和配体响应性。特定的铰链可以允许构象变化，并且从而在足够的动态范围内影响配体响应性。

如本文所述的表达mbIL15的经修饰的TIL具有许多优点。首先，经修饰的TIL可以在饲养细胞(诸如表达41BBL和IL21的K562饲养细胞)存在下在体外扩增。值得注意的是，在REP前阶段之后，经修饰的TIL可以在不存在外源性细胞因子的情况下在体外扩增，并且经扩增的TIL被激活并且可以在没有施用外源性细胞因子(如IL2)的情况下在体内进一步扩增。

包含多个经修饰的TIL的TIL群体可以包括已经历扩增(即，利用饲养细胞和刺激分子(例如IL12和4BB1)的REP)的TIL的亚群体。经扩增的TIL展现出许多优点。例如，已经历REP的经扩增的TIL能够在缺乏饲养细胞的培养物中存活。更具体地说，在不存在外源性细胞因子(例如，白细胞介素如IL2)的情况下，被工程化成表达mbIL15的TIL可以比未工程化细胞存活更长时间。被工程化成表达可操作地连接到DRD的mbIL15的TIL在存在配体但不存在外源性细胞因子的情况下比在不存在配体的情况下的未工程化TIL或调节型mbIL15TIL更好地存活。此外，与未经扩增的TIL的对照群体相比，经扩增的TIL群体显示出某些TIL的优先扩增以及因此更少或更多的TIL的亚型。如本文使用的未经扩增的TIL的对照群体是指与经扩增的TIL类似地被修饰但未经历REP的TIL。

经扩增的TIL群体例如与未经扩增的TIL的对照群体相比具有更高比例的CD8+细胞，更小比例的CD4+细胞和更低的CD4+:CD8+比率。CD8+TIL被认为是通过释放细胞毒性分子和细胞因子杀死癌细胞的关键参与者，并且肿瘤中CD8+TIL数目与CD4+TIL数目的比较(即CD4+：CD8+比率)已被发现与积极结果相关。

此外，在某些实施方案中，经扩增的TIL群体中的CD4 T

经扩增的TIL群体也显示出更少的经耗竭TIL和更多的多功能TIL。与未经扩增的TIL对照群体中PD1+细胞的比例相比，经扩增的TIL群体具有更小比例的PD1+细胞。此外，与未经扩增的TIL对照群体中产生肿瘤坏死因子α(TNFα)和干扰素γ(IFNγ)的TIL比例相比，经扩增的TIL群体具有更大比例的产生TNFα和IFNγ二者的细胞。

本文提供了TIL的混合群体，其包含未经修饰的TIL的亚群体和包含任选地可操作地连接到DRD的mbIL15的经修饰的TIL的亚群体。经修饰的TIL的亚群体在K562饲养细胞、41BBL和IL21的存在下扩增。在K562饲养细胞、41BBL和IL21的存在下，经修饰的TIL的亚群体比未工程化TIL的亚群体扩增得更多。经修饰的TIL的这种优先扩增发生在REP期间不存在外源性IL2的情况下。

经修饰的T细胞

可以根据本文描述的方法扩增的经修饰的T细胞包括例如激活的T细胞或被工程化成表达细胞因子、CAR或TCR的T细胞。激活方法和工程化T细胞的方法在本领域是已知的。根据上文针对TIL所述的方法，可以将T细胞工程化成表达细胞因子，例如IL15，或者更具体地，mbIL15。T细胞可以被工程化成表达CAR或TCR，以及任选的细胞因子(如膜结合细胞因子)。

包含细胞外靶向结构域(例如，识别特定肿瘤抗原或其他肿瘤细胞表面分子的scFv)、跨膜结构域/区域，和细胞内信号传导/激活结构域(例如，CD3ζ的信号区，和/或一个或多个共刺激信号传导结构域，诸如来自CD28、4-1BB(CD137)和OX-40(CD134)的那些)的CAR可以由经修饰的T细胞表达。

制备经修饰的TIL的方法

可以使用本领域已知的方法从肿瘤或其活检物制备TIL。例如，使肿瘤碎片(例如，1-5mm大小)经受酶消化(例如，胶原酶(例如，0.5-5mg/mL)、DNA酶、透明质酸酶)或机械解离。将经解离的细胞在细胞培养基中在与其他细胞相比有利于TIL增殖的条件下(即在IL2存在的情况下)孵育。此阶段是REP前阶段。在REP前阶段，可将细胞在2000-8000IU/mL IL2(例如6000IU/ml)存在下以及任选地在灭活的人AB血清存在下培养(例如，3至28天)。在一些实施方案中，将细胞培养一段时间，通常为3至28天。在一些实施方案中，将此REP前细胞群体培养7至21天。

可以冷冻保存REP前TIL或T细胞。冷冻保存的细胞在激活前被解冻和静置。可以使用例如板结合的OKT3、可溶性OKT3、共刺激抗体(例如针对CD28或41BB的抗体)+OKT3、结合到珠粒的抗CD3和抗CD28抗体或者片段等来激活细胞。激活步骤可以是1-2天或更长时间。激活后，然后通过用具有编码IL15的第一核酸序列和编码跨膜结构域的第二核酸序列的载体转导一个或多个TIL，将该一个或多个TIL工程化成表达膜结合白细胞介素15(mbIL15)。任选地，载体还包括一个或多个编码信号肽、接头、铰链、细胞内尾部或DRD的核酸序列。载体可以以许多方式被配置来获得所需的mbIL15。示例性核酸构建体包含分别具有和不具有DRD的编码OT-IL15-293和OT-IL15-292的核酸序列。因此，载体任选地包含SEQ ID NO:29、31、53或54。载体包含或编码另外的元件，诸如启动子序列和其他调节性元件(增强子、翻译控制元件(例如IRES)和控制半衰期的元件)。载体任选地包含或可以包含编码控制翻译的元件(例如，IRES、WPRE等)的核酸序列。

载体可以选自病毒载体、质粒、粘粒和人工染色体。例如，载体可以是病毒载体，诸如慢病毒载体或逆转录病毒载体。例如，病毒载体可以是包含编码IL15的核酸序列和编码跨膜结构域的核酸序列的狒狒内源性逆转录病毒包膜(BaEV)假型慢病毒载体或长臂猿白血病病毒(GALV)包膜假型γ逆转录病毒载体。表达后，IL15与跨膜结构域缔合，并且被跨膜结构域结合到膜上。

载体任选地通过非病毒方法(诸如针头、电穿孔、声致孔、水穿孔、化学载剂(诸如无机颗粒(例如磷酸钙、二氧化硅、金))和/或化学方法)转移到细胞中。在一些实施方案中，合成或天然可生物降解剂被用于递送诸如阳离子脂质、脂质纳米乳液、纳米颗粒、基于肽的载体或基于聚合物的载体。

编码IL15的核酸序列可以是基因组核酸或非基因组核酸。也就是说，用于递送编码IL15的核酸的递送系统可以被整合到TIL的基因组中，或者可以是非整合的(即游离体)或使用RNA载体作为RNA转移到细胞质中。

包含mbIL15的TIL在REP阶段(例如，5-21天或其间的任何量，包括7-14天)在不存在IL2的情况下扩增。如实施例中进一步描述的，被修饰为表达IL15的TIL在K562饲养细胞以及41BBL和IL21存在下扩增。在某些实施方案中，K562饲养细胞被工程化成表达41BBL和IL21(其可以是膜结合IL21(mbIL21))，从而在REP期间减少或消除对外源性细胞因子如IL2、IL7或IL15的需求。在一些实施方案中，经修饰的TIL与被修饰成表达mbIL21和41BBL的K562细胞以1:1至100:1、1:1至50:1、1:1至20:1、1:1至10:1，或2:1至5:1(TIL:饲养细胞)的比率一起培养。

在饲养细胞被用于本发明方法中之前，首先使它们变得无复制能力。处理饲养细胞的各种手段是本领域已知的。此类方法包括辐照(例如，用伽马或X射线)、丝裂霉素-C处理、电脉冲、温和化学固定(例如，用甲醛或戊二醛)或用自杀基因转导饲养细胞。在一些实施方案中，饲养细胞是人细胞。例如，辐照可以是例如由铯源或X射线源递送的25-100Gy。

在饲养细胞上扩增后，任选地从饲养细胞中分离出TIL。如本文所用，术语分离并不意味着暗示TIL完全不含其他组分，诸如饲养细胞，只是暗示TIL相对不含饲养细胞。

本文提供了一种制备包含mbIL15的TIL、TIL的群体或TIL的亚群体的方法。还提供了编码mbIL15的核酸序列、包含编码mbIL15的核酸序列的载体、被修饰成表达41BBL和IL21的无复制能力的K562饲养细胞，以及通过本文所述方法制备的TIL。

本文提供了一种制备包含mbIL15的TIL、TIL的群体或TIL的亚群体的方法。还提供了编码mbIL15的核酸序列、包含编码mbIL15的核酸序列的载体、被修饰成表达41BBL和IL21的无复制能力的K562饲养细胞，以及通过本文所述方法制备的TIL。

制备经修饰的T细胞的方法

原代人T细胞可以衍生自人外周血单核细胞(PBMC)、骨髓或脐带，并且可以在用G-CSF刺激后收集。使用如上所述的任何递送技术将设计用于顺反子或多顺反子表达的核酸构建体引入到T细胞中。任选地，用细胞因子(诸如膜结合细胞因子)或细胞因子和受体(例如CAR或TCR)二者转导T细胞。例如，可以用一个或多个编码IL15(其表达时连接至跨膜结构域)；CAR；或TCR的核酸转导T细胞。例如，可以用编码mbIL15的第一载体和编码CAR的一种或多种组分的第二载体转导T细胞，该组分为诸如细胞外靶向结构域(例如，识别特定肿瘤抗原或其他肿瘤细胞表面分子的scFv)、跨膜结构域/区域和细胞内信号传导/激活结构域(例如，CD3ζ的信号区，和/或一个或多个共刺激信号传导结构域，诸如来自CD28、4-1BB(CD137)和OX-40(CD134)的那些)。任选地，用编码CAR的未被第二载体编码的任何组分的第三载体转导T细胞。

药物组合物

本文提供了适用于ACT的药物组合物。该药物组合物可包含经修饰的T细胞或TIL，诸如经扩增的T细胞或TIL，以及药学上可接受的载剂。该药物组合物中经修饰的T细胞或TIL的群体任选地是混合群体，该混合群体包含经修饰的T细胞(例如，CAR+T细胞)或经修饰的TIL(例如，被工程化成表达mbIL15的TIL)和未经修饰的T细胞或TIL(即，未工程化T细胞或TIL)的亚群体。

术语载剂意指这样的化合物、组合物、物质或结构，该化合物、组合物、物质或结构在与化合物或细胞组合时有助于或促进该化合物或细胞的制备、储存、施用、递送、有效性、选择性或任何其他特征以达到该化合物或细胞的预期用途或目的。例如，载剂可以被选择为最小化TIL的任何降解，并最小化受试者中的任何不良副作用。此类药学上可接受的载剂包括无菌生物相容性药物载剂，包括但不限于盐水、缓冲盐水、人工脑脊髓液、右旋糖和水。所谓药学上可接受的意指在生物学上或其他方面不是不期望的材料，该材料可连同T细胞或TIL群体一起施用于个体，而不会引起不可接受的生物学效应或与T细胞或TIL以有害方式相互作用。

任选地，该药物组合物还包含冷冻保护剂(冷冻保存剂)。如果TIL被冷冻以备将来使用，此种冷冻保护剂可起到防止不可接受的细胞裂解或损伤的作用。冷冻保护剂是本领域已知的。此种冷冻保护剂可以选自甘油、乙二醇、丙二醇或二甲基亚砜(DMSO)。

本文所述的药物组合物任选地还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂(例如，人血清白蛋白或聚合物材料(例如，PEG))。

本公开的组合物可以以任何适合于递送的方式配制。例如，T细胞或TIL可以以纳米颗粒、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)微球、类脂质(lipidoid)、脂质复合物、脂质体、聚合物、碳水化合物(包括单糖)、阳离子脂质或它们的组合施用。

尽管本文提供的药物组合物的描述主要是针对适合施用于人类的药物组合物，但本领域技术人员应当理解，此类组合物通常适用于施用于任何其他动物，例如，非人类哺乳动物。考虑施用该药物组合物的受试者包括但不限于农业动物，诸如牛、马、鸡和猪；家畜，如猫、狗；或研究动物，如小鼠、大鼠、兔子、狗和非人类灵长类动物。

治疗方法

本文提供了通过向受试者(即受体受试者)施用已根据本文描述的方法扩增的经修饰的T细胞或TIL群体来治疗受试者中的癌症的方法。因此，随后将在K562细胞(例如被修饰成表达TNF超家族的共刺激分子(例如，41BBL)，和/或IL21或IL7的K562细胞)存在下扩增的经修饰的T细胞或TIL任选地以药物组合物的形式施用给该患有癌症的受试者。该癌症可以是，但不限于，黑色素瘤、葡萄膜(眼)黑色素瘤、宫颈癌、卵巢癌、头颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、膀胱癌、乳腺癌、肾细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、中枢神经系统癌、胃肠道癌(例如，结直肠癌)。

迄今为止，T细胞或TIL疗法常常需要与T细胞或TIL的施用同时以及在T细胞或TIL的施用之后进行的高剂量IL2的伴随施用。但与利用T细胞或TIL的常规治疗不同，本发明方法不需要施用IL2。相反，经修饰的TIL或T细胞通过表达mbIL15而提供了足够的细胞因子来源来刺激TIL的增殖和活性，并且在不存在IL2的情况下在经修饰的K562细胞上的扩增可以允许该经修饰的细胞的优先扩增。

该治疗癌症的方法还可以包括如本文所述从受试者中分离一个或多个T细胞或从肿瘤中分离TIL，以及将表达mbIL15和任选的CAR或TCR的核酸序列引入到该一个或多个T细胞或TIL中。T细胞或TIL可以衍生自受体受试者(自体来源)。TIL衍生自的肿瘤可以是原发性肿瘤或转移性肿瘤。因此，如果来自活检物或部分原发性肿瘤的TIL被冷冻保存，则它们可以在以后被解冻并且被用于治疗所产生的转移性肿瘤或不同的原发性肿瘤。可替代地，T细胞或TIL可以衍生自供体受试者(同种异体来源)，其中该供体受试者不是受体受试者。衍生自待治疗的同一肿瘤的TIL所具有的优点是具有与该肿瘤相当的新抗原和异质性。衍生自同一受试者的不同肿瘤或衍生自不同供体的肿瘤的TIL可以通过本领域已知的方法(诸如TCR的四聚体染色)被选择用于与受体受试者的肿瘤中存在的癌症抗原反应。如果T细胞或TIL衍生自供体受试者，其中该供体受试者不是受体受试者，则该方法还可以包括选择与受体受试者HLA匹配的供体受试者，从而减少移植物抗宿主响应。

T细胞可以从PBMC中分离，而TIL可以从作为初始步骤的肿瘤样品手术切除、组织活检、穿刺活检或其它手段获得。然后如本文所述对T细胞或TIL进行转导或修饰，然后对该T细胞或TIL在体外扩增以提供更大的经扩增的细胞群体以用于ACT。

在K562细胞中扩增的经修饰的T细胞或TIL的施用可以包括从约1000个细胞/注射到多达约100亿个细胞/注射的量，诸如2×10

本公开的经修饰的T细胞或TIL可以通过任何合适的途径施用。在一些实施方案中，该细胞通过静脉输注、动脉内输注、腹膜内、鞘内、淋巴管内施用。任选地，经修饰的T细胞或TIL被局部施用，例如，直接施用到肿瘤或供应肿瘤的血管中。

经修饰的T细胞或TIL可以以单剂量施用，但在某些情况下可以以多剂量施用。

治疗方法还可以包括在施用经修饰的T细胞或TIL之前对受体受试者进行淋巴细胞耗竭(lymphodepletion)。对人类和小鼠黑色素瘤模型的研究表明，淋巴细胞耗竭会耗竭阴性调节性细胞，包括调节性T(T

淋巴细胞耗竭剂的一个实例是氟达拉滨(例如，剂量为0.5μg/ml-10μg/ml)。在一些实施方案中，氟达拉滨在经修饰的T细胞或TIL施用之前以每天1μg/ml的浓度施用1-7天。在一些实施方案中，氟达拉滨以10mg/kg/天、15mg/kg/天、20mg/kg/天、25mg/kg/天、30mg/kg/天、35mg/kg/天、40mg/kg/天或45mg/kg/天的剂量施用。在一些实施方案中，氟达拉滨治疗以35mg/kg/天施用2-7天。在一些实施方案中，氟达拉滨治疗以35mg/kg/天施用4-5天。在一些实施方案中，氟达拉滨治疗以25mg/kg/天施用4-5天。

在一些实施方案中，施用环磷酰胺以提供浓度为0.5μg/mL-10μg/mL的呈其活性形式的马磷酰胺。在一些实施方案中，在TIL施用前，施用环磷酰胺以提供每天1μg/mL浓度的马磷酰胺，持续1-7天。在一些实施方案中，环磷酰胺以50mg/m

在某些实施方案中，淋巴细胞耗竭包括施用淋巴细胞耗竭剂的组合，例如60mg/kg的环磷酰胺2天和25mg/m

如果T细胞或TIL表达的IL15、CAR或TCR可操作地连接到DRD，则该方法还可以包括向受体受试者施用有效地增加T细胞或TIL的有效载荷活性的量的与DRD结合的第二剂。可以使用为受试者提供选定量的有效载荷活性的给药方案施用配体。配体可以被递送以在受试者中实现连续或间歇的有效载荷活性。对受试者给药的频率和持续时间的确定由本领域技术人员通过考虑例如以下来确定：当期望更多的有效载荷活性时，采用更高的配体剂量或更长的配体施用持续时间，以及当期望较少的活性时，减少或消除配体施用。配体施用的剂量和持续时间以及有效载荷的所产生的活性还被选择为避免受试者中不可接受的副作用或毒性。因此，受试者被施用有效量的配体以达到有效量的有效载荷。术语有效量被定义为产生期望生理响应所需的任何量。用于施用配体的有效量和时间表可以由本领域技术人员根据所产生的有效载荷的量、有效载荷的活性或根据有效载荷活性的效果的一个或多个迹象凭经验确定。配体的施用范围为从零到饱和剂量，并且所产生的有效载荷活性范围为从基础水平到最大水平，任选地具有足够的动态范围，该动态范围允许配体量的微小变化导致有效载荷量或有效载荷活性的微小变化。配体施用的剂量或频率以及所产生的有效载荷的量和活性不应大到引起不可接受的不良副作用，并且将会随着患者的年龄、状况、性别、正在治疗的癌症类型、癌症的程度以及治疗方案中是否包括其他治疗剂而变化。对于给定类别的配体的适当剂量可见于文献中的指南。

在一些实施方案中，具有可调节有效载荷(即可操作地连接到DR D的有效载荷)的经修饰的T细胞或TIL可以与一种或多种免疫检查点调节剂组合施用。检查点抑制剂包括靶向PD-1或抑制PD-1与PD-L1结合的抗体，包括但不限于纳武单抗(BMS-936558，Bristol-Myer s Squibb；

