一种分级过滤分离大豆黄浆水中水苏糖的方法

技术领域

本发明属于水苏糖提取技术领域，具体涉及一种分级过滤分离大豆黄浆水中水苏糖的方法。

背景技术

在豆腐制作过程中，经压滤成型后会排放大量含有黄酮和色素类物质的黄色液体，我们将其称为黄浆水。黄浆水中包含大量的营养物质，例如蛋白质、低聚糖、矿物质和异黄酮等。近年来，特别是黄浆水中功能性低聚糖的回收日渐成为研究的热点，越来越多的人也开始注意到黄浆水在提取水苏糖方面的开发前景。

膜技术具有分离效果好、能量消耗低、操作简便、无二次污染等优点，因而在低聚糖分离纯化方面表现出较好的前景。膜分离技术是指在压力驱动下对有机膜表面的溶液体系进行分离。溶剂等小分子溶质以不对称的微孔机制通过有机膜，大分子溶质或颗粒被滤膜困在膜表面。膜的不对称结构和设备中物料和液体的高速流动，使得被困物质不易堵塞膜孔，使膜可以长期使用。超滤技术具有节能高效等优点，将其应用于大豆低聚糖的提取中具有重要的经济和社会效益。纳滤膜的分子截留量一般为200～1000D，广泛应用于食品领域的分离和浓缩，尤其在功能性低聚糖的分离纯化方面应用广泛。综上所述，由于膜分离技术与其他分离纯化方法相比具有处理量大、分离效果好、无二次污染等特点，因此本研究选择超滤和纳滤相结合的方式对黄浆水进行分级过滤。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种分级过滤分离大豆黄浆水中水苏糖的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种分级过滤分离大豆黄浆水中水苏糖的方法，包括以下步骤：

步骤一、黄浆水预处理；

称取大豆，按照豆水比1:5浸泡14-16h后，去掉水分，加干豆9倍体积的水磨浆，滤出豆渣，将豆浆进行水浴加热至90℃保持10min进行煮浆，之后加入凝固剂，硫酸钙添加量为干豆的2％，保温12min后放入模具中进行压制，最后收集黄浆水；将制备好的黄浆水保存至4℃冰箱备用；选择壳聚糖絮凝法对其进行预处理，静沉时间68min，pH＝5.5，静沉温度30.9℃，壳聚糖添加量0.7g/L；

步骤二、超滤纳滤膜元件的选择；

2.1、一级超滤膜元件：选择截留分子量为10000D的聚醚砜超滤膜元件对预处理后的黄浆水进行一级超滤；

2.2、二级超滤膜元件：将一级膜元件超滤后的透过液分别通过截留分子量为5000、6000、8000D的超滤膜元件，收集透过液，通过比较渗透通量、蛋白去除率以及水苏糖保留率来确定二级超滤膜元件；

2.3、三级超滤膜元件：将二级膜元件超滤后的透过液分别通过截留分子量为1000、2000、3000D的超滤膜元件，通过比较渗透通量、蛋白去除率以及水苏糖保留率来确定三级超滤膜元件；

2.4、纳滤膜元件：将超滤后的透过液进行纳滤，纳滤可选取截留分子量分别为150、200、300、500、600D的聚酰胺纳滤膜元件，参照水苏糖分子量，选择截留分子量为500D的纳滤膜元件，收集截留液；

步骤三、分级过滤条件的选择；

超滤纳滤膜元件选定后，进行分级过滤条件的选择，考察操作压强、黄浆水温度和pH值对分级过滤后水苏糖含量的影响，从而确定最佳分级过滤条件；

3.1、操作压强的选择：取等体积预处理后的黄浆水样液，保持样液在温度20℃，pH＝5.5条件下，调节超滤操作压强分别为0.1、0.3、0.5、0.7MPa，通过一级、二级和三级超滤膜元件，收集超滤透过液测定水苏糖保留率，在最佳超滤压强下保持相同的温度和pH条件进行纳滤，调节纳滤的操作压强分别为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1MPa，将超滤透过液通过纳滤膜元件，收集纳滤截留液，利用高效液相色谱仪测定纳滤截留液中水苏糖含量，计算水苏糖保留率，从而确定黄浆水分级过滤的最佳操作压强；

3.2、黄浆水温度的选择：取等体积预处理后的黄浆水样液，调节样液pH＝5.5，温度分别为10、20、30、40℃，控制操作压强0.3MPa，依次通过超滤和纳滤膜元件，收集截留液，并测定其水苏糖含量，计算水苏糖保留率，从而确定黄浆水分级过滤的最佳温度；

3.3、黄浆水pH值的选择：取等体积预处理后的黄浆水样液，保持样液在温度20℃，调节pH值分别为4.5、5.5、6.5、7.5、8.5，控制操作压强0.3MPa，依次通过超滤和纳滤膜元件，收集截留液，测定其水