任选地监测受试者的治疗结果。因此，例如，可以检测样品中恶性细胞的数目、样品中循环的肿瘤DNA，或成像时实体肿瘤的大小。如果达到期望的终点(例如，显示癌症的成功治疗)，则可以减少或停用配体以减少或消除有效载荷。同样，如果受试者因有效载荷发生细胞因子风暴、过敏反应或其他不良影响，则可以减少或停用配体。

定义

术语约和近似，当用于指代可测量值诸如量、浓度、剂量、时间、温度、活性、水平、数目、频率、百分比、尺寸、大小、重量、位置、长度等时，意在解释由于实验误差引起的变化，该变化可涵盖具体指定的量、浓度、剂量、时间、温度、活性、水平、数目、频率、百分比、尺寸、大小、重量、位置、长度等的±15％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化。所有测量值或数值都被隐式地理解为被单词约修饰，即使该测量值或数值未被单词约明确地修饰。在术语约和近似与参考多肽内区域的位所或位置结合使用的情况下，这些术语涵盖±最多20个氨基酸残基、±最多15个氨基酸残基、±最多10个氨基酸残基、±最多5个氨基酸残基、±最多4个氨基酸残基、±最多3个氨基酸残基、±最多2个氨基酸残基，或甚至±1个氨基酸残基的变化。

如本文所用，可操作地连接意指，在存在配对配体的情况下，DRD直接或间接地连接至有效载荷，以便改变有效载荷的可测量特征(例如，相较于在不存在配对配体的情况下的活性水平，改变有效载荷的活性水平)。在一些实施方案中，在存在有效量配体的情况下测量的有效载荷的量和/或活性的水平与在不存在配体的情况下测量的表达或活性的水平相比增加。配体的有效量意指观察到有效载荷的量或活性的测量值增加所需的配体的量。在一些实施方案中，有效量不会大到产生不可接受的毒性或脱靶效应。任选地，可测量的特征是治疗结果、样品中有效载荷的量，或有效载荷的生物活性水平(测量有效载荷的量可以作为该生物活性水平的代替物)。

除非上下文中另有明确说明或无意义，否则无论在何处使用连接或结合等短语，都应理解为遵循直接或间接短语。因此，对连接到有效载荷、结合至有效载荷或与有效载荷缔合的DRD的提及意味着在每种情况下，DRD直接或间接连接到有效载荷。

本文所用，术语TIL或T细胞的存活与TIL或T细胞的持续存在是可互换使用的。存活是根据TIL或T细胞的持续存在的作用确定的。

如本文所用，扩增用于指在功能性REP期间发生的细胞数目的功能性增加。功能性REP导致为治疗用途提供足够的细胞数目的经扩增的细胞群体。另一方面，不成功的REP将导致细胞数目没有功能性倍数增加。未经扩增的细胞包括REP前细胞和与经扩增的细胞群体相比未经历REP中的功能性扩增的细胞。非功能性扩增包括经扩增的细胞群体的10％或更少的扩增。例如，可以将在给定时间段内扩增100倍的TIL群体与仅扩增10倍或更少的未经扩增的群体进行比较。因此，如本文所用，经扩增的细胞或经扩增的细胞群体是指经历了功能性REP的细胞或细胞群体。未经扩增的细胞或细胞群体是指在REP前或者在未能导致细胞群体的功能性扩增的REP之后的细胞或细胞群体。例如，某些经修饰的TIL将在改良K562饲养细胞上扩增，但在PBMC上的倍数扩增将小于在改良K562饲养细胞上的倍数扩增的10％。因此，未经扩增的TIL可以是REP前的经修饰的TIL，或在PBMC上REP后的经修饰的TIL。

术语同一性如本领域所知，是指两个或多个序列之间的关系，如通过比较这些序列来确定的。在本领域，同一性还意指序列之间的序列相关性程度，如通过两个或多个残基(氨基酸或核酸)的串之间的匹配数目所确定。同一性度量两个或更多个序列之间同一的匹配的百分比，这些序列具有由特定数学模型或计算机程序(即算法)解决的空位比对(如果有的话)。相关序列的同一性可以通过已知方法轻易计算。这些方法包括但不限于以下中描述的那些：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,编辑,Oxford UniversityPress,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,编辑,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,第1部分,Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.,编辑,Humana Press,New Jersey,1994；SequenceAnalysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；SequenceAnalysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,编辑,M.Stockton Press,New York,1991；以及Carillo等人,SIAM J.Applied Math.48,1073(1988)。通常，本公开的特定多核苷酸或多肽的变体将与该特定参考多核苷酸或多肽具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％但小于100％序列同一性，如通过本文描述和本领域技术人员已知的序列比对程序和参数来确定。此类比对工具包括BLAST套件的工具(Stephen F.Altschul,ThomasL.Madren,Alejandro A.

如本文所用的术语饲养细胞是指诸如通过将生长或存活因子分泌到细胞培养物中或者将生长或存活因子呈递在饲养细胞膜上来支持TIL或T细胞在培养物中的扩增的细胞。在一些实施方案中，饲养细胞生长受阻(即无复制能力)。

如本文所用，受试者和患者是同义使用的，并且不意味着限于人类受试者或患者。

如本文所用的治疗是指癌症的一种或多种体征或症状的减轻或延迟。例如，疾病的可测量参数的至少10％的有利变化，优选至少20％、30％、40％、50％或更高的有利变化可以指示有效治疗。因此，可以例如通过测量疾病进展、疾病缓解、症状严重程度、疼痛减轻、生活质量、维持治疗效果所需的药物剂量、疾病标记物的水平，或适合于正在被治疗或被靶向以进行治疗的给定疾病的任何其他可测量参数来评估治疗的功效或疾病的改善。关于本公开组合物的施用，用于治疗癌症的有效量表明以临床上适当的方式进行的施用对至少统计学显著性的分数的患者产生有益效果，例如症状的改善、治愈、疾病负荷的减少、肿瘤质量或细胞数目的减少、寿命的延长、生活质量的改善，或其他被熟悉治疗特定类型癌症的医生普遍认为是积极的效果。

在给定范围的情况下，端点被包括在内。此外，应当理解，除非另有说明或根据上下文和本领域普通技术人员的理解以其他方式显而易见，否则表示为范围的值可以在本公开的不同实施方案中采用所陈述范围内的任何特定值或子范围，达到该范围下限的单位的十分之一，除非上下文另有明确规定。

本公开的一个或多个实施方案的细节阐述于说明书和附图中。应当理解，可以利用其他实施方案并且可在不脱离本公开范围的情况下作出结构或方法变化。换言之，描述了说明性实施方案和方面。但是应理解，在任何此种实际实施方案的开发中，可以作出诸多特定于实施方式的决定以达成开发者的具体目标(诸如遵守临床相关约束)，该具体目标从一个实施方式到另一个实施方式可能将有所变化。此外，应了解，这种开发努力可能是复杂的且耗时的，但是仍将是受益于本公开的本领域一般技术人员的常规任务。

本文引用的出版物以及它们引用的材料据此通过引用明确地整体并入。

以下实施例意在进一步说明本文所述方法和组合物的某些方面，而非意在限制权利要求的范围。

实施例

实施例1：从患者肿瘤样品中分离和扩增TIL(REP前培养物)

黑色素瘤和头颈部肿瘤样品是从合作人类组织网络(Cooperative Human TissueNetwork)获得。将肿瘤样品在Hanks平衡盐溶液(HB SS)缓冲液中切成1-3mm片段，并且将片段以1个片段/孔放置在多孔板中的含有6000IU/mL IL2(Peprotech)和0.1mg/mL Normocin(I nvivoGen)的2mL TIL培养基(补充有GlutaMAX(Thermo Fisher)、1％青霉素/链霉素、1mM丙酮酸钠、1％HEPES、50μM 2-巯基乙醇(I nvitrogen)和10％热灭活人AB血清(ValleyBio)的RPMI-1640)中。从第5天开始，用含有IL2的新鲜培养基替换一半的培养基，并当细胞在3周的持续时间内汇合时，将细胞分到多个孔或烧瓶中。这种培养过程被称为快速扩增方案前(REP前)。在REP前之后，将TIL等分，在细胞冷冻培养基(Bambanker，Bulldog Bio或Cryostor-10，STEMC ELL Technologies)中冷冻，并在液氮中长期储存。

为了确定REP前培养前后的T细胞频率变化，在REP前培养之前用胶原酶和DNase I消化一部分肿瘤片段以产生单细胞悬浮液，并且将其与REP前培养后获得的细胞进行比较。使用荧光染料缀合的抗CD45和抗CD3抗体通过流式细胞术分析T细胞的频率。如图1所示，培养前肿瘤细胞悬浮液中近一半的细胞(44.29±21.67％)是CD45+，其中只有近似40％(约39.85±23.69％)是CD3+T细胞。在IL2存在下培养(REP前)3周后，大多数细胞为CD45+(90.35±7.28％)(表明造血细胞富集)和CD3+(80.64±15.19％)(表明T细胞富集)。

来自其他人类肿瘤类型(包括黑色素瘤肿瘤和来自乳腺、肺、肾、子宫内膜、肝、胰腺和卵巢的恶性肿瘤)的TIL以与上面描述的方式相同的方式分离。

实施例2：表达膜结合IL21和4-1BBL的K562细胞的产生

膜结合IL21和4-1BBL载体构建体组装

IL21-41BBL-001插入物包含编码前导序列、膜结合IL21(mbIL21)、P2A序列和4-1BBL的核酸序列。mbIL21核酸序列按顺序编码IL21序列、IgG铰链、IgG4链、CD4跨膜结构域和甘氨酸-丝氨酸(GS)接头(见表3)。包含IL21-41BBL-001插入物的OT-IL21-41BBL-001使用标准分子生物学技术在pELNS载体(第三代自灭活慢病毒表达载体)中构建。将基因片段(Gblocks)插入到pELNS载体中，并且使用Gibson assembly(NEBuilder Hifi)将该基因片段置于EF1a启动子的控制下。将组装的质粒转化到大肠杆菌(NEB稳定)中以进行扩增，并且在进行病毒生产之前确认序列。

表3：mbIL21-41BBL构建体的组分

表3给出了本文公开的mbIL21-41BBL构建体的结构域的核酸和氨基酸序列。OT-IL12-(241-262)和OT-CD19-IL12-(297-316,319-332)质粒各自使用标准分子生物学技术在pELNS载体(第三代自灭活慢病毒表达载体)中构建。编码IL12、甘氨酸-丝氨酸接头、各种铰链、跨膜结构域和细胞质尾部的基因片段(Gblocks或串DNA)购自Integrated DNATechnologies或Thermo-fisher scientific。将该基因片段插入到pELNS载体中，并且使用Gibson组装(NEBuilder Hifi)将该基因片段置于EF1a启动子的控制下。将组装的质粒转化到大肠杆菌(NEB稳定)中以进行扩增，并在进行病毒生产之前确认序列。

OTLV-IL21-41BBL-001慢病毒生产

在转染当天，将HEK293T细胞在总体积为20mL的生长培养基(Dulbecco'sModified Eagle培养基(DMEM)、5％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素)中以15x10

用OTLV-IL21-41BBL-001慢病毒转导K562细胞

将K562细胞在含有具有2mM L-谷氨酰胺和10％ FBS的RPMI-1640(完全RPMI，Thermo Fisher)的生长培养基中培养。在转染当天，将K562细胞在500μL K562细胞生长培养基中以1.5x 10

在将K562-IL21-41BBL细胞用作TIL REP方法中的饲养细胞之前，对该细胞进行辐照或用丝裂霉素C处理该细胞。对于辐照，从新鲜细胞培养物中获取K562-IL21-41BBL细胞，将该细胞离心并且以5-20x 10

实施例3.用慢病毒载体转导TIL

IL15载体构建体组装

OT-IL15-292和OT-IL15-293(以下序列)各自使用标准分子生物学技术在pELNS载体(第三代自灭活慢病毒表达载体)中构建。编码经密码子优化的IL15、GS接头、B7-1铰链、跨膜结构域和细胞质尾部的基因片段(Gblocks)购自Integrated DNA Technologies,Inc.(IDT,Coralville,Iowa)。将该基因片段插入到pELNS载体中，并且使用Gibson组装(NEBuilder Hifi)将该基因片段置于EF1a启动子的控制下。将组装的质粒转化到大肠杆菌(NEB稳定)中以进行扩增，并在进行病毒生产之前确认序列。

表1和表2(上文提供)给出了本文公开的组成型mbIL15构建体(OT-IL15-292)和ACZ调节型mbIL15构建体(OT-IL15-293)的组分的核酸和氨基酸序列。构建体OT-IL15-293包含表1中标记为CA2(M1del、L156H)的不稳定结构域。

表2(如上提供)还给出了本文公开的组成型IL15(IL15-292)和ACZ调节型IL15(IL15-293)构建体的核酸和氨基酸序列。

BaEV假型慢病毒生产

将HEK293T细胞接种在胶原包被的组织培养板上，直至70％汇合。使用Lipofectamine 3000转染试剂和P3000增强试剂(Thermo Fisher)在Opti-MEM培养基(Thermo Fisher)中用携带组成型(IL15-292)或调节型(IL15-293)IL15构建体的pELNS转移载体以及包装质粒pRSV.Rev(Addgene#12253)、pMDLg/pRRE(Addgene#12251)和OT-BaEVg-002(SEQ ID NO:XX)转染细胞。转染后6-8小时(hr)用无血清培养基(SFM4Transfx-293,Cytiva)替换培养基。转染后24小时收获含有病毒的上清液，添加新鲜培养基，并在转染后48小时再次收获上清液。过滤病毒上清液以去除碎片并通过低速超速离心对该上清液进行浓缩。将病毒重悬，等分并储存在-80℃。

快速扩增方案(REP)和使用BaEV假型慢病毒载体转导TIL

从如实施例1中所述的那样制备的头颈部肿瘤样品产生的TIL在REP前培养中3周后被工程化。将TIL解冻并且在具有6000IU/mL人IL2的TIL培养基中静置过夜。然后将TIL在24孔板中以3:1珠粒与TIL比率用抗CD3/CD28珠粒(Dynabeads，Thermo Fisher)，或用3μg/mL的板结合的OKT3(超LEAF纯化的抗人CD3抗体，Biolegend)，及6000IU/mL人IL2激活24小时。使用RetroNectin(30μg/mL)在4℃下包被96孔非包被细胞培养板过夜。第二天，去除RetroNectin，用2％的在PBS中的牛血清白蛋白(BSA)封闭板，然后用PBS洗涤板。将如上所述的那样制备的BaEV假型慢病毒上清液在TIL培养基中稀释，并且对于1-4TU/细胞的MOI，以每孔100-200μL的总体积加入。将含有病毒载体的板在32℃下以1400g离心2小时，然后去除上清液。去除上清液后，每孔转移了1.5x 10

用包含如本文所述的编码mbIL15的核酸序列的慢病毒转导的TIL在随后的实施例中可称为“mbIL15 TIL”。用包含编码调节型mbIL15(如OT-IL15-293)的核酸序列的慢病毒转导的TIL在随后的实施例中也可称为“调节型mbIL15 TIL”。用包含编码组成型mbIL15(如OT-IL15-292)的核酸序列的慢病毒转导的TIL在随后的实施例中也可称为“组成型mbIL15TIL”。

实施例4.快速扩增方案中的TIL扩增

如上文实施例1-3中所述的那样产生TIL和饲养细胞。简而言之，在REP前培养中3周后，将冷冻保存的TIL解冻并且在存在6000IU/mL人IL2的情况下静置过夜。然后用抗CD3/CD28 Dynabeads或在OKT3包被的多孔板上激活TIL 24小时，在此之后该TIL用组成型mbIL15(OT-IL15-292)或GFP(OT-EGFP-001)慢病毒载体转导或作为未工程化条件而未被修饰。转导后24小时，将TIL用K562-IL21-41BBL饲养细胞(2:1的饲养细胞:TIL比率)在GREX6M孔板(Wilson Wolf)中扩增，该GREX 6M孔板中具有添加到未工程化TIL以及实验“+IL2”条件中的6000IU/mL I-2。使细胞在GREX板中生长12天以进行“快速扩增方案”或REP，并根据需要添加或替换培养基。在转导后第5、8和12天，将每个GREX孔重悬。取等分试样，以用于使用抗体CD3-BUV395(BD)、CD56-BV711(Biolegend)、CD4-BV605(Biolegend)、CD8-AlexaFluor 700(Biolegend)、IL15-DyL650(LakePharma，内部缀合)、IL15RaFc-Biotin(ACROBiosystems)与二级链霉亲和素-BV421(Biolegend)和可固定生存力染料eFluor 780(Thermo Fisher)进行流式细胞术染色，以如实施例3中所述的那样量化IL15+或GFP+细胞的数目。表达GFP的TIL需要外源性IL2才能在REP中扩增，而表达组成型mb-IL15的TIL在不存在IL2的情况下扩增(图3A)。

实施例5.抗原非依赖性环境中的扩增和存活

接下来，评估REP后TIL在体外抗原非依赖性存活测定的背景下持续存在或扩增的能力。REP扩增12天后，将在不存在细胞因子的情况下扩增的经mbIL15转导的细胞和在存在6000IU/mL IL2的情况下扩增的GFP细胞去珠粒、洗涤并且在不存在细胞因子的情况下静置过夜。第二天，将TIL在添加有或未添加有IL2(6000IU/mL，Peprotech)的TIL培养基中以5x10

在一项包括表达调节型mbIL15的TIL的新研究中，如上文实施例1-3所述的那样产生TIL和饲养细胞。简而言之，在REP前培养中3周后，将冷冻保存的TIL解冻并且在存在6000IU/mL人IL2的情况下静置过夜。然后用抗CD3/CD28 Dynabeads或在OKT3包被的多孔板上激活TIL 24小时，在此之后该TIL用组成型mbIL15(OT-IL15-292)或调节型mbIL15(OT-IL15-293)慢病毒载体转导或未被工程化。转导后24小时，将TIL用K562-IL21-41BBL饲养细胞(5:1的饲养细胞:TIL比率)在GREX 6M孔板(Wilson Wolf)中扩增，该GREX 6M孔板中具有添加到UT TIL中的6000IU/mL IL2，以及添加到mbIL15 TIL中的25μM乙酰唑胺(SelleckChem)。扩增14天后，将TIL分离并且在添加有或未添加有IL2(200IU/mL，Peprotech)或乙酰唑胺(25μM，SelleckChem)的TIL培养基中以5x 10

实施例6.抗原依赖性环境中的扩增和存活

如上文实施例1-3中所述的那样产生TIL和饲养细胞。简而言之，在REP前培养中3周后，将冷冻保存的TIL解冻并且在存在6000IU/mL人IL2的情况下静置过夜。然后用抗CD3/CD28 Dynabeads或在OKT3包被的多孔板上激活TIL 24小时，在此之后该TIL用调节型mbIL15(OT-IL15-293)慢病毒载体转导或未被工程化。转导后24小时，将TIL用K562-IL21-41BBL饲养细胞(5:1的饲养细胞:TIL比率)在GREX 6M孔板(Wilson Wolf)中扩增，该GREX6M孔板中具有添加到UT TIL中的6000IU/mL IL2，以及添加到调节型mbIL15 TIL中的25μM乙酰唑胺(SelleckChem)。扩增14天后，将TIL冷冻保存在Bambanker冷冻培养基(BulldogBio)中。在较晚的时候，将冷冻保存的TIL解冻并且在具有200IU/mL IL2的TIL培养基(未工程化TIL)或具有25μM乙酰唑胺的TIL培养基(调节型mbIL15 TIL)中静置。静置过夜后，在TIL:肿瘤共培养测定中将TIL以1:1的比率与经丝裂霉素C处理的黑色素瘤细胞一起在添加有或未添加有IL2(200IU/mL，Peprotech)或乙酰唑胺(25μM，SelleckChem)的TIL培养基中接种在多孔板中，并且该测定持续总共27天。包括乙酰唑胺的仅媒介物对照，将同一体积的DMSO添加到媒介物对照组中。黑色素瘤细胞来自用嘌呤霉素依赖性荧光素酶载体修饰的A375细胞系(ATCC)，并且如上(实施例3)所述用10μg/mL丝裂霉素C进行处理以防止这些肿瘤细胞增殖。每3天，混合此共培养测定的孔并分离出等分试样以用于通过细胞计数(Celleca细胞计数器，Nexelom)分析细胞扩增以及通过流式细胞术(BD Fortessa)分析表型。每3天添加在TIL培养基中的新鲜的经丝裂霉素C处理的A375黑色素瘤细胞以及新鲜的细胞因子/配体。如图5所示，用乙酰唑胺调节的调节型mbIL15 TIL建立了稳定的扩增动力学，并且即使在这种抗原依赖性环境中(其中慢性刺激应迅速耗竭TIL并减少细胞计数)，经转导的TIL仍然持续存在。在测定中，未工程化TIL在不存在任何外源性细胞因子的情况下不会扩增(从第1天到第27天扩增0.46±0.02倍)，但在存在外源性IL2(200IU/mL)的情况下能够扩增高于25倍(从第1天到第27天扩增25.4±4.06倍)。相比之下，经修饰的TIL在未添加任何外源性细胞因子的情况下扩增，并且明显地，在被给予了25μM乙酰唑胺的调节型mbIL15 TIL扩增12倍(从第1天到第27天扩增12.2±0.10倍)。在未添加乙酰唑胺(仅媒介物对照)的情况下，调节型mbIL15 TIL的扩增比在存在配体的情况下的扩增低四倍(从第1天到第27天扩增2.68±0.42倍)，这突出了乙酰唑胺在调节调节型mbIL15 TIL的存活中的作用。

实施例7.新鲜的REP后TIL的肿瘤反应性

如实施例1-3中所描述的那样产生来自两个黑素瘤供体的TIL。简而言之，在REP前培养中3周后，将冷冻保存的TIL解冻并且在存在6000IU/mL人IL2的情况下静置过夜。然后用抗CD3/CD28Dynabeads或在OKT3包被的多孔板上激活TIL 24小时，在此之后该TIL用调节型mbIL15(OT-IL15-293)慢病毒载体转导或未被工程化。转导后24小时，将TIL用K562-IL21-41BBL饲养细胞(5:1的饲养细胞:TIL比率)在GREX 6M孔板(Wilson Wolf)中扩增，该GREX 6M孔板中具有添加到未工程化TIL中的6000IU/mL IL2，以及添加到mbIL15 TIL中的25μM乙酰唑胺(SelleckChem)。扩增14天后，收获TIL，将其去珠粒并且在存在和不存在IL2和乙酰唑胺的情况下静置过夜。将表达荧光素酶的黑色素瘤细胞系A375-FLuc-Puro(ATCC)以5x 10

实施例8.mbIL15 TIL在不存在IL2的情况下在体内长期持续存在

如上文实施例1-3中所述的那样产生来自一个供体的TIL和饲养细胞。简而言之，在REP前培养中3周后，将冷冻保存的TIL解冻并且在存在6000IU/mL人IL2的情况下静置过夜。然后用抗CD3/CD28 Dynabeads激活TIL 24小时，在此之后该TIL用组成型mbIL15(OT-IL15-292)或调节型mbIL15(OT-IL15-293)慢病毒载体转导或未被工程化。转导后24小时，将TIL用K562-IL21-41BBL饲养细胞(5:1的饲养细胞:TIL比率)在GREX 6M孔板(WilsonWolf)中扩增，该GREX 6M孔板中具有添加到未工程化TIL中的6000IU/mL IL2，以及添加到mbIL15 TIL中的25μM乙酰唑胺(SelleckChem)。扩增14天后，收获TIL，将其去珠粒并且对其作准备以用于过继细胞转移。未工程化TIL扩增612倍，组成型mbIL5 TIL扩增1080倍，并且调节型mbIL15 TIL扩增450倍(图7A)。

NSG(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠购自Jackson Laboratories。在存在或不存在外源性IL2(Proleukin)，或临床级乙酰唑胺或媒介物的情况下，给6至8周龄的雌性小鼠全身输注10x 106个TIL/小鼠，如表4中所述。

表4：体内组给药

在过继细胞疗法当天评估TIL的IL15表达，经组成型mbIL15转导的TIL表现出比经调节型mbIL15转导的TIL(23.6±1.1％IL15+IL15RaFc+)略高的mbIL15转导水平(30.2±0.46％IL15+IL15RaFc+)，但是这两个经转导的群体对于过继细胞转移都是可接受的(图7B)。通过流式细胞术评估IL15表达或转导效率；将细胞与Fc Block一起孵育，并首先用与DyL650缀合的IL15(Lake Pharma，内部缀合)和生物素化IL15RaFc(ACROBiosystems)染色。在室温下在黑暗中孵育25分钟后，将细胞在FACS缓冲液中洗涤、离心并重悬于含有与BV421(Biolegend)缀合的链霉亲和素的FACS缓冲液中。在4℃下在黑暗中孵育20分钟后，将细胞在FACS缓冲液中洗涤，离心，重悬于FACS缓冲液中，并将样品在BD Fortessa流式细胞仪上运行。使用FlowJo V10.7.1进行分析。

在过继细胞疗法后的第7、14、21、32、39、46和53天，经由下颌下静脉收集在含EDTA的管中分离75μL全身血液并对其进行加工以用于TIL计数。血液样品接受1-3mL的ACK裂解缓冲液(Gibco)，并且被孵育10-20分钟以裂解红细胞(RBC)。RBC裂解后，将样品通过70μm细胞过滤器过滤，离心并重悬于FACS缓冲液中。分离每个样品的等分试样以用于细胞计数的分析(Celleca细胞计数器，Nexelom)，并且其余部分被用于通过流式细胞术(BD Fortessa)进行表型评估。对于表型评估，将血液样品用对CD3(BD)、小鼠CD45、CD25(BD)、FoxP3、CD4、CD8、IL15(Lake Pharma，内部缀合)、KLRG1、CD127、CD45RA、CD45RO、CD95、CD69、CCR7、CD56和生物素化IL15RaFc(ACROBiosystems)特异性的抗体染色。将抗体与FITC、PE、PE-Cy5、PE-Cy7、PerCP-Cy5.5、DyL650、APC-Cy7、BUV395、BUV737、BV421、BV510、BV605、BV711或BV786(抗人抗体，全部来自Biolegend，除非另有标识)缀合。此外，所有样品均包含生存力染料(e780可固定生存力染料，Invitrogen)。将样品在BD Fortessa流式细胞仪上运行，并使用Flow Jo V10.7.1进行分析。为了在整个研究中计数TIL，将TIL作为活细胞，随后作为淋巴细胞，随后作为人CD3+和小鼠CD45-细胞进行门控。如图8A中可以看出，未工程化TIL在体内迅速下降，到输注后第53天达到检测不到的水平。接受外源性IL2的未工程化TIL表现得更好，但到输注后第53天持续存在率较低，其中量化的TIL为0.64±0.17％。相比之下，到输注后第53天，很明显经转导的TIL在全身上保持在可检测的水平，其中组成型mbI15 TIL为5.73±1.2％。并且调节型mbIL15 TIL+ACZ为10.2±2.0％。乙酰唑胺的体内调节作用很明显，因为到输注后第53天调节型mbIL15 TIL+媒介物几乎检测不到，为2.94±0.36％。

在过继细胞疗法后第14天和第53天，处死每实验组的5只动物的队列以进行最终收集。从这些动物中经由心脏穿刺收集200μL全身血液，分离脾脏，并且从1个股骨中提取骨髓。如上所述的那样加工血液。脾脏通过70μm细胞过滤器进行机械破坏，接受ACK裂解3分钟以裂解RBC，并且再次通过70μm细胞过滤器被收集。通过一个股骨冲洗骨髓(BM)，并通过70μm细胞过滤器收集该骨髓。分离每个经加工的组织悬浮液的等分试样以分析细胞计数(Celleca细胞计数器，Nexelom)，其余部分被用于通过流式细胞术(BD Fortessa)进行表型评估。对于表型评估，将样品用对CD3(BD)、小鼠CD45、CD25(BD)、FoxP3、CD4、CD8、IL15(LakePharma)、KLRG1、CD 127、CD45RA、CD45RO、CD95、CD69、CCR7、CD56和生物素化IL15RaFc(ACROBiosystems)特异性的抗体染色。将抗体与FITC、PE、PE-Cy5、PE-Cy7、PerCP-Cy5.5、DyL650、APC-Cy7、BUV395、BU V737、BV421、BV510、BV605、BV711或BV786(抗人抗体，全部来自Biolegend，除非另有标识)缀合。此外，所有样品均包含生存力染料(e780可固定生存力染料，Invitrogen)。将样品在BD Fortessa流式细胞仪上运行，并使用Flow Jo V10.7.1进行分析。为了在整个研究中计数TIL，将TIL作为活细胞，随后作为淋巴细胞，随后作为人CD3+和小鼠CD45-细胞进行门控。如图8B和图8C所示，在输注后第14天和第53天，在外周淋巴器官中鉴定出高水平的经转导的TIL，并且经ACZ处理的调节型mbIL15 TIL表现出比它们的经媒介物处理的对应物显著更高的持续存在率(p<0.005)。

表5示出了本文所述的各种构建体的病毒载体序列。

表5：病毒载体序列

实施例9.利用TIL逆转录病毒转染的快速扩增方案

与实施例1类似地制备REP前TIL。简言之，黑色素瘤和头颈部肿瘤样品获自合作人类组织网络。将肿瘤样品在Hanks平衡盐溶液(HBSS)缓冲液中切成1-3mm片段，并将片段以1-10个片段/烧瓶放置在Grex容器中的含有6000IU/mL IL2(Peprotech)、10ug.mL 41BB抗体(Creative BioLabs)、30ng/mL CD3抗体(OKT3，Biolegend)和0.1mg/mL Normocin(InvivoGen)的TIL培养基(补充有GlutaMAX(Thermo Fisher)、1％青霉素/链霉素、1mM丙酮酸钠、1％HEPES、50μM 2-巯基乙醇(Invitrogen)和10％热灭活人AB血清(Valley Bio)的RPMI-1640)中。当确定营养物耗竭时，约每3-4天对容器进行常规喂食。这种培养过程被称为快速扩增方案前(REP前)。在REP前之后，将TIL等分，在细胞冷冻培养基(Bambanker，Bulldog Bio或Cryostor-10，STEMCELL Technologies)中冷冻，并在液氮中长期储存。

将这些REP前TIL解冻并且在具有6000IU/mL人IL2的TIL培养基中静置过夜。然后在包被有3ug/mL OKT3(Ultra-LEAF纯化抗人CD3抗体，Biolegend)和6000IU/mL人IL2的24孔板中激活TIL 24小时。使用RetroNectin(30μg/mL)在4℃下包被24孔非组织培养细胞培养板过夜。第二天，去除RetroNectin，用2％的在PBS中的牛血清白蛋白(BSA)封闭板，然后用PBS洗涤板。由稳定的生产细胞系制备长臂猿白血病病毒(GALV)假型γ逆转录病毒载体(其中mbIL15-CA2DRD表达处于衍生自鼠白血病病毒LTR的启动子的控制下)上清液。将逆转录病毒载体上清液在TIL培养基中稀释，并以每孔500μL的总体积加入，使MOI为约16-80。将含有病毒载体的板在32℃下以1400×g离心2小时，并然后去除上清液。去除上清液后，每孔转移1.0x 10

实施例10.经调节型mbIL15修饰的TIL：信号传导和多功能性

ACZ以剂量依赖性方式调节调节型mbIL15 TIL中的IL15表达和信号传导。

与实施例1-3和9的方法类似地制备REP前TIL，并且如实施例1-3和9所述的那样相应地产生未工程化TIL和mbIL15 TIL。IL15信号传导通路的参与导致包括转录因子蛋白STAT5和核糖体蛋白S6在内的下游信号转导蛋白的磷酸化。为了证明经ACZ调节的mbIL15表达导致调节型mbIL15 TIL中的IL15信号传导，如下采用基于磷酸化流式细胞术的测定：将从四个人类供体(患者1-4)获得的冷冻保存的调节型mbIL15 TIL解冻，然后在无ACZ培养基中静置24小时。接下来，在一系列浓度(包括0.1、1、2.5、5、10、25、100μM)的ACZ以及媒介物对照的存在下，将调节型mbIL15 TIL调节18小时。然后收集调节型mbIL15 TIL以进行染色和FACS分析。

简言之，使用针对CD3、CD4、CD8、IL15和活/死标记物的抗体对细胞进行染色。然后将细胞固定在2％甲醛(BD Cytofix)中，并使用基于甲醇的缓冲液(BD Phospho Perm IIIBuffer)透化，之后用对磷酸化STAT5(Biolegend)和S6(Cell Signaling Technology)特异性的抗体染色。在BD Symphony上获取细胞并使用FlowJo软件对该细胞进行分析。

随着ACZ浓度的增加，mbIL15的表达也增加，在约10-25μM的ACZ下达到稳定水平。图9A。类似地，pSTAT5和pS6的染色强度随着调节型mbIL15 TIL中ACZ浓度的更高(其指示IL15信号传导程度更高)而增加。这些结果表明ACZ和IL15表达与信号传导之间存在剂量依赖性关系。图9B-E和图10。

组成型mbIL15表达和调节型mbIL15 TIL的ACZ调节参与IL15信号传导通路

为了比较IL15表达的不同策略，使用组成型地表达mbIL15的TIL和调节型mbIL15TIL。将来自三个人类供体的冷冻保存的未工程化TIL、组成型mbIL15 TIL和调节型mbIL15TIL解冻，并然后在无ACZ培养基中静置24小时。接下来，如下将前述TIL在培养基中调节18小时：(1)将200IU/mL的IL2(Peprotech)添加到未工程化TIL中；以及(2)将25μM ACZ添加到调节型mbIL15 TIL培养物中。添加媒介物以控制条件。18小时处理后，使用针对CD3、CD4、CD8、IL15和活/死标记物的抗体对细胞进行染色。然后，将细胞固定在2％甲醛(BDCytofix)中，并使用基于甲醇的缓冲液(BD Phospho Perm III Buffer)透化，之后用对磷酸化STAT5(Biolegend)和S6(Cell Signaling Technology)特异的抗体染色。在BDFortessa上获取细胞并使用FlowJo软件对该细胞进行分析。

如图11所示，IL2与IL15共享重叠的信号传导通路，包括通过STAT5和S6的信号传导。与相应的媒介物条件相比，与IL2一起培养的未工程化TIL显示出信号传导通路的参与增加。图11。同样，与调节型mbIL15 TIL+媒介物对照相比，组成型mbIL15表达和调节型mbIL15 TIL+ACZ都显示出STAT5和S6的磷酸化增加。图11。

调节型mbIL15 TIL比未工程化TIL+IL2展现出更大的多功能性

多功能T细胞具有响应刺激同时产生多个效应分子的能力。此外，多功能性与T细胞功效相关。为了比较未工程化TIL与调节型mbIL15 TIL的多功能性，将冷冻保存的细胞解冻并且在不含IL2和ACZ的培养基中静置24小时。接下来，如下进行细胞的调节：在一系列浓度的IL2(20、200、1000和6000IU/mL，或媒介物)存在下将未工程化TIL调节18小时；在ACZ(0.1、1、5、10、25、100μM ACZ，或媒介物)存在下将调节型mbIL15 TIL调节18小时。然后，在布雷菲德菌素A(Biolegend)和莫能菌素(Life Technologies Corporation)存在下，用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)和离子霉素(Biolegend)刺激细胞6小时。使用未经刺激的未工程化TIL和未经刺激的调节型mbIL15 TIL作为对照。刺激后，收集细胞以进行染色和FACS分析。

简言之，使用针对CD3、CD4、CD8、IL15抗体和生存力染料对细胞进行染色。然后，对细胞进行甲醛固定和透化(BD Cytofix/Cyto perm试剂盒)，然后使用针对TNFα和IFNγ的抗体(Biolegend)进行染色。在BD Fortessa上获取细胞并使用FlowJo软件对该细胞进行分析。对TNFα和IFNγ的表达呈双阳性的细胞被认为是多功能的。

如图12所示，虽然所有培养条件都含有一些多功能群体，但调节型mbIL15 TIL中的多功能性随着ACZ浓度的更高而增加。图12A、12B。此外，调节型mbIL15 TIL比来自同一供体的未工程化TIL+IL2更具多功能性。图12A、12C。表达mbIL15的调节型mbIL15 TIL的百分比也显示出与ACZ剂量的剂量响应关系。

实施例11.调节型IL15 TIL的体内功效

PDX163A功效

从获自肿瘤库(合作人类组织网络：CHTN)的新鲜原发性黑色素瘤样品(患者肿瘤编号M1200163A)创建患者来源的异种移植物(PDX)模型。使用NSG雌性小鼠(杰克逊实验室；目录号000557)建立小鼠模型。一旦建立了模型，就将冷冻保存的肿瘤切片无菌地植入到异氟烷麻醉的免疫受损小鼠(NSG雌性小鼠；杰克逊实验室；目录号000557)中。允许肿瘤生长到近似1000mm

治疗组如下：(1)用IL2给药的未工程化TIL；和(2)用乙酰唑胺(ACZ)给药的调节型mbIL15 TIL。对接受未工程化TIL的小鼠每天两次给药50,000国际单位(IU)的IL2，持续5天。在整个研究中，用调节型mbIL15 TIL治疗的小鼠每天接受媒介物或200mg/kg乙酰唑胺(ACZ)。每周两次收集肿瘤和体重。

图13显示了患者来源的异种移植物(PDX)模型的结果。在快速扩增方案(REP)结束时，将未工程化TIL和调节型mbIL15 TIL(+/-乙酰唑胺(ACZ))过继转移到荷有人黑色素瘤PDX的小鼠中。评价平均肿瘤体积(+/-SEM)。图13A示出过继细胞转移(ACT)后几天给定治疗的平均肿瘤体积。图13B示出ACT后几天无TIL(左上)；未工程化TIL+IL2(右上)；调节型mbIL15 TIL+媒介物(左下)；和调节型mbIL15TIL+ACZ(右下)的肿瘤体积。如图13所示，调节型mbIL15 TIL+ACZ表现出与未工程化TIL+IL2相比显著优越的抗肿瘤功效。

SK-MEL-1功效

创建了SK-MEL-1异种移植癌症模型来评价本发明的调节型mbIL15 TIL。使用从患有广泛且快速进展的恶性黑色素瘤(ATCC目录号HTB-67)的患者的胸导管获得的细胞创建模型。NSG雌性小鼠(杰克逊实验室；目录号000557)是用于接受癌细胞的小鼠。简而言之，将低传代细胞解冻并使其生长到维持能生存的亚汇合培养物的规模。在注射当天，对细胞进行计数，将其洗涤并以30x10

治疗组如下：(1)用IL2给药的未工程化TIL；和(2)用乙酰唑胺(ACZ)给药的调节型mbIL15 TIL。对接受未工程化TIL的小鼠每天两次给药50,000国际单位(IU)的IL2，持续5天。在整个研究中，用调节型mbIL15 TIL治疗的小鼠每天接受媒介物或200mg/kg乙酰唑胺(ACZ)。每周两次收集肿瘤和体重。

图14示出了SK-MEL-1异种移植癌症模型的结果。在快速扩增方案(REP)结束时，将未工程化TIL和调节型mbIL15 TIL(+/-乙酰唑胺(ACZ))过继转移到荷有SK-MEL-1肿瘤的小鼠中。评价平均肿瘤体积(+/-SEM)。图14A示出过继细胞转移(ACT)后几天给定治疗的平均肿瘤体积。图14B示出ACT后几天无TIL(左上)；未工程化TIL+IL2(右上)；调节型mbIL15 TIL+媒介物(左下)；和调节型mbIL15TIL+ACZ(右下)的肿瘤体积。如图14所示，结果表明，调节型mbIL15TIL+ACZ表现出与未工程化TIL+IL2相比显著优越的抗肿瘤功效。

实施例12.调节型mbIL15 TIL的体外细胞毒性

与实施例1-3和9的方法类似地制备REP前TIL，并且根据实施例1-3和9的方法产生未工程化TIL和mbIL15 TIL。为了评价调节型mbIL15 TIL的抗肿瘤细胞毒性潜力，使用HLA匹配的肿瘤细胞系SK-MEL-1(ATCC)和六种不同的患者TIL样品进行肿瘤-TIL共培养测定。也使用PDX细胞建立了同一的实验。被评价的患者TIL样品是经扩增的未工程化TIL，或经扩增的调节型mbIL15 TIL。根据上述REP方案(实施例1-9)创建调节型mbIL15 TIL，然后将其冷冻保存。然后将来自六名患者的未工程化TIL和调节型mbIL15 TIL解冻，计数，并且在补充有以下中的任一者的培养基中以7.5x 10

然后将TIL以5:1和1:1(TIL效应物:肿瘤靶标)比率与标记的黑色素瘤细胞一起在上面列出的相同的经补充(supplemented)的IL2或ACZ条件下在存在或不存在MHC I类封闭性试剂的情况下共培养(肿瘤细胞单独与80μg/mL抗人HLA ABC一起培养2小时，之后与TIL一起共培养)。包括单独未标记和标记的黑色素瘤细胞的额外对照，以评估共培养系统中的背景半胱天冬酶-3活性。将这种TIL-肿瘤细胞共培养物孵育3小时，然后将细胞固定，透化并且针对细胞内裂解的半胱天冬酶-3(肿瘤细胞内不可逆地致力于细胞死亡的标记物)进行染色。

在BD Fortessa流式细胞仪上采集样品，使用Flow Jo V10.7.1进行分析，其中细胞毒性由活的Cell Trace Far Red阳性细胞群体内裂解的半胱天冬酶-3染色呈阳性的细胞的百分比(减去背景半胱天冬酶-3阳性)来确定。

如图15所示，在这种对TIL肿瘤对的抗肿瘤细胞毒性的评估中，与未工程化TIL+IL2相比，调节型mbIL15 TIL在所有6个供体中表现出优越的抗肿瘤细胞毒性活性。图15。

实施例13：用不同饲养细胞产生未工程化TIL和mbIL15 TIL

如实施例1和9中所述的那样制备从肿瘤样品产生的REP前TIL。将REP前TIL解冻并且在具有6000IU/mL人IL2(Peprotech)的TIL培养基(补充有GlutaMAX(Thermo Fisher)、1％ HEPES、50μM 2-巯基乙醇(Invitrogen)和10％热灭活人AB血清(Valley Bio)的RPMI-1640)中静置48小时。然后将TIL在包被有3μg/抗CD3(OKT3，Miltenyi Biotec)和6000IU/mL可溶性人IL2的24孔NUNC板中激活24小时。使用RetroNectin(30μg/mL)在4℃下包被24孔非包被细胞培养板过夜。第二天，去除RetroNectin，用2.5％的在PBS中的人血清白蛋白(HSA)封闭板，然后用PBS洗涤板。将如实施例9中所述的那样制备的BaEV假型慢病毒上清液在TIL培养基中稀释并加入到每个孔中以达到0.01-0.6的MOI。将含有病毒载体的板在32℃下以1400g离心2小时，然后去除上清液。去除上清液后，每孔转移1x 10

REP中TIL扩增的评价

在扩增期间定期地将每个GREX孔重悬并充分混合，并取等分试样以用于使用吖啶橙/碘化丙啶生存力染料(Cellaca细胞计数器，Nexcelom)和流式细胞术染色进行细胞计数。使用抗体CD3-BUV395(BD)、CD56-BV711(Biolegend)、CD4-BV605(Biolegend)、CD8-Alexa Fluor 700(Biolegend)、IL15RaFc-Biotin(ACRO Biosystems)与二级链霉亲和素-BV421(Biolegend)和可固定生存力染料eFluor 780(Thermo Fisher)对样品进行染色。在BD Symphony流式细胞仪上运行样品，并使用Flow Jo V10.7.1进行分析。

通过在整个REP的特定时间点获得能生存的细胞总数来确定总TIL扩增。图16显示对于mbIL15 TIL，使用K562饲养细胞并接受IL-21和41BBL介导的共刺激导致REP和PBMC饲养细胞以及不具有41BBL的K562饲养细胞中的最大细胞扩增仅支持REP中次优水平的TIL扩增。相比之下，尽管未工程化TIL在使用任何所述饲养细胞时在存在IL2的情况下都得到扩增，但PBMC饲养细胞促进了REP中未工程化TIL的最大扩增。

IL15表达由活的CD3阳性CD56阴性细胞群体内BV421-链霉亲和素的染色呈阳性的细胞百分比确定。在用K562饲养细胞产生并接受IL-21和41BBL介导的共刺激的mbIL15 TIL中，mbIL15+TIL的频率通过REP过程增加，这表明经mbIL15转导的子集在工程化TIL细胞培养物中富集(图18)。同样，当使用K562饲养细胞在存在IL-21和41BBL介导的共刺激的情况下产生组成型或调节型mbIL15+TIL时，REP中mbIL15+TIL发生最大扩增(图19)。

CD4:CD8比率由(活的CD3阳性CD56阴性细胞中的)CD4染色呈阳性的细胞的百分比与(活的CD3阳性CD56阴性细胞中的)CD8染色呈阳性的细胞的百分比的比率来确定。用K562饲养细胞产生并接受IL-21和41BBL介导的共刺激的经扩增的mbIL15 TIL富集CD8+细胞毒性效应细胞，如由它们在整个REP中CD4:CD8比率降低所指示的(图20)。相比之下，用汇集的PBMC饲养细胞、未经修饰的K562饲养细胞或单独表达41BBL的K562饲养细胞产生的mbIL15TIL的CD4:CD8比率在REP期间没有降低。

为了评价多功能性，按照制造商的方案，将REP结束时的未工程化TIL和mbIL15TIL与Immunocult CD3/CD28刺激物(Stem Cel l Technologies)在96孔组织培养物处理的圆底板中共培养。孵育1小时后，加入1000x转运抑制剂(来自eBiosciences的Monensin、来自B iolegend的布雷菲德菌素A)，并将共培养物在37℃下再孵育5小时。孵育后，使用上面描述的抗体对样品进行染色，然后使用Cytofix/Cy toperm试剂(BD Biosciences)对该样品进行固定和透化。使用针对IL 2-BV737(BD)、IFNγ-FITC(Biolegend)、穿孔素-PerCPCy5.5(Biolegen d)、TNFα-PECF594(Biolegend)、颗粒酶B-Alexa Fluor 700(Biolegen d)的抗体进行细胞内染色。在BD Symphony流式细胞仪上运行样品，并使用FlowJo V10.7.1进行分析。多功能性被确定为活淋巴细胞中TNFα和IFNγ双阳性细胞的百分比。与用PBMC饲养细胞或未经修饰的K562饲养细胞产生的mbIL15 TIL相比，用表达膜结合IL-21和41BBL的K562饲养细胞产生的mbIL15 TIL在REP结束时表现出增强的多功能性(图21)。

抗原非依赖性存活测定中体外TIL持续存在率的评价

在抗原非依赖性存活测定中评估了REP后TIL的体外持续存在率。在REP结束时，将未工程化TIL和mbIL15 TIL在无补充物(supplement-free)条件下静置24小时。第二天，将未工程化细胞在不具有细胞因子支持物(cytokine support)或具有6000IU/mL IL2的24孔GREX板中以1x 10

TCR多样性评估

为了测量TCRVβ亚家族多样性，按照制造商的方案，使用Beta Mark TCR Vbeta库试剂盒(Beckman Coulter)对REP结束时的未工程化TIL和mbIL15 TIL进行流式细胞术染色。在BD Symphony流式细胞仪上运行样品并使用Flow Jo V10.7.1进行分析，并通过评价每个亚家族的阳性百分比并将数据显示为所有覆盖的亚家族的总和来评估TCRVβ亚家族分布。无论用于在REP中扩增的饲养细胞如何，未工程化TIL和mbIL15 TIL都维持了多样化的TCRVβ亚家族分布(图23)。

在具有41BBL和IL21介导的信号传导的mbIL15 TIL中的PD1表达

为评价TIL耗竭水平，确定PD1表达。使用抗体CD3-BUV395(BD)、CD56-BV711(Biolegend)、CD4-BV605(Biolegend)、CD8-Alexa Fluor 700(Biolegend)、PD1-PECy7(Biolegend)、CD25-BUV737(Biolegend)、IL15RaFc-Biotin(ACRO Biosystems)与二级链霉亲和素-BV421(Biolegend)和可固定生存力染料eFluor 780(Thermo Fisher)对样品进行染色。对于细胞内染色，首先用上面列出的表面抗体对细胞进行染色，然后使用BDCytofix/Cytoperm制造商的方案固定并透化细胞。然后使用抗体FoxP3-FITC(Biolegend)对经透化细胞进行染色，并在BD Symphony流式细胞仪上运行样品并使用Flow Jo V10.7.1进行分析。PD1表达由活的CD3阳性CD56阴性细胞群体内PD1染色呈阳性的细胞百分比确定。如图25所示，PD1表达在未经扩增的mbIL15 TIL中最高，并且具有41BBL和IL21介导的信号传导的mbIL15 TIL的扩增产生具有接近基线的PD1表达的TIL。

实施例14：在工程化和扩增期间mbIL15 TIL的表型与REP前TIL相比的变化(CD8+、CD4+、PD1+和调节性T细胞的频率)

进行表型分析以比较REP前TIL(如实施例1所述)与工程化mbIL15 TIL(如实施例3所述)。如实施例13所述，使用针对CD3、CD4、CD8和PD1的抗体通过流式细胞术对REP前和REP后TIL进行表型分析。如图25A所示，与来自相同TIL供体的相应REP前TIL相比，REP后mbIL15TIL的CD8+T细胞频率更高，以及CD4+T细胞频率更低，这与来自实施例13的图20中所示的结果一致。如实施例13中所讨论和评价的，CD8+T细胞的这种增加反映了细胞毒性效应细胞的增加。同样，如图25B所示，REP后mbIL15 TIL表达的PD1水平低于来自相同TIL供体的相应REP前TIL，这与来自实施例13的图24中所示的结果一致。

为了检测TIL的经扩增群体中的调节性T细胞(T

实施例15：患者来源的异种移植物(PDX)模型和使用工程化TIL进行的治疗

建立患者来源的异种移植物(PDX)模型

如实施例11所述，从肿瘤库获得的新鲜原发性黑色素瘤样品创建患者来源的异种移植物(PDX)模型(PDX 163A)。一旦建立了模型，就将冷冻保存的肿瘤切片无菌植入到异氟烷麻醉的免疫受损的小鼠中。肿瘤生长到近似1000mm

还使用流式细胞术评估了从荷瘤动物切除的PDX163A肿瘤的共有黑色素瘤肿瘤抗原的表达。为了评价黑色素瘤细胞上保守的黑色素瘤抗原水平，通过流式细胞术测定本文所述的黑色素瘤细胞系A375和黑色素瘤PDX。新鲜获得或从冷冻保存获得来自如实施例11所述的黑色素瘤PDX的肿瘤块，并且将该肿瘤块根据制造商的方案用GentleMAC(Miltenyi)消化，以便获得能生存的单细胞悬浮液。将样品用Fc封闭性试剂封闭，并且使用针对MART-1的抗体(Biolegend)、gp100(Biolegend)和可固定生存力染料eFluor 780(Thermo Fisher)染色。在BD Symphony流式细胞仪上运行样品，并使用Flow Jo V10.7.1进行分析。表达黑色素瘤相关抗原的肿瘤细胞的频率由活细胞群体内MART-1或gp100染色呈阳性的细胞百分比确定。图26显示保守的黑色素瘤相关抗原MART-1和gp100均在如本实施例(下文)所述选择用于TIL功效建模的PDX肿瘤上表达。

对用于同种异体功效建模的供体的选择

如实施例1-3或9所述的那样产生来自八个黑色素瘤供体的TIL。简而言之，在REP前培养中3周后，将冷冻保存的TIL解冻并且在存在6000IU/mL人IL2的情况下静置过夜。然后用抗CD3/CD28Dynabeads或在OKT3包被的多孔板上激活TIL 24小时，在此之后该TIL用调节型mbIL15载体转导或未被工程化。转导后24小时，将TIL用K562-IL21-41BBL饲养细胞在GREX 6M孔板(Wilson Wolf)中扩增，该GREX 6M孔板中具有添加到未工程化TIL中的6000IU/mL IL2，以及添加到mbIL15 TIL中的25μM乙酰唑胺(SelleckChem或Hikma)。扩增14天后，收获TIL，将其去珠粒并且在存在和不存在IL2和乙酰唑胺的情况下静置过夜。

使用四聚体染色确定哪些TIL供体对共有黑色素瘤抗原MART-1和gp100具有反应性。为了评价抗原反应性TIL的水平，进行了流式细胞术以检查四聚体反应细胞的频率。用Fc封闭性试剂封闭样品，并使用抗体CD3-BUV395(BD)、CD4-BV605(Biolegend)、CD8-AlexaFluor 700(Biolegend)、HLA-A2:01-MART-1四聚体(MBL International)、HLA-A2:01-gp100(MBL International)、IL15RaFc-Biotin(ACRO Biosystems)与二级链霉亲和素-BV421(Biolegend)和可固定生存力染料eFluor 780(Thermo Fisher)对样品进行染色。在BD Symphony流式细胞仪上运行样品，并使用Flow Jo V10.7.1进行分析。抗原反应性TIL的频率由活的CD3阳性CD8阳性细胞群体内两种四聚体中的每种四聚体的染色独立地呈阳性的细胞百分比确定。如图X所示，所有四个所测试供体都表现出对MART-1抗原的反应性，并且四个所测试供体中有三个表现出对gp100抗原的反应性。四聚体阳性群体表明TIL含有通过HLA:A2:01基因座对相应的黑色素瘤相关抗原有反应的细胞中的一部分。在图27中，在PDX功效研究中利用了用*表示的供体，如该实施例(下文)中所描绘。

新鲜获得或从冷冻保存获得来自如实施例11所述的黑色素瘤PDX的肿瘤块，并将肿瘤块根据制造商的方案用GentleMAC(Miltenyi)消化，以获得能生存的单细胞悬浮液。然后将PDX细胞以5x 106个细胞/mL重悬于TIL培养基中。向细胞中加入10μg/mL丝裂霉素-C，然后将该细胞在37℃下孵育30分钟。然后将该细胞用50mL TIL培养基洗涤3次。将每孔1x10

图28显示TIL：肿瘤细胞共培养后的干扰素γ(IFNγ)产量可用于准确地预测对PDX肿瘤有反应的TIL供体。该体外测定表明，TIL供体006、39A和41A是响应于PDX产生最高量IFNγ的供体，这从而支持了它们作为供体来检查体内功效的候选资格，如该实施例(下文)中所描述。

使用患者来源的异种移植物(PDX)模型进行TIL功效研究

将来自PDx荷瘤小鼠的肿瘤(如上所述的那样被传代)无菌收集，切片成约100mg切片，并然后植入到更大的小鼠队列中，允许该小鼠生长13天，然后对该小鼠进行测量并且将其随机分组(50mm

                         序列表

<110>  黑曜石疗法公司(Obsidian Therapeutics, Inc.)

<120>  用于T细胞和肿瘤浸润淋巴细胞的扩增的组合物和方法

<130>  108407-1291323 (020WO1)

<150>  63/153,367

<151>  2021-02-24

<150>  63/139,305

<151>  2021-01-19

<150>  63/226,114

<151>  2021-07-27

<150>  63/244,166

<151>  2021-09-14

<160>  60

<170>  PatentIn version 3.5

<210>  1

<211>  159

<212>  PRT

<213>  大肠杆菌(E. coli)

<400>  1

Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val Ile Gly Met

1               5                   10                  15

Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys

            20                  25                  30

Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu

        35                  40                  45

Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser

    50                  55                  60

Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu

65                  70                  75                  80

Ala Ile Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly

                85                  90                  95

Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu

            100                 105                 110

Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr

        115                 120                 125

Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp

    130                 135                 140

Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Cys Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg

145                 150                 155

<210>  2

<211>  187

<212>  PRT

<213>  智人(Homo Sapiens)

<400>  2

Met Val Gly Ser Leu Asn Cys Ile Val Ala Val Ser Gln Asn Met Gly

1               5                   10                  15

Ile Gly Lys Asn Gly Asp Leu Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn Glu Phe

            20                  25                  30

Arg Tyr Phe Gln Arg Met Thr Thr Thr Ser Ser Val Glu Gly Lys Gln

        35                  40                  45

Asn Leu Val Ile Met Gly Lys Lys Thr Trp Phe Ser Ile Pro Glu Lys

    50                  55                  60

Asn Arg Pro Leu Lys Gly Arg Ile Asn Leu Val Leu Ser Arg Glu Leu

65                  70                  75                  80

Lys Glu Pro Pro Gln Gly Ala His Phe Leu Ser Arg Ser Leu Asp Asp

                85                  90                  95

Ala Leu Lys Leu Thr Glu Gln Pro Glu Leu Ala Asn Lys Val Asp Met

            100                 105                 110

Val Trp Ile Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr Lys Glu Ala Met Asn His

        115                 120                 125

Pro Gly His Leu Lys Leu Phe Val Thr Arg Ile Met Gln Asp Phe Glu

    130                 135                 140

Ser Asp Thr Phe Phe Pro Glu Ile Asp Leu Glu Lys Tyr Lys Leu Leu

145                 150                 155                 160

Pro Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Asp Val Gln Glu Glu Lys Gly Ile

                165                 170                 175

Lys Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Asn Asp

            180                 185

<210>  3

<211>  3919

<212>  DNA

<213>  智人(Homo Sapiens)

<400>  3

agtcccagac agaacctact atgtgcggcg gcagctgggg cgggaaggcg ggagctgggg      60

gcgctggggg cgctgcggcc gctgcggccg ctgcagccgc tgcagcgcca gggtccacct     120

ggtcggctgc acctgtggag gaggaggtgg atttcaggct tcccgtagac tggaagaatc     180

ggctcaaaac cgcttgcctc gcaggggctg agctggaggc agcgaggccg cccgacgcag     240

gcttccggcg agacatggca gggcaaggat ggcagcccgg cggcagggcc tggcgaggag     300

cgcgagcccg cggccgcagt tcccaggcgt ctgcgggcgc gagcacgccg cgaccctgcg     360

tgcgccgggg cgggggggcg gggcctcgcc tgcacaaatg gggacgaggg gggcggggcg     420

gccacaattt cgcgccaaac ttgaccgcgc gttctgctgt aacgagcggg ctcggaggtc     480

ctcccgctgc tgtcatggtt ggttcgctaa actgcatcgt cgctgtgtcc cagaacatgg     540

gcatcggcaa gaacggggac ctgccctggc caccgctcag gaatgaattc agatatttcc     600

agagaatgac cacaacctct tcagtagaag gtaaacagaa tctggtgatt atgggtaaga     660

agacctggtt ctccattcct gagaagaatc gacctttaaa gggtagaatt aatttagttc     720

tcagcagaga actcaaggaa cctccacaag gagctcattt tctttccaga agtctagatg     780

atgccttaaa acttactgaa caaccagaat tagcaaataa agtagacatg gtctggatag     840

ttggtggcag ttctgtttat aaggaagcca tgaatcaccc aggccatctt aaactatttg     900

tgacaaggat catgcaagac tttgaaagtg acacgttttt tccagaaatt gatttggaga     960

aatataaact tctgccagaa tacccaggtg ttctctctga tgtccaggag gagaaaggca    1020

ttaagtacaa atttgaagta tatgagaaga atgattaata tgaaggtgtt ttctagttta    1080

agttgttccc cctccctctg aaaaaagtat gtatttttac attagaaaag gttttttgtt    1140

gactttagat ctataattat ttctaagcaa ctagttttta ttccccacta ctcttgtctc    1200

tatcagatac catttatgag acattcttgc tataactaag tgcttctcca agaccccaac    1260

tgagtcccca gcacctgcta cagtgagctg ccattccaca cccatcacat gtggcactct    1320

tgccagtcct tgacattgtc gggcttttca catgttggta atatttatta aagatgaaga    1380

tccacatacc cttcaactga gcagtttcac tagtggaaat accaaaagct tcctacgtgt    1440

atatccagag gtttgtagat aaatgttgcc accttgtttg taacagtgaa aaattgaaaa    1500

caacctggaa gtccagtgat gggaaaatga gtatgtttct gtcttagatt ggggaaccca    1560

aagcagattg caagactgaa atttcagtga aagcagtgta tttgctaggt cataccagaa    1620

atcatcaatt gaggtacgga gaaactgaac tgagaaggta agaaaagcaa tttaaagtca    1680

gcgagcaggt tctcattgat aacaagctcc atactgctga gatacaggga aatggagggg    1740

ggaaagctgg agtattgatc ccgcccccct ccttggttgt cagctccctg tcctgtgtgt    1800

gggcggaaca tagtccagct gctctatagc aagtctcagg tgtttgcagt aagaagctgc    1860

tggcatgcac gggaacagtg aatgccaaac acttaaagca attcgatgtt taagtatgta    1920

agttcttttt tttttagaca gcgtttcgct cttgttgccc aggctagcat gcaatggtgt    1980

gacctcggct tactgcaacc tccgccttcc cagattcaag cgattctcct gcctcaggct    2040

cccaagtagc taggaccagg tgcgcgccac cacgcccggc taatttttgt attttgtatt    2100

tttagtagag atggggtttc accatgttgg tcaggctagt ctcgaactcg tgaccgcaag    2160

cgattcaccc acctcagcct cccaaagtgc tgggattacc ggcttgagcc accacacccg    2220

gcacatcttc attcttttta tgtagtaaaa agtataaggc cacacatggt ttatttgaag    2280

tattttataa tttaaaaaaa tacagaagca ggaaaaccaa ttataagttc aagtgaggga    2340

tgatggttgc ttgaaccaaa gggttgcatg tagtaagaaa ttgtgattta agatatattt    2400

taaagttata agtagcagga tattctgatg gagtttgact ttggttttgg gcccagggag    2460

tttcagatgc ctttgagaaa tgaatgaagt agagagaaaa taaaagaaaa accagccagg    2520

cacagtggct cacacctgta atcccagcgc tttgggaggc taaggcaggc agatcacttg    2580

agaccagctt gggcaacatg gcaaagcccc atctctacaa aaaacacaaa aattagctgg    2640

gcattgtggc gcacacctgt attcccatct agtcaggaag ctgagatgga agaattaatt    2700

gagcccacga gttcaaggct gcagtgagtc gtgattgtgc cactgcactc cagccggggt    2760

gacagaagag accttgtctc gaaaaggaat ctgaaaacaa tggaaccatg ccttcataat    2820

tctagaaagt tattttcaac tgataaatct atattcaccc aaataatcaa gggtgaaggt    2880

aaaataatac atttttagac aagcaaagac tcaggggtta cctccatgtg ccctttttag    2940

ggaagctgtt ggagaaaata ctccagcaaa atgaaggagt acacaaacca gagaatgaca    3000

tgaatccagc aaataggatc caacacaggc aatattccag ctatggagct agctttaaaa    3060

aggaacagta aaaatattaa tcggttagct gggtggaatg gcccatgcct gtagtcccag    3120

ctactcagga ggctcagcag caggacgact tgagcccaag agttccagac cagcctggcc    3180

accttagtga gatcccttct cttaaaaata ataacttatt gccagatttg gggcatttgg    3240

aaagaagttc attgaagata aagcaaaagt aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa caaggggaaa    3300

gggttggtta ggcaatcatt ctagggcaga aagaagtaca ggataggaag agcataatac    3360

actgtttttc tcaacaagga gcagtatgta cacagtcata atgatgtgac tgcttagccc    3420

ctaaatatgg taactactct gggacaatat gggaggaaaa gtgaagattg tgatggtgta    3480

agagctaaat cctcatctgt catatccaga aatcactata taatatataa taatgaaatg    3540

actaagttat gtgaggaaaa aaacagaaga cattgctaaa agagttaaaa gtcattgctc    3600

tggagaatta ggagggatgg ggcaggggac tgttaggatg cattataaac tgaaaagcct    3660

ttttaaaatt ttatgtatta atatatgcat tcacttgaaa aactaaaaaa aaacaataat    3720

ttggaaaaac ccatgaaggt aactaacgga aggaaaaact aagagaatga aaagtatttg    3780

cctctggaaa gaacaactgg caggactgtt gttttcattg taagactttt ggagccattt    3840

aattgtactt aaccattttc atctatttct ttaataagaa caattccatc ttaataaaga    3900

gttacacttg ttaataagt                                                 3919

<210>  4

<211>  107

<212>  PRT

<213>  智人(Homo Sapiens)

<400>  4

Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro

1               5                   10                  15

Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp

            20                  25                  30

Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe

        35                  40                  45

Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala

    50                  55                  60

Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr

65                  70                  75                  80

Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr

                85                  90                  95

Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu

            100                 105

<210>  5

<211>  327

<212>  PRT

<213>  智人(Homo Sapiens)

<400>  5

Met Glu Glu Thr Arg Glu Leu Gln Ser Leu Ala Ala Ala Val Val Pro

1               5                   10                  15

Ser Ala Gln Thr Leu Lys Ile Thr Asp Phe Ser Phe Ser Asp Phe Glu

            20                  25                  30

Leu Ser Asp Leu Glu Thr Ala Leu Cys Thr Ile Arg Met Phe Thr Asp

        35                  40                  45

Leu Asn Leu Val Gln Asn Phe Gln Met Lys His Glu Val Leu Cys Arg

    50                  55                  60

Trp Ile Leu Ser Val Lys Lys Asn Tyr Arg Lys Asn Val Ala Tyr His

65                  70                  75                  80

Asn Trp Arg His Ala Phe Asn Thr Ala Gln Cys Met Phe Ala Ala Leu

                85                  90                  95

Lys Ala Gly Lys Ile Gln Asn Lys Leu Thr Asp Leu Glu Ile Leu Ala

            100                 105                 110

Leu Leu Ile Ala Ala Leu Ser His Asp Leu Asp His Arg Gly Val Asn

        115                 120                 125

Asn Ser Tyr Ile Gln Arg Ser Glu His Pro Leu Ala Gln Leu Tyr Cys

    130                 135                 140

His Ser Ile Met Glu His His His Phe Asp Gln Cys Leu Met Ile Leu

145                 150                 155                 160

Asn Ser Pro Gly Asn Gln Ile Leu Ser Gly Leu Ser Ile Glu Glu Tyr

                165                 170                 175

Lys Thr Thr Leu Lys Ile Ile Lys Gln Ala Ile Leu Ala Thr Asp Leu

            180                 185                 190

Ala Leu Tyr Ile Lys Arg Arg Gly Glu Phe Phe Glu Leu Ile Arg Lys

        195                 200                 205

Asn Gln Phe Asn Leu Glu Asp Pro His Gln Lys Glu Leu Phe Leu Ala

    210                 215                 220

Met Leu Met Thr Ala Cys Asp Leu Ser Ala Ile Thr Lys Pro Trp Pro

225                 230                 235                 240

Ile Gln Gln Arg Ile Ala Glu Leu Val Ala Thr Glu Phe Phe Asp Gln

                245                 250                 255

Gly Asp Arg Glu Arg Lys Glu Leu Asn Ile Glu Pro Thr Asp Leu Met

            260                 265                 270

Asn Arg Glu Lys Lys Asn Lys Ile Pro Ser Met Gln Val Gly Phe Ile

        275                 280                 285

Asp Ala Ile Cys Leu Gln Leu Tyr Glu Ala Leu Thr His Val Ser Glu

    290                 295                 300

Asp Cys Phe Pro Leu Leu Asp Gly Cys Arg Lys Asn Arg Gln Lys Trp

305                 310                 315                 320

Gln Ala Leu Ala Glu Gln Gln

                325

<210>  6

<211>  875

<212>  PRT

<213>  智人(Homo Sapiens)

<400>  6

Met Glu Arg Ala Gly Pro Ser Phe Gly Gln Gln Arg Gln Gln Gln Gln

1               5                   10                  15

Pro Gln Gln Gln Lys Gln Gln Gln Arg Asp Gln Asp Ser Val Glu Ala

            20                  25                  30

Trp Leu Asp Asp His Trp Asp Phe Thr Phe Ser Tyr Phe Val Arg Lys

        35                  40                  45

Ala Thr Arg Glu Met Val Asn Ala Trp Phe Ala Glu Arg Val His Thr

    50                  55                  60

Ile Pro Val Cys Lys Glu Gly Ile Arg Gly His Thr Glu Ser Cys Ser

65                  70                  75                  80

Cys Pro Leu Gln Gln Ser Pro Arg Ala Asp Asn Ser Ala Pro Gly Thr

                85                  90                  95

Pro Thr Arg Lys Ile Ser Ala Ser Glu Phe Asp Arg Pro Leu Arg Pro

            100                 105                 110

Ile Val Val Lys Asp Ser Glu Gly Thr Val Ser Phe Leu Ser Asp Ser

        115                 120                 125

Glu Lys Lys Glu Gln Met Pro Leu Thr Pro Pro Arg Phe Asp His Asp

    130                 135                 140

Glu Gly Asp Gln Cys Ser Arg Leu Leu Glu Leu Val Lys Asp Ile Ser

145                 150                 155                 160

Ser His Leu Asp Val Thr Ala Leu Cys His Lys Ile Phe Leu His Ile

                165                 170                 175

His Gly Leu Ile Ser Ala Asp Arg Tyr Ser Leu Phe Leu Val Cys Glu

            180                 185                 190

Asp Ser Ser Asn Asp Lys Phe Leu Ile Ser Arg Leu Phe Asp Val Ala

        195                 200                 205

Glu Gly Ser Thr Leu Glu Glu Val Ser Asn Asn Cys Ile Arg Leu Glu

    210                 215                 220

Trp Asn Lys Gly Ile Val Gly His Val Ala Ala Leu Gly Glu Pro Leu

225                 230                 235                 240

Asn Ile Lys Asp Ala Tyr Glu Asp Pro Arg Phe Asn Ala Glu Val Asp

                245                 250                 255

Gln Ile Thr Gly Tyr Lys Thr Gln Ser Ile Leu Cys Met Pro Ile Lys

            260                 265                 270

Asn His Arg Glu Glu Val Val Gly Val Ala Gln Ala Ile Asn Lys Lys

        275                 280                 285

Ser Gly Asn Gly Gly Thr Phe Thr Glu Lys Asp Glu Lys Asp Phe Ala

    290                 295                 300

Ala Tyr Leu Ala Phe Cys Gly Ile Val Leu His Asn Ala Gln Leu Tyr

305                 310                 315                 320

Glu Thr Ser Leu Leu Glu Asn Lys Arg Asn Gln Val Leu Leu Asp Leu

                325                 330                 335

Ala Ser Leu Ile Phe Glu Glu Gln Gln Ser Leu Glu Val Ile Leu Lys

            340                 345                 350

Lys Ile Ala Ala Thr Ile Ile Ser Phe Met Gln Val Gln Lys Cys Thr

        355                 360                 365

Ile Phe Ile Val Asp Glu Asp Cys Ser Asp Ser Phe Ser Ser Val Phe

    370                 375                 380

His Met Glu Cys Glu Glu Leu Glu Lys Ser Ser Asp Thr Leu Thr Arg

385                 390                 395                 400

Glu His Asp Ala Asn Lys Ile Asn Tyr Met Tyr Ala Gln Tyr Val Lys

                405                 410                 415

Asn Thr Met Glu Pro Leu Asn Ile Pro Asp Val Ser Lys Asp Lys Arg

            420                 425                 430

Phe Pro Trp Thr Thr Glu Asn Thr Gly Asn Val Asn Gln Gln Cys Ile

        435                 440                 445

Arg Ser Leu Leu Cys Thr Pro Ile Lys Asn Gly Lys Lys Asn Lys Val

    450                 455                 460

Ile Gly Val Cys Gln Leu Val Asn Lys Met Glu Glu Asn Thr Gly Lys

465                 470                 475                 480

Val Lys Pro Phe Asn Arg Asn Asp Glu Gln Phe Leu Glu Ala Phe Val

                485                 490                 495

Ile Phe Cys Gly Leu Gly Ile Gln Asn Thr Gln Met Tyr Glu Ala Val

            500                 505                 510

Glu Arg Ala Met Ala Lys Gln Met Val Thr Leu Glu Val Leu Ser Tyr

        515                 520                 525

His Ala Ser Ala Ala Glu Glu Glu Thr Arg Glu Leu Gln Ser Leu Ala

    530                 535                 540

Ala Ala Val Val Pro Ser Ala Gln Thr Leu Lys Ile Thr Asp Phe Ser

545                 550                 555                 560

Phe Ser Asp Phe Glu Leu Ser Asp Leu Glu Thr Ala Leu Cys Thr Ile

                565                 570                 575

Arg Met Phe Thr Asp Leu Asn Leu Val Gln Asn Phe Gln Met Lys His

            580                 585                 590

Glu Val Leu Cys Arg Trp Ile Leu Ser Val Lys Lys Asn Tyr Arg Lys

        595                 600                 605

Asn Val Ala Tyr His Asn Trp Arg His Ala Phe Asn Thr Ala Gln Cys

    610                 615                 620

Met Phe Ala Ala Leu Lys Ala Gly Lys Ile Gln Asn Lys Leu Thr Asp

625                 630                 635                 640

Leu Glu Ile Leu Ala Leu Leu Ile Ala Ala Leu Ser His Asp Leu Asp

                645                 650                 655

His Arg Gly Val Asn Asn Ser Tyr Ile Gln Arg Ser Glu His Pro Leu

            660                 665                 670

Ala Gln Leu Tyr Cys His Ser Ile Met Glu His His His Phe Asp Gln

        675                 680                 685

Cys Leu Met Ile Leu Asn Ser Pro Gly Asn Gln Ile Leu Ser Gly Leu

    690                 695                 700

Ser Ile Glu Glu Tyr Lys Thr Thr Leu Lys Ile Ile Lys Gln Ala Ile

705                 710                 715                 720

Leu Ala Thr Asp Leu Ala Leu Tyr Ile Lys Arg Arg Gly Glu Phe Phe

                725                 730                 735

Glu Leu Ile Arg Lys Asn Gln Phe Asn Leu Glu Asp Pro His Gln Lys

            740                 745                 750

Glu Leu Phe Leu Ala Met Leu Met Thr Ala Cys Asp Leu Ser Ala Ile

        755                 760                 765

Thr Lys Pro Trp Pro Ile Gln Gln Arg Ile Ala Glu Leu Val Ala Thr

    770                 775                 780

Glu Phe Phe Asp Gln Gly Asp Arg Glu Arg Lys Glu Leu Asn Ile Glu

785                 790                 795                 800

Pro Thr Asp Leu Met Asn Arg Glu Lys Lys Asn Lys Ile Pro Ser Met

                805                 810                 815

Gln Val Gly Phe Ile Asp Ala Ile Cys Leu Gln Leu Tyr Glu Ala Leu

            820                 825                 830

Thr His Val Ser Glu Asp Cys Phe Pro Leu Leu Asp Gly Cys Arg Lys

        835                 840                 845

Asn Arg Gln Lys Trp Gln Ala Leu Ala Glu Gln Gln Glu Lys Met Leu

    850                 855                 860

Ile Asn Gly Glu Ser Gly Gln Ala Lys Arg Asn

865                 870                 875

<210>  7

<211>  260

<212>  PRT

<213>  智人(Homo Sapiens)

<400>  7

Met Ser His His Trp Gly Tyr Gly Lys His Asn Gly Pro Glu His Trp

1               5                   10                  15

His Lys Asp Phe Pro Ile Ala Lys Gly Glu Arg Gln Ser Pro Val Asp

            20                  25                  30

Ile Asp Thr His Thr Ala Lys Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Pro Leu Ser

        35                  40                  45

Val Ser Tyr Asp Gln Ala Thr Ser Leu Arg Ile Leu Asn Asn Gly His

    50                  55                  60

Ala Phe Asn Val Glu Phe Asp Asp Ser Gln Asp Lys Ala Val Leu Lys

65                  70                  75                  80

Gly Gly Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Arg Leu Ile Gln Phe His Phe His

                85                  90                  95

Trp Gly Ser Leu Asp Gly Gln Gly Ser Glu His Thr Val Asp Lys Lys

            100                 105                 110

Lys Tyr Ala Ala Glu Leu His Leu Val His Trp Asn Thr Lys Tyr Gly

        115                 120                 125

Asp Phe Gly Lys Ala Val Gln Gln Pro Asp Gly Leu Ala Val Leu Gly

    130                 135                 140

Ile Phe Leu Lys Val Gly Ser Ala Lys Pro Gly Leu Gln Lys Val Val

145                 150                 155                 160

Asp Val Leu Asp Ser Ile Lys Thr Lys Gly Lys Ser Ala Asp Phe Thr

                165                 170                 175

Asn Phe Asp Pro Arg Gly Leu Leu Pro Glu Ser Leu Asp Tyr Trp Thr

            180                 185                 190

Tyr Pro Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Leu Leu Glu Cys Val Thr Trp

        195                 200                 205

Ile Val Leu Lys Glu Pro Ile Ser Val Ser Ser Glu Gln Val Leu Lys

    210                 215                 220

Phe Arg Lys Leu Asn Phe Asn Gly Glu Gly Glu Pro Glu Glu Leu Met

225                 230                 235                 240

Val Asp Asn Trp Arg Pro Ala Gln Pro Leu Lys Asn Arg Gln Ile Lys

                245                 250                 255

Ala Ser Phe Lys

            260

<210>  8

<211>  1492

<212>  DNA

<213>  智人(Homo Sapiens)

<400>  8

acacagtgca ggcgcccaag ccgccgccgc cagatcggtg ccgattcctg ccctgccccg      60

accgccagcg cgaccatgtc ccatcactgg gggtacggca aacacaacgg acctgagcac     120

tggcataagg acttccccat cccctgtctg tttcctatga tcaagcaact tccctgagga     180

tcctcaacaa tggtcatgct ttcaacgtgg agtttgatga ctctcaggac aaagcagtgc     240

tcaagggagg acccctggat ggcacttaca gattgattca gtttcacttt cactggggtt     300

cacttgatgg acaaggttca gagcatactg tggataaaaa gaaatatgct gcagaacttc     360

acttggttca ctggaacacc aaatatgggg attttgggaa agctgtgcag caacctgatg     420

gactggccgt tctaggtatt tttttgaagg ttggcagcgc taaaccgggc cttcagaaag     480

ttgttgatgt gctggattcc attaaaacaa agggcaagag tgctgacttc actaacttcg     540

atcctcgtgg cctccttcct gaatccttgg attactggac ctacccaggc tcactgacca     600

cccctcctct tctggaatgt gtgacctgga ttgtgctcaa ggaacccatc agcgtcagca     660

gcgagcaggt gttgaaattc cgtaaactta acttcaatgg ggagggtgaa cccgaagaac     720

tgatggtgga caactggcgc ccagctcagc cactgaagaa caggcaaatc aaagcttcct     780

tcaaataaga tggtcccata gtctgtatcc aaataatgaa tcttcgggtg tttcccttta     840

gctaagcaca gatctacctt ggtgatttgg accctggttg ctttgtgtct agttttctag     900

acccttcatc tcttacttga tagacttact aataaaatgt gaagactaga ccaattgtca     960

tgcttgacac aactgctgtg gctggttggt gctttgttta tggtagtagt ttttctgtaa    1020

cacagaatat aggataagaa ataagaataa agtaccttga ctttgttcac agcatgtagg    1080

gtgatgagca ctcacaattg ttgactaaaa tgctgctttt aaaacatagg aaagtagaat    1140

ggttgagtgc aaatccatag cacaagataa attgagctag ttaaggcaaa tcaggtaaaa    1200

tagtcatgat tctatgtaat gtaaaccaga aaaaataaat gttcatgatt tcaagatgtt    1260

atattaaaga aaaactttaa aaattattat atatttatag caaagttatc ttaaatatga    1320

attctgttgt aatttaatga cttttgaatt acagagatat aaatgaagta ttatctgtaa    1380

aaattgttat aattagagtt gtgatacaga gtatatttcc attcagacaa tatatcataa    1440

cttaataaat attgtatttt agatatattc tctaataaaa ttcagaattc ta            1492

<210>  9

<211>  595

<212>  PRT

<213>  智人(Homo Sapiens)

<400>  9

Met Thr Met Thr Leu His Thr Lys Ala Ser Gly Met Ala Leu Leu His

1               5                   10                  15

Gln Ile Gln Gly Asn Glu Leu Glu Pro Leu Asn Arg Pro Gln Leu Lys

            20                  25                  30

Ile Pro Leu Glu Arg Pro Leu Gly Glu Val Tyr Leu Asp Ser Ser Lys

        35                  40                  45

Pro Ala Val Tyr Asn Tyr Pro Glu Gly Ala Ala Tyr Glu Phe Asn Ala

    50                  55                  60

Ala Ala Ala Ala Asn Ala Gln Val Tyr Gly Gln Thr Gly Leu Pro Tyr

65                  70                  75                  80

Gly Pro Gly Ser Glu Ala Ala Ala Phe Gly Ser Asn Gly Leu Gly Gly

                85                  90                  95

Phe Pro Pro Leu Asn Ser Val Ser Pro Ser Pro Leu Met Leu Leu His

            100                 105                 110

Pro Pro Pro Gln Leu Ser Pro Phe Leu Gln Pro His Gly Gln Gln Val

        115                 120                 125

Pro Tyr Tyr Leu Glu Asn Glu Pro Ser Gly Tyr Thr Val Arg Glu Ala

    130                 135                 140

Gly Pro Pro Ala Phe Tyr Arg Pro Asn Ser Asp Asn Arg Arg Gln Gly

145                 150                 155                 160

Gly Arg Glu Arg Leu Ala Ser Thr Asn Asp Lys Gly Ser Met Ala Met

                165                 170                 175

Glu Ser Ala Lys Glu Thr Arg Tyr Cys Ala Val Cys Asn Asp Tyr Ala

            180                 185                 190

Ser Gly Tyr His Tyr Gly Val Trp Ser Cys Glu Gly Cys Lys Ala Phe

        195                 200                 205

Phe Lys Arg Ser Ile Gln Gly His Asn Asp Tyr Met Cys Pro Ala Thr

    210                 215                 220

Asn Gln Cys Thr Ile Asp Lys Asn Arg Arg Lys Ser Cys Gln Ala Cys

225                 230                 235                 240

Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Val Gly Met Met Lys Gly Gly Ile Arg

                245                 250                 255

Lys Asp Arg Arg Gly Gly Arg Met Leu Lys His Lys Arg Gln Arg Asp

            260                 265                 270

Asp Gly Glu Gly Arg Gly Glu Val Gly Ser Ala Gly Asp Met Arg Ala

        275                 280                 285

Ala Asn Leu Trp Pro Ser Pro Leu Met Ile Lys Arg Ser Lys Lys Asn

    290                 295                 300

Ser Leu Ala Leu Ser Leu Thr Ala Asp Gln Met Val Ser Ala Leu Leu

305                 310                 315                 320

Asp Ala Glu Pro Pro Ile Leu Tyr Ser Glu Tyr Asp Pro Thr Arg Pro

                325                 330                 335

Phe Ser Glu Ala Ser Met Met Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asp Arg

            340                 345                 350

Glu Leu Val His Met Ile Asn Trp Ala Lys Arg Val Pro Gly Phe Val

        355                 360                 365

Asp Leu Thr Leu His Asp Gln Val His Leu Leu Glu Cys Ala Trp Leu

    370                 375                 380

Glu Ile Leu Met Ile Gly Leu Val Trp Arg Ser Met Glu His Pro Gly

385                 390                 395                 400

Lys Leu Leu Phe Ala Pro Asn Leu Leu Leu Asp Arg Asn Gln Gly Lys

                405                 410                 415

Cys Val Glu Gly Met Val Glu Ile Phe Asp Met Leu Leu Ala Thr Ser

            420                 425                 430

Ser Arg Phe Arg Met Met Asn Leu Gln Gly Glu Glu Phe Val Cys Leu

        435                 440                 445

Lys Ser Ile Ile Leu Leu Asn Ser Gly Val Tyr Thr Phe Leu Ser Ser

    450                 455                 460

Thr Leu Lys Ser Leu Glu Glu Lys Asp His Ile His Arg Val Leu Asp

465                 470                 475                 480

Lys Ile Thr Asp Thr Leu Ile His Leu Met Ala Lys Ala Gly Leu Thr

                485                 490                 495

Leu Gln Gln Gln His Gln Arg Leu Ala Gln Leu Leu Leu Ile Leu Ser

            500                 505                 510

His Ile Arg His Met Ser Asn Lys Gly Met Glu His Leu Tyr Ser Met

        515                 520                 525

Lys Cys Lys Asn Val Val Pro Leu Tyr Asp Leu Leu Leu Glu Met Leu

    530                 535                 540

Asp Ala His Arg Leu His Ala Pro Thr Ser Arg Gly Gly Ala Ser Val

545                 550                 555                 560

Glu Glu Thr Asp Gln Ser His Leu Ala Thr Ala Gly Ser Thr Ser Ser

                565                 570                 575

His Ser Leu Gln Lys Tyr Tyr Ile Thr Gly Glu Ala Glu Gly Phe Pro

            580                 585                 590

Ala Thr Val

        595

<210>  10

<211>  22

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  10

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1               5                   10                  15

Leu Ser Gly Ala Arg Cys

            20

<210>  11

<211>  66

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  11

atggacatgc gggtgcctgc acaacttctg ggcctgctgt tgttgtggct gtctggagcc      60

cggtgt                                                                 66

<210>  12

<211>  114

<212>  PRT

<213>  智人(Homo Sapiens)

<400>  12

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

1               5                   10                  15

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

            20                  25                  30

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

        35                  40                  45

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

    50                  55                  60

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

65                  70                  75                  80

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

                85                  90                  95

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

            100                 105                 110

Thr Ser

<210>  13

<211>  342

<212>  DNA

<213>  智人(Homo Sapiens)

<400>  13

aattgggtaa atgttatcag tgatctcaag aagatagagg atctcatcca gtccatgcat      60

attgatgcca cgctgtacac agaaagcgat gtgcatccta gctgtaaggt gacagcgatg     120

aagtgttttc ttttggagct gcaggtaatt agtcttgagt ccggcgatgc cagcattcat     180

gataccgtag aaaacttgat tatcctggcc aacaattctc tgtcctcaaa cggaaacgta     240

accgagagcg gttgtaaaga atgtgaagaa ctggaagaaa agaacatcaa ggagtttctg     300

caatcattcg ttcacatcgt acaaatgttc ataaatacgt ca                        342

<210>  14

<211>  30

<212>  PRT

<213>  人工序列(ARtificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  14

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

1               5                   10                  15

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

            20                  25                  30

<210>  15

<211>  90

<212>  DNA

<213>  人工序列(ARtificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  15

ggatctggtt ctggttccgg aagtggatct ggttcagggt ccggtagtgg atctgggtca      60

ggaagtggaa gcggtagtgg gtctggatct                                       90

<210>  16

<211>  8

<212>  PRT

<213>  人工序列(ARtificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  16

Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn

1               5

<210>  17

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列(ARtificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  17

aaacaagagc actttcctga taac                                             24

<210>  18

<211>  21

<212>  PRT

<213>  人工序列(ARtificial SEquence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  18

Leu Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly Ile Phe

1               5                   10                  15

Val Ile Cys Cys Leu

            20

<210>  19

<211>  63

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  19

ctgttgccga gctgggcgat tacgcttatc agtgtaaacg gcatctttgt aatatgctgt      60

ctg                                                                    63

<210>  20

<211>  25

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  20

Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg Arg Arg Asn Glu Arg

1               5                   10                  15

Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val

            20                  25

<210>  21

<211>  75

<212>  DNA

<213>  人工序列(ARtificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  21

acctactgct tcgcaccaag gtgccgggag agaaggagaa atgaaagact gagaagggag      60

agcgtgagac ctgtg                                                       75

<210>  22

<211>  25

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  22

Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg Ala Arg Asn Glu Arg

1               5                   10                  15

Leu Arg Arg Glu Thr Val Arg Pro Val

            20                  25

<210>  23

<211>  75

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  23

acctactgct tcgcaccaag gtgccgggag agagcaagaa atgaaagact gagaagggag      60

accgtgagac ctgtg                                                       75

<210>  24

<211>  2

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial SEquence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  24

Gly Ser

1

<210>  25

<211>  6

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  25

ggatcc                                                                  6

<210>  26

<211>  208

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  26

Ser His His Trp Gly Tyr Gly Lys His Asn Gly Pro Glu His Trp His

1               5                   10                  15

Lys Asp Phe Pro Ile Ala Lys Gly Glu Arg Gln Ser Pro Val Asp Ile

            20                  25                  30

Asp Thr His Thr Ala Lys Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Pro Leu Ser Val

        35                  40                  45

Ser Tyr Asp Gln Ala Thr Ser Leu Arg Ile Leu Asn Asn Gly His Ala

    50                  55                  60

Phe Asn Val Glu Phe Asp Asp Ser Gln Asp Lys Ala Val Leu Lys Gly

65                  70                  75                  80

Gly Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Arg Leu Ile Gln Phe His Phe His Trp

                85                  90                  95

Gly Ser Leu Asp Gly Gln Gly Ser Glu His Thr Val Asp Lys Lys Asp

            100                 105                 110

Ser Ile Lys Thr Lys Gly Lys Ser Ala Asp Phe Thr Asn Phe Asp Pro

        115                 120                 125

Arg Gly Leu Leu Pro Glu Ser Leu Asp Tyr Trp Thr Tyr Pro Gly Ser

    130                 135                 140

Leu Thr Thr Pro Pro Leu Leu Glu Cys Val Thr Trp Ile Val Leu Lys

145                 150                 155                 160

Glu Pro Ile Ser Val Ser Ser Glu Gln Val Leu Lys Phe Arg Lys Leu

                165                 170                 175

Asn Phe Asn Gly Glu Gly Glu Pro Glu Glu Leu Met Val Asp Asn Trp

            180                 185                 190

Arg Pro Ala Gln Pro Leu Lys Asn Arg Gln Ile Lys Ala Ser Phe Lys

        195                 200                 205

<210>  27

<211>  777

<212>  DNA

<213>  人工序列(ARtificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  27

tcccatcact gggggtacgg caaacacaac ggacctgagc actggcataa ggacttcccc      60

attgccaagg gagagcgcca gtcccctgtt gacatcgaca ctcatacagc caagtatgac     120

ccttccctga agcccctgtc tgtttcctat gatcaagcaa cttccctgag aatcctcaac     180

aatggtcatg ctttcaacgt ggagtttgat gactctcagg acaaagcagt gctcaaggga     240

ggacccctgg atggcactta cagattgatt cagtttcact ttcactgggg ttcacttgat     300

ggacaaggtt cagagcatac tgtggataaa aagaaatatg ctgcagaact tcacttggtt     360

cactggaaca ccaaatatgg ggattttggg aaagctgtgc agcaacctga tggactggcc     420

gttctaggta tttttttgaa ggttggcagc gctaaaccgg gccatcagaa agttgttgat     480

gtgctggatt ccattaaaac aaagggcaag agtgctgact tcactaactt cgatcctcgt     540

ggcctccttc ctgaatccct ggattactgg acctacccag gctcactgac cacccctcct     600

cttctggaat gtgtgacctg gattgtgctc aaggaaccca tcagcgtcag cagcgagcag     660

gtgttgaaat tccgtaaact taacttcaat ggggagggtg aacccgaaga actgatggtg     720

gacaactggc gcccagctca gccactgaag aacaggcaaa tcaaagcttc cttcaaa        777

<210>  28

<211>  222

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  28

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1               5                   10                  15

Leu Ser Gly Ala Arg Cys Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys

            20                  25                  30

Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr

        35                  40                  45

Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys

    50                  55                  60

Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser

65                  70                  75                  80

Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu

                85                  90                  95

Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu

            100                 105                 110

Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile

        115                 120                 125

Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

    130                 135                 140

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

145                 150                 155                 160

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn Leu Leu

                165                 170                 175

Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly Ile Phe Val Ile

            180                 185                 190

Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg Arg Arg

        195                 200                 205

Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val Gly Ser

    210                 215                 220

<210>  29

<211>  666

<212>  DNA

<213>  人工序列(ARtificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  29

atggacatgc gggtgcctgc acaacttctg ggcctgctgt tgttgtggct gtctggagcc      60

cggtgtaatt gggtaaatgt tatcagtgat ctcaagaaga tagaggatct catccagtcc     120

atgcatattg atgccacgct gtacacagaa agcgatgtgc atcctagctg taaggtgaca     180

gcgatgaagt gttttctttt ggagctgcag gtaattagtc ttgagtccgg cgatgccagc     240

attcatgata ccgtagaaaa cttgattatc ctggccaaca attctctgtc ctcaaacgga     300

aacgtaaccg agagcggttg taaagaatgt gaagaactgg aagaaaagaa catcaaggag     360

tttctgcaat cattcgttca catcgtacaa atgttcataa atacgtcagg atctggttct     420

ggttccggaa gtggatctgg ttcagggtcc ggtagtggat ctgggtcagg aagtggaagc     480

ggtagtgggt ctggatctaa acaagagcac tttcctgata acctgttgcc gagctgggcg     540

attacgctta tcagtgtaaa cggcatcttt gtaatatgct gtctgaccta ctgcttcgca     600

ccaaggtgcc gggagagaag gagaaatgaa agactgagaa gggagagcgt gagacctgtg     660

ggatcc                                                                666

<210>  30

<211>  430

<212>  PRT

<213>  人工序列(ARtificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  30

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1               5                   10                  15

Leu Ser Gly Ala Arg Cys Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys

            20                  25                  30

Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr

        35                  40                  45

Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys

    50                  55                  60

Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser

65                  70                  75                  80

Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu

                85                  90                  95

Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu

            100                 105                 110

Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile

        115                 120                 125

Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

    130                 135                 140

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

145                 150                 155                 160

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn Leu Leu

                165                 170                 175

Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly Ile Phe Val Ile

            180                 185                 190

Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg Arg Arg

        195                 200                 205

Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val Gly Ser Ser His

    210                 215                 220

His Trp Gly Tyr Gly Lys His Asn Gly Pro Glu His Trp His Lys Asp

225                 230                 235                 240

Phe Pro Ile Ala Lys Gly Glu Arg Gln Ser Pro Val Asp Ile Asp Thr

                245                 250                 255

His Thr Ala Lys Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Pro Leu Ser Val Ser Tyr

            260                 265                 270

Asp Gln Ala Thr Ser Leu Arg Ile Leu Asn Asn Gly His Ala Phe Asn

        275                 280                 285

Val Glu Phe Asp Asp Ser Gln Asp Lys Ala Val Leu Lys Gly Gly Pro

    290                 295                 300

Leu Asp Gly Thr Tyr Arg Leu Ile Gln Phe His Phe His Trp Gly Ser

305                 310                 315                 320

Leu Asp Gly Gln Gly Ser Glu His Thr Val Asp Lys Lys Asp Ser Ile

                325                 330                 335

Lys Thr Lys Gly Lys Ser Ala Asp Phe Thr Asn Phe Asp Pro Arg Gly

            340                 345                 350

Leu Leu Pro Glu Ser Leu Asp Tyr Trp Thr Tyr Pro Gly Ser Leu Thr

        355                 360                 365

Thr Pro Pro Leu Leu Glu Cys Val Thr Trp Ile Val Leu Lys Glu Pro

    370                 375                 380

Ile Ser Val Ser Ser Glu Gln Val Leu Lys Phe Arg Lys Leu Asn Phe

385                 390                 395                 400

Asn Gly Glu Gly Glu Pro Glu Glu Leu Met Val Asp Asn Trp Arg Pro

                405                 410                 415

Ala Gln Pro Leu Lys Asn Arg Gln Ile Lys Ala Ser Phe Lys

            420                 425                 430

<210>  31

<211>  1443

<212>  DNA

<213>  人工序列(ARtificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  31

atggacatgc gggtgcctgc acaacttctg ggcctgctgt tgttgtggct gtctggagcc      60

cggtgtaatt gggtaaatgt tatcagtgat ctcaagaaga tagaggatct catccagtcc     120

atgcatattg atgccacgct gtacacagaa agcgatgtgc atcctagctg taaggtgaca     180

gcgatgaagt gttttctttt ggagctgcag gtaattagtc ttgagtccgg cgatgccagc     240

attcatgata ccgtagaaaa cttgattatc ctggccaaca attctctgtc ctcaaacgga     300

aacgtaaccg agagcggttg taaagaatgt gaagaactgg aagaaaagaa catcaaggag     360

tttctgcaat cattcgttca catcgtacaa atgttcataa atacgtcagg atctggttct     420

ggttccggaa gtggatctgg ttcagggtcc ggtagtggat ctgggtcagg aagtggaagc     480

ggtagtgggt ctggatctaa acaagagcac tttcctgata acctgttgcc gagctgggcg     540

attacgctta tcagtgtaaa cggcatcttt gtaatatgct gtctgaccta ctgcttcgca     600

ccaaggtgcc gggagagaag gagaaatgaa agactgagaa gggagagcgt gagacctgtg     660

ggatcctccc atcactgggg gtacggcaaa cacaacggac ctgagcactg gcataaggac     720

ttccccattg ccaagggaga gcgccagtcc cctgttgaca tcgacactca tacagccaag     780

tatgaccctt ccctgaagcc cctgtctgtt tcctatgatc aagcaacttc cctgagaatc     840

ctcaacaatg gtcatgcttt caacgtggag tttgatgact ctcaggacaa agcagtgctc     900

aagggaggac ccctggatgg cacttacaga ttgattcagt ttcactttca ctggggttca     960

cttgatggac aaggttcaga gcatactgtg gataaaaaga aatatgctgc agaacttcac    1020

ttggttcact ggaacaccaa atatggggat tttgggaaag ctgtgcagca acctgatgga    1080

ctggccgttc taggtatttt tttgaaggtt ggcagcgcta aaccgggcca tcagaaagtt    1140

gttgatgtgc tggattccat taaaacaaag ggcaagagtg ctgacttcac taacttcgat    1200

cctcgtggcc tccttcctga atccctggat tactggacct acccaggctc actgaccacc    1260

cctcctcttc tggaatgtgt gacctggatt gtgctcaagg aacccatcag cgtcagcagc    1320

gagcaggtgt tgaaattccg taaacttaac ttcaatgggg agggtgaacc cgaagaactg    1380

atggtggaca actggcgccc agctcagcca ctgaagaaca ggcaaatcaa agcttccttc    1440

aaa                                                                  1443

<210>  32

<211>  51

<212>  DNA

<213>  人工序列(ARtificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  32

atgtggctgc agtctctgct cctcttgggg actgtcgcct gttctatttc a               51

<210>  33

<211>  17

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  33

Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile

1               5                   10                  15

Ser

<210>  34

<211>  399

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  34

caaggacagg atcgacatat gattcggatg cgccaactga tagatatagt cgatcaactc      60

aagaattatg tgaatgactt ggtccctgag tttctgccgg ctccagagga cgttgaaaca     120

aactgtgaat ggtcagcgtt ttcatgtttt caaaaggcac agctcaagtc cgccaataca     180

ggcaataacg agcggattat aaatgtctca attaaaaagc tcaagcgcaa acccccttca     240

acgaatgctg gtcgccgcca gaaacacagg ttgacctgtc cctcctgtga ctcatacgag     300

aagaaacctc ccaaggaatt tctcgaacgc tttaagtcac tcttgcagaa gatgattcat     360

cagcacttga gtagccggac acatggttca gaggatagt                            399

<210>  35

<211>  133

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  35

Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile

1               5                   10                  15

Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu

            20                  25                  30

Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser

        35                  40                  45

Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu

    50                  55                  60

Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser

65                  70                  75                  80

Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys

                85                  90                  95

Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys

            100                 105                 110

Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His

        115                 120                 125

Gly Ser Glu Asp Ser

    130

<210>  36

<211>  36

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  36

gagtctaagt atggcccacc gtgtcccccc tgccca                                36

<210>  37

<211>  12

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  37

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1               5                   10

<210>  38

<211>  651

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  38

gcacctgagt tcctcggagg cccctctgta ttcctgtttc ccccaaagcc caaggatact      60

cttatgatct cacgcactcc ggaagtaacc tgcgtggtgg tggatgtgag tcaggaagac     120

cccgaagtcc agtttaattg gtacgtggac ggggttgagg tacataacgc caaaacgaaa     180

cctcgggagg agcaattcaa ttccacttac cgggttgtat cagtcctgac tgtactgcat     240

caagattggc tcaacgggaa agagtacaag tgtaaggtta gtaataaagg gctgccgtct     300

agtattgaga aaacgatcag taaggctaaa gggcagccaa gagagccaca agtatatacc     360

ctgccaccct ctcaggagga gatgactaaa aaccaagtgt cactgacctg ccttgttaag     420

ggtttttacc catctgatat agcagtagag tgggaatcca atggacagcc agagaacaat     480

tataagacta cacctcccgt ccttgatagt gacggctcct tcttcttgta ttctcgactt     540

acagttgata agtcccgctg gcaggagggt aatgtcttta gctgcagtgt aatgcacgaa     600

gctcttcata atcactacac acaaaaatca ttgagcctgt ctctgggaaa g              651

<210>  39

<211>  217

<212>  PRT

<213>  人工序列(ARtificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  39

Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1               5                   10                  15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

            20                  25                  30

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

        35                  40                  45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

    50                  55                  60

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65                  70                  75                  80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

                85                  90                  95

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

            100                 105                 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met

        115                 120                 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

    130                 135                 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145                 150                 155                 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

                165                 170                 175

Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val

            180                 185                 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

        195                 200                 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

    210                 215

<210>  40

<211>  66

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  40

atggccttga ttgtgctcgg cggagttgca ggcctgctcc tttttattgg actcggaata      60

tttttc                                                                 66

<210>  41

<211>  22

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  41

Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile

1               5                   10                  15

Gly Leu Gly Ile Phe Phe

            20

<210>  42

<211>  9

<212>  DNA

<213>  人工序列(ARtificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  42

ggatctgga                                                               9

<210>  43

<211>  3

<212>  PRT

<213>  人工序列(ARtificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  43

Gly Ser Gly

1

<210>  44

<211>  57

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  44

gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacct         57

<210>  45

<211>  19

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  45

Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn

1               5                   10                  15

Pro Gly Pro

<210>  46

<211>  762

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  46

atggagtacg ctagtgatgc gtccttggac cccgaggcgc catggccacc ggccccgcga      60

gctcgagcct gtcgagtgct gccatgggct ctggtcgctg ggttgctcct ccttctgctt     120

ttggccgcgg cttgtgcagt gtttcttgct tgcccgtggg cagttagcgg tgctcgcgca     180

tctcccggaa gcgcggcgag tcctcgactc agggaaggtc cggagctgag cccagatgac     240

cccgccggtt tgctggacct ccgccaagga atgttcgctc aactcgttgc gcaaaacgta     300

cttcttatag acggccctct tagttggtac agtgacccag gattggctgg cgttagtttg     360

acaggcggac tcagttacaa ggaggatact aaggaactgg tagtcgctaa ggctggggta     420

tactacgtgt tctttcaact cgaactgaga agggtggttg cgggagaagg atctggaagt     480

gtatctctcg ccctgcacct ccaacccctc agaagtgccg ccggagcggc cgcccttgcc     540

cttactgtcg acctgccccc ggcttcttca gaagcgcgaa atagtgcatt cggcttccag     600

gggcgccttt tgcacttgag cgctggacag cgcctcgggg tccacctcca cacggaagcg     660

cgggcgaggc acgcttggca actcacacaa ggtgcgacgg ttctcggctt gtttagggtt     720

acgcctgaga taccggctgg cctcccatct ccaagatccg ag                        762

<210>  47

<211>  254

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  47

Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro

1               5                   10                  15

Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val

            20                  25                  30

Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe

        35                  40                  45

Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser

    50                  55                  60

Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp

65                  70                  75                  80

Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val

                85                  90                  95

Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp

            100                 105                 110

Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu

        115                 120                 125

Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe

    130                 135                 140

Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser

145                 150                 155                 160

Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala

                165                 170                 175

Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala

            180                 185                 190

Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala

        195                 200                 205

Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His

    210                 215                 220

Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val

225                 230                 235                 240

Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu

                245                 250

<210>  48

<211>  3

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  48

taa                                                                     3

<210>  49

<211>  2040

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  49

atgtggctgc agtctctgct cctcttgggg actgtcgcct gttctatttc acaaggacag      60

gatcgacata tgattcggat gcgccaactg atagatatag tcgatcaact caagaattat     120

gtgaatgact tggtccctga gtttctgccg gctccagagg acgttgaaac aaactgtgaa     180

tggtcagcgt tttcatgttt tcaaaaggca cagctcaagt ccgccaatac aggcaataac     240

gagcggatta taaatgtctc aattaaaaag ctcaagcgca aacccccttc aacgaatgct     300

ggtcgccgcc agaaacacag gttgacctgt ccctcctgtg actcatacga gaagaaacct     360

cccaaggaat ttctcgaacg ctttaagtca ctcttgcaga agatgattca tcagcacttg     420

agtagccgga cacatggttc agaggatagt gagtctaagt atggcccacc gtgtcccccc     480

tgcccagcac ctgagttcct cggaggcccc tctgtattcc tgtttccccc aaagcccaag     540

gatactctta tgatctcacg cactccggaa gtaacctgcg tggtggtgga tgtgagtcag     600

gaagaccccg aagtccagtt taattggtac gtggacgggg ttgaggtaca taacgccaaa     660

acgaaacctc gggaggagca attcaattcc acttaccggg ttgtatcagt cctgactgta     720

ctgcatcaag attggctcaa cgggaaagag tacaagtgta aggttagtaa taaagggctg     780

ccgtctagta ttgagaaaac gatcagtaag gctaaagggc agccaagaga gccacaagta     840

tataccctgc caccctctca ggaggagatg actaaaaacc aagtgtcact gacctgcctt     900

gttaagggtt tttacccatc tgatatagca gtagagtggg aatccaatgg acagccagag     960

aacaattata agactacacc tcccgtcctt gatagtgacg gctccttctt cttgtattct    1020

cgacttacag ttgataagtc ccgctggcag gagggtaatg tctttagctg cagtgtaatg    1080

cacgaagctc ttcataatca ctacacacaa aaatcattga gcctgtctct gggaaagatg    1140

gccttgattg tgctcggcgg agttgcaggc ctgctccttt ttattggact cggaatattt    1200

ttcggatctg gagctactaa cttcagcctg ctgaagcagg ctggagacgt ggaggagaac    1260

cctggaccta tggagtacgc tagtgatgcg tccttggacc ccgaggcgcc atggccaccg    1320

gccccgcgag ctcgagcctg tcgagtgctg ccatgggctc tggtcgctgg gttgctcctc    1380

cttctgcttt tggccgcggc ttgtgcagtg tttcttgctt gcccgtgggc agttagcggt    1440

gctcgcgcat ctcccggaag cgcggcgagt cctcgactca gggaaggtcc ggagctgagc    1500

ccagatgacc ccgccggttt gctggacctc cgccaaggaa tgttcgctca actcgttgcg    1560

caaaacgtac ttcttataga cggccctctt agttggtaca gtgacccagg attggctggc    1620

gttagtttga caggcggact cagttacaag gaggatacta aggaactggt agtcgctaag    1680

gctggggtat actacgtgtt ctttcaactc gaactgagaa gggtggttgc gggagaagga    1740

tctggaagtg tatctctcgc cctgcacctc caacccctca gaagtgccgc cggagcggcc    1800

gcccttgccc ttactgtcga cctgcccccg gcttcttcag aagcgcgaaa tagtgcattc    1860

ggcttccagg ggcgcctttt gcacttgagc gctggacagc gcctcggggt ccacctccac    1920

acggaagcgc gggcgaggca cgcttggcaa ctcacacaag gtgcgacggt tctcggcttg    1980

tttagggtta cgcctgagat accggctggc ctcccatctc caagatccga gggatcctaa    2040

<210>  50

<211>  679

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  50

Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile

1               5                   10                  15

Ser Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp

            20                  25                  30

Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe

        35                  40                  45

Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe

    50                  55                  60

Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn

65                  70                  75                  80

Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro

                85                  90                  95

Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser

            100                 105                 110

Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe

        115                 120                 125

Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr

    130                 135                 140

His Gly Ser Glu Asp Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro

145                 150                 155                 160

Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

                165                 170                 175

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

            180                 185                 190

Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

        195                 200                 205

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

    210                 215                 220

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

225                 230                 235                 240

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

                245                 250                 255

Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

            260                 265                 270

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu

        275                 280                 285

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

    290                 295                 300

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

305                 310                 315                 320

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

                325                 330                 335

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

            340                 345                 350

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

        355                 360                 365

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Ala Leu Ile Val

    370                 375                 380

Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile Gly Leu Gly Ile Phe

385                 390                 395                 400

Phe Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp

                405                 410                 415

Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu

            420                 425                 430

Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg

        435                 440                 445

Val Leu Pro Trp Ala Leu Val Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu

    450                 455                 460

Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly

465                 470                 475                 480

Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly

                485                 490                 495

Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln

            500                 505                 510

Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly

        515                 520                 525

Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr

    530                 535                 540

Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys

545                 550                 555                 560

Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val

                565                 570                 575

Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro

            580                 585                 590

Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu

        595                 600                 605

Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly

    610                 615                 620

Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His

625                 630                 635                 640

Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr

                645                 650                 655

Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro

            660                 665                 670

Ser Pro Arg Ser Glu Gly Ser

        675

<210>  51

<211>  9772

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  51

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ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac     360

ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag     420

acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa     480

actggaacaa cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg     540

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aaaatattaa cgcttacaat ttaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta     660

tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat     720

aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc     780

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ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg    1020

gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc    1080

atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata    1140

acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt    1200

tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag    1260

ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca    1320

aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg    1380

aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg    1440

ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag    1500

atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg    1560

aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag    1620

accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga    1680

tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt    1740

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cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac    1920

caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac    1980

cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt    2040

cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct    2100

gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat    2160

acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt    2220

atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg    2280

cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt    2340

gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt    2400

tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg    2460

tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg    2520

agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc    2580

ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg    2640

gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac    2700

actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag    2760

gaaacagcta tgaccatgat tacgccaagc gcgcaattaa ccctcactaa agggaacaaa    2820

agctggagct gcaagcttaa tgtagtctta tgcaatactc ttgtagtctt gcaacatggt    2880

aacgatgagt tagcaacatg ccttacaagg agagaaaaag caccgtgcat gccgattggt    2940

ggaagtaagg tggtacgatc gtgccttatt aggaaggcaa cagacgggtc tgacatggat    3000

tggacgaacc actgaattgc cgcattgcag agatattgta tttaagtgcc tagctcgata    3060

cataaacggg tctctctggt tagaccagat ctgagcctgg gagctctctg gctaactagg    3120

gaacccactg cttaagcctc aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag tgtgtgcccg    3180

tctgttgtgt gactctggta actagagatc cctcagaccc ttttagtcag tgtggaaaat    3240

ctctagcagt ggcgcccgaa cagggacttg aaagcgaaag ggaaaccaga ggagctctct    3300

cgacgcagga ctcggcttgc tgaagcgcgc acggcaagag gcgaggggcg gcgactggtg    3360

agtacgccaa aaattttgac tagcggaggc tagaaggaga gagatgggtg cgagagcgtc    3420

agtattaagc gggggagaat tagatcgcga tgggaaaaaa ttcggttaag gccaggggga    3480

aagaaaaaat ataaattaaa acatatagta tgggcaagca gggagctaga acgattcgca    3540

gttaatcctg gcctgttaga aacatcagaa ggctgtagac aaatactggg acagctacaa    3600

ccatcccttc agacaggatc agaagaactt agatcattat ataatacagt agcaaccctc    3660

tattgtgtgc atcaaaggat agagataaaa gacaccaagg aagctttaga caagatagag    3720

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aggaggagat atgagggaca attggagaag tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat    3840

tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag    3900

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cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca    4020

gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg    4080

gggcatcaag cagctccagg caagaatcct ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca    4140

gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa actcatttgc accactgctg tgccttggaa    4200

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ggacagagaa attaacaatt acacaagctt aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa    4320

ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa    4380

ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta tataaaatta ttcataatga tagtaggagg    4440

cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt actttctata gtgaatagag ttaggcaggg    4500

atattcacca ttatcgtttc agacccacct cccaaccccg aggggacccg acaggcccga    4560

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atctcgacgg tatcgattag actgtagccc aggaatatgg cagctagatt gtacacattt    4680

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gccagtaaaa acagtacata cagacaatgg cagcaatttc accagtacta cagttaaggc    4860

cgcctgttgg tgggcgggga tcaagcagga atttggcatt ccctacaatc cccaaagtca    4920

aggagtaata gaatctatga ataaagaatt aaagaaaatt ataggacagg taagagatca    4980

ggctgaacat cttaagacag cagtacaaat ggcagtattc atccacaatt ttaaaagaaa    5040

aggggggatt ggggggtaca gtgcagggga aagaatagta gacataatag caacagacat    5100

acaaactaaa gaattacaaa aacaaattac aaaaattcaa aattttcggg tttattacag    5160

ggacagcaga gatccagttt ggctgcattg atcacgtgag gctccggtgc ccgtcagtgg    5220

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tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag cctcagacag tggttcaaag tttttttctt    6360

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gccaactgat agatatagtc gatcaactca agaattatgt gaatgacttg gtccctgagt    6540

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<210>  52

<211>  8436

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  52

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ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag     420

acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa     480

actggaacaa cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg     540

atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac     600

aaaatattaa cgcttacaat ttaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta     660

tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat     720

aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc     780

ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga     840

aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca     900

acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt     960

ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg    1020

gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc    1080

atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata    1140

acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt    1200

tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag    1260

ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca    1320

aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg    1380

aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg    1440

ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag    1500

atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg    1560

aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag    1620

accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga    1680

tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt    1740

tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc    1800

tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc    1860

cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac    1920

caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac    1980

cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt    2040

cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct    2100

gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat    2160

acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt    2220

atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg    2280

cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt    2340

gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt    2400

tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg    2460

tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg    2520

agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc    2580

ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg    2640

gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac    2700

actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag    2760

gaaacagcta tgaccatgat tacgccaagc gcgcaattaa ccctcactaa agggaacaaa    2820

agctggagct gcaagcttaa tgtagtctta tgcaatactc ttgtagtctt gcaacatggt    2880

aacgatgagt tagcaacatg ccttacaagg agagaaaaag caccgtgcat gccgattggt    2940

ggaagtaagg tggtacgatc gtgccttatt aggaaggcaa cagacgggtc tgacatggat    3000

tggacgaacc actgaattgc cgcattgcag agatattgta tttaagtgcc tagctcgata    3060

cataaacggg tctctctggt tagaccagat ctgagcctgg gagctctctg gctaactagg    3120

gaacccactg cttaagcctc aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag tgtgtgcccg    3180

tctgttgtgt gactctggta actagagatc cctcagaccc ttttagtcag tgtggaaaat    3240

ctctagcagt ggcgcccgaa cagggacttg aaagcgaaag ggaaaccaga ggagctctct    3300

cgacgcagga ctcggcttgc tgaagcgcgc acggcaagag gcgaggggcg gcgactggtg    3360

agtacgccaa aaattttgac tagcggaggc tagaaggaga gagatgggtg cgagagcgtc    3420

agtattaagc gggggagaat tagatcgcga tgggaaaaaa ttcggttaag gccaggggga    3480

aagaaaaaat ataaattaaa acatatagta tgggcaagca gggagctaga acgattcgca    3540

gttaatcctg gcctgttaga aacatcagaa ggctgtagac aaatactggg acagctacaa    3600

ccatcccttc agacaggatc agaagaactt agatcattat ataatacagt agcaaccctc    3660

tattgtgtgc atcaaaggat agagataaaa gacaccaagg aagctttaga caagatagag    3720

gaagagcaaa acaaaagtaa gaccaccgca cagcaagcgg ccgctgatct tcagacctgg    3780

aggaggagat atgagggaca attggagaag tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat    3840

tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag    3900

agcagtggga ataggagctt tgttccttgg gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg    3960

cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca    4020

gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg    4080

gggcatcaag cagctccagg caagaatcct ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca    4140

gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa actcatttgc accactgctg tgccttggaa    4200

tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca gatttggaat cacacgacct ggatggagtg    4260

ggacagagaa attaacaatt acacaagctt aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa    4320

ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa    4380

ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta tataaaatta ttcataatga tagtaggagg    4440

cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt actttctata gtgaatagag ttaggcaggg    4500

atattcacca ttatcgtttc agacccacct cccaaccccg aggggacccg acaggcccga    4560

aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg    4620

atctcgacgg tatcgattag actgtagccc aggaatatgg cagctagatt gtacacattt    4680

agaaggaaaa gttatcttgg tagcagttca tgtagccagt ggatatatag aagcagaagt    4740

aattccagca gagacagggc aagaaacagc atacttcctc ttaaaattag caggaagatg    4800

gccagtaaaa acagtacata cagacaatgg cagcaatttc accagtacta cagttaaggc    4860

cgcctgttgg tgggcgggga tcaagcagga atttggcatt ccctacaatc cccaaagtca    4920

aggagtaata gaatctatga ataaagaatt aaagaaaatt ataggacagg taagagatca    4980

ggctgaacat cttaagacag cagtacaaat ggcagtattc atccacaatt ttaaaagaaa    5040

aggggggatt ggggggtaca gtgcagggga aagaatagta gacataatag caacagacat    5100

acaaactaaa gaattacaaa aacaaattac aaaaattcaa aattttcggg tttattacag    5160

ggacagcaga gatccagttt ggctgcattg atcacgtgag gctccggtgc ccgtcagtgg    5220

gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg gaggggtcgg caattgaacc    5280

ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg atgtcgtgta ctggctccgc    5340

ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag tagtcgccgt gaacgttctt    5400

tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg tgtgtggttc ccgcgggcct    5460

ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta cttccacctg gctgcagtac    5520

gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct    5580

taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt gaggcctggc ctgggcgctg gggccgccgc    5640

gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt    5700

taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg    5760

ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt    5820

gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga    5880

cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc    5940

gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg    6000

ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg    6060

gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt    6120

gactccactg agtaccgggc gccgtccagg cacctcgatt agttctcgag cttttggagt    6180

acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg    6240

gtggagactg aagttaggcc agcttggcac ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt    6300

tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag cctcagacag tggttcaaag tttttttctt    6360

ccatttcagg tgtcgtgatc tagaggatcc accatggtga gcaagggcga ggagctgttc    6420

accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc    6480

gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc    6540

accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg    6600

cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg    6660

cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc    6720

cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc    6780

gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac    6840

aacgtctata tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc    6900

cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc    6960

ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgccctgagc    7020

aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg    7080

atcactctcg gcatggacga gctgtacaag taagtcgaca atcaacctct ggattacaaa    7140

atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc cttttacgct atgtggatac    7200

gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta tggctttcat tttctcctcc    7260

ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt ggcccgttgt caggcaacgt    7320

ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg gttggggcat tgccaccacc    7380

tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta ttgccacggc ggaactcatc    7440

gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt tgggcactga caattccgtg    7500

gtgttgtcgg ggaagctgac gtcctttcca tggctgctcg cctgtgttgc cacctggatt    7560

ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca atccagcgga ccttccttcc    7620

cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc gccttcgccc tcagacgagt    7680

cggatctccc tttgggccgc ctccccgcct ggaattcgag ctcggtacct ttaagaccaa    7740

tgacttacaa ggcagctgta gatcttagcc actttttaaa agaaaagggg ggactggaag    7800

ggctaattca ctcccaacga agacaagatc tgctttttgc ttgtactggg tctctctggt    7860

tagaccagat ctgagcctgg gagctctctg gctaactagg gaacccactg cttaagcctc    7920

aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta    7980

actagagatc cctcagaccc ttttagtcag tgtggaaaat ctctagcagt agtagttcat    8040

gtcatcttat tattcagtat ttataacttg caaagaaatg aatatcagag agtgagagga    8100

acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa    8160

ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt    8220

atcatgtctg gctctagcta tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc taactccgcc    8280

cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga    8340

ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg    8400

gacgtaccca attcgcccta tagtgagtcg tattac                              8436

<210>  53

<211>  8384

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  53

tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc      60

gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat     120

taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt     180

aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt     240

atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat     300

tacgccaagc gcgcaattaa ccctcactaa agggaacaaa agctggagct gcaagcttaa     360

tgtagtctta tgcaatactc ttgtagtctt gcaacatggt aacgatgagt tagcaacatg     420

ccttacaagg agagaaaaag caccgtgcat gccgattggt ggaagtaagg tggtacgatc     480

gtgccttatt aggaaggcaa cagacgggtc tgacatggat tggacgaacc actgaattgc     540

cgcattgcag agatattgta tttaagtgcc tagctcgata caataaacgg gtctctctgg     600

ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct     660

caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt     720

aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag tggcgcccga     780

acagggacct gaaagcgaaa gggaaaccag agctctctcg acgcaggact cggcttgctg     840

aagcgcgcac ggcaagaggc gaggggcggc gactggtgag tacgccaaaa attttgacta     900

gcggaggcta gaaggagaga gatgggtgcg agagcgtcag tattaagcgg gggagaatta     960

gatcgcgatg ggaaaaaatt cggttaaggc cagggggaaa gaaaaaatat aaattaaaac    1020

atatagtatg ggcaagcagg gagctagaac gattcgcagt taatcctggc ctgttagaaa    1080

catcagaagg ctgtagacaa atactgggac agctacaacc atcccttcag acaggatcag    1140

aagaacttag atcattatat aatacagtag caaccctcta ttgtgtgcat caaaggatag    1200

agataaaaga caccaaggaa gctttagaca agatagagga agagcaaaac aaaagtaaga    1260

ccaccgcaca gcaagcggcc gctgatcttc agacctggag gaggagatat gagggacaat    1320

tggagaagtg aattatataa atataaagta gtaaaaattg aaccattagg agtagcaccc    1380

accaaggcaa agagaagagt ggtgcagaga gaaaaaagag cagtgggaat aggagctttg    1440

ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcctcaat gacgctgacg    1500

gtacaggcca gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt gctgagggct    1560

attgaggcgc aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca gctccaggca    1620

agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcctggggat ttggggttgc    1680

tctggaaaac tcatttgcac cactgctgtg ccttggaatg ctagttggag taataaatct    1740

ctggaacaga ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca    1800

caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag    1860

aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata acaaattggc    1920

tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta agaatagttt    1980

ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta tcgtttcaga    2040

cccacctccc aaccccgagg ggacccgaca ggcccgaagg aatagaagaa gaaggtggag    2100

agagagacag agacagatcc attcgattag tgaacggatc tcgacggtat cgattagact    2160

gtagcccagg aatatggcag ctagattgta cacatttaga aggaaaagtt atcttggtag    2220

cagttcatgt agccagtgga tatatagaag cagaagtaat tccagcagag acagggcaag    2280

aaacagcata cttcctctta aaattagcag gaagatggcc agtaaaaaca gtacatacag    2340

acaatggcag caatttcacc agtactacag ttaaggccgc ctgttggtgg gcggggatca    2400

agcaggaatt tggcattccc tacaatcccc aaagtcaagg agtaatagaa tctatgaata    2460

aagaattaaa gaaaattata ggacaggtaa gagatcaggc tgaacatctt aagacagcag    2520

tacaaatggc agtattcatc cacaatttta aaagaaaagg ggggattggg gggtacagtg    2580

caggggaaag aatagtagac ataatagcaa cagacataca aactaaagaa ttacaaaaac    2640

aaattacaaa aattcaaaat tttcgggttt attacaggga cagcagagat ccagtttggc    2700

tgcatacgcg tcgtgaggct ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat cgcccacagt    2760

ccccgagaag ttggggggag gggtcggcaa ttgaaccggt gcctagagaa ggtggcgcgg    2820

ggtaaactgg gaaagtgatg tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga    2880

accgtatata agtgcagtag tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag    2940

aacacaggta agtgccgtgt gtggttcccg cgggcctggc ctctttacgg gttatggccc    3000

ttgcgtgcct tgaattactt ccacctggct gcagtacgtg attcttgatc ccgagcttcg    3060

ggttggaagt gggtgggaga gttcgaggcc ttgcgcttaa ggagcccctt cgcctcgtgc    3120

ttgagttgag gcctggcctg ggcgctgggg ccgccgcgtg cgaatctggt ggcaccttcg    3180

cgcctgtctc gctgctttcg ataagtctct agccatttaa aatttttgat gacctgctgc    3240

gacgcttttt ttctggcaag atagtcttgt aaatgcgggc caagatctgc acactggtat    3300

ttcggttttt ggggccgcgg gcggcgacgg ggcccgtgcg tcccagcgca catgttcggc    3360

gaggcggggc ctgcgagcgc ggccaccgag aatcggacgg gggtagtctc aagctggccg    3420

gcctgctctg gtgcctggcc tcgcgccgcc gtgtatcgcc ccgccctggg cggcaaggct    3480

ggcccggtcg gcaccagttg cgtgagcgga aagatggccg cttcccggcc ctgctgcagg    3540

gagctcaaaa tggaggacgc ggcgctcggg agagcgggcg ggtgagtcac ccacacaaag    3600

gaaaagggcc tttccgtcct cagccgtcgc ttcatgtgac tccactgagt accgggcgcc    3660

gtccaggcac ctcgattagt tctcgtgctt ttggagtacg tcgtctttag gttgggggga    3720

ggggttttat gcgatggagt ttccccacac tgagtgggtg gagactgaag ttaggccagc    3780

ttggcacttg atgtaattct ccttggaatt tgcccttttt gagtttggat cttggttcat    3840

tctcaagcct cagacagtgg ttcaaagttt ttttcttcca tttcaggtgt cgtgagctag    3900

actagtacca tggacatgcg ggtgcctgca caacttctgg gcctgctgtt gttgtggctg    3960

tctggagccc ggtgtaattg ggtaaatgtt atcagtgatc tcaagaagat agaggatctc    4020

atccagtcca tgcatattga tgccacgctg tacacagaaa gcgatgtgca tcctagctgt    4080

aaggtgacag cgatgaagtg ttttcttttg gagctgcagg taattagtct tgagtccggc    4140

gatgccagca ttcatgatac cgtagaaaac ttgattatcc tggccaacaa ttctctgtcc    4200

tcaaacggaa acgtaaccga gagcggttgt aaagaatgtg aagaactgga agaaaagaac    4260

atcaaggagt ttctgcaatc attcgttcac atcgtacaaa tgttcataaa tacgtcagga    4320

tctggttctg gttccggaag tggatctggt tcagggtccg gtagtggatc tgggtcagga    4380

agtggaagcg gtagtgggtc tggatctaaa caagagcact ttcctgataa cctgttgccg    4440

agctgggcga ttacgcttat cagtgtaaac ggcatctttg taatatgctg tctgacctac    4500

tgcttcgcac caaggtgccg ggagagaagg agaaatgaaa gactgagaag ggagagcgtg    4560

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atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc cttgtataaa    4740

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ttattcagta tttataactt gcaaagaaat gaatatcaga gagtgagagg aacttgttta    5580

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cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga    6660

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tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg    8280

ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct    8340

ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcc                     8384

<210>  54

<211>  9161

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  54

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cgcattgcag agatattgta tttaagtgcc tagctcgata caataaacgg gtctctctgg     600

ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct     660

caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt     720

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caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag    1860

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tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat    8460

cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc    8520

taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg    8580

gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc    8640

acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg    8700

ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg    8760

ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa    8820

cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg    8880

aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga    8940

gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct    9000

gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca    9060

gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc    9120

ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc c                        9161

<210>  55

<211>  259

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  55

Ser His His Trp Gly Tyr Gly Lys His Asn Gly Pro Glu His Trp His

1               5                   10                  15

Lys Asp Phe Pro Ile Ala Lys Gly Glu Arg Gln Ser Pro Val Asp Ile

            20                  25                  30

Asp Thr His Thr Ala Lys Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Pro Leu Ser Val

        35                  40                  45

Ser Tyr Asp Gln Ala Thr Ser Leu Arg Ile Leu Asn Asn Gly His Ala

    50                  55                  60

Phe Asn Val Glu Phe Asp Asp Ser Gln Asp Lys Ala Val Leu Lys Gly

65                  70                  75                  80

Gly Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Arg Leu Ile Gln Phe His Phe His Trp

                85                  90                  95

Gly Ser Leu Asp Gly Gln Gly Ser Glu His Thr Val Asp Lys Lys Lys

            100                 105                 110

Tyr Ala Ala Glu Leu His Leu Val His Trp Asn Thr Lys Tyr Gly Asp

        115                 120                 125

Phe Gly Lys Ala Val Gln Gln Pro Asp Gly Leu Ala Val Leu Gly Ile

    130                 135                 140

Phe Leu Lys Val Gly Ser Ala Lys Pro Gly Leu Gln Lys Val Val Asp

145                 150                 155                 160

Val Leu Asp Ser Ile Lys Thr Lys Gly Lys Ser Ala Asp Phe Thr Asn

                165                 170                 175

Phe Asp Pro Arg Gly Leu Leu Pro Glu Ser Leu Asp Tyr Trp Thr Tyr

            180                 185                 190

Pro Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Leu Leu Glu Cys Val Thr Trp Ile

        195                 200                 205

Val Leu Lys Glu Pro Ile Ser Val Ser Ser Glu Gln Val Leu Lys Phe

    210                 215                 220

Arg Lys Leu Asn Phe Asn Gly Glu Gly Glu Pro Glu Glu Leu Met Val

225                 230                 235                 240

Asp Asn Trp Arg Pro Ala Gln Pro Leu Lys Asn Arg Gln Ile Lys Ala

                245                 250                 255

Ser Phe Lys

<210>  56

<211>  260

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  56

Met Ser His His Trp Gly Tyr Gly Lys His Asn Gly Pro Glu His Trp

1               5                   10                  15

His Lys Asp Phe Pro Ile Ala Lys Gly Glu Arg Gln Ser Pro Val Asp

            20                  25                  30

Ile Asp Thr His Thr Ala Lys Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Pro Leu Ser

        35                  40                  45

Val Ser Tyr Asp Gln Ala Thr Asn Leu Arg Ile Leu Asn Asn Gly His

    50                  55                  60

Ala Phe Asn Val Glu Phe Asp Asp Ser Gln Asp Lys Ala Val Leu Lys

65                  70                  75                  80

Gly Gly Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Arg Leu Ile Gln Phe His Phe His

                85                  90                  95

Trp Gly Ser Leu Asp Gly Gln Gly Ser Glu His Thr Val Asp Lys Lys

            100                 105                 110

Lys Tyr Ala Ala Glu Leu His Leu Val His Trp Asn Thr Lys Tyr Gly

        115                 120                 125

Asp Phe Gly Lys Ala Val Gln Gln Pro Asp Gly Leu Ala Val Leu Gly

    130                 135                 140

Ile Phe Leu Lys Val Gly Ser Ala Lys Pro Gly Leu Gln Lys Val Val

145                 150                 155                 160

Asp Val Leu Asp Ser Ile Lys Thr Lys Gly Lys Ser Ala Asp Phe Thr

                165                 170                 175

Asn Phe Asp Pro Arg Gly Leu Leu Pro Glu Ser Leu Asp Tyr Trp Thr

            180                 185                 190

Tyr Pro Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Leu Leu Glu Cys Val Thr Trp

        195                 200                 205

Ile Val Leu Lys Glu Pro Ile Ser Val Ser Ser Glu Gln Val Leu Lys

    210                 215                 220

Phe Arg Lys Leu Asn Phe Asn Gly Glu Gly Glu Pro Glu Glu Leu Met

225                 230                 235                 240

Val Asp Asn Trp Arg Pro Ala Gln Pro Leu Lys Asn Arg Gln Ile Lys

                245                 250                 255

Ala Ser Phe Lys

            260

<210>  57

<211>  259

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  57

Ser His His Trp Gly Tyr Gly Lys His Asn Gly Pro Glu His Trp His

1               5                   10                  15

Lys Asp Phe Pro Ile Ala Lys Gly Glu Arg Gln Ser Pro Val Asp Ile

            20                  25                  30

Asp Thr His Thr Ala Lys Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Pro Leu Ser Val

        35                  40                  45

Ser Tyr Asp Gln Ala Thr Asn Leu Arg Ile Leu Asn Asn Gly His Ala

    50                  55                  60

Phe Asn Val Glu Phe Asp Asp Ser Gln Asp Lys Ala Val Leu Lys Gly

65                  70                  75                  80

Gly Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Arg Leu Ile Gln Phe His Phe His Trp

                85                  90                  95

Gly Ser Leu Asp Gly Gln Gly Ser Glu His Thr Val Asp Lys Lys Lys

            100                 105                 110

Tyr Ala Ala Glu Leu His Leu Val His Trp Asn Thr Lys Tyr Gly Asp

        115                 120                 125

Phe Gly Lys Ala Val Gln Gln Pro Asp Gly Leu Ala Val Leu Gly Ile

    130                 135                 140

Phe Leu Lys Val Gly Ser Ala Lys Pro Gly Leu Gln Lys Val Val Asp

145                 150                 155                 160

Val Leu Asp Ser Ile Lys Thr Lys Gly Lys Ser Ala Asp Phe Thr Asn

                165                 170                 175

Phe Asp Pro Arg Gly Leu Leu Pro Glu Ser Leu Asp Tyr Trp Thr Tyr

            180                 185                 190

Pro Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Leu Leu Glu Cys Val Thr Trp Ile

        195                 200                 205

Val Leu Lys Glu Pro Ile Ser Val Ser Ser Glu Gln Val Leu Lys Phe

    210                 215                 220

Arg Lys Leu Asn Phe Asn Gly Glu Gly Glu Pro Glu Glu Leu Met Val

225                 230                 235                 240

Asp Asn Trp Arg Pro Ala Gln Pro Leu Lys Asn Arg Gln Ile Lys Ala

                245                 250                 255

Ser Phe Lys

<210>  58

<211>  18

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  58

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1               5                   10                  15

His Ser

<210>  59

<211>  48

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  59

Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr

1               5                   10                  15

Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His

            20                  25                  30

Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala

        35                  40                  45

<210>  60

<211>  33

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成构建体

<400>  60

Met Gly Leu Val Arg Arg Gly Ala Arg Ala Gly Pro Arg Met Pro Arg

1               5                   10                  15

Gly Trp Thr Ala Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ser Gly Phe Met

            20                  25                  30

Ala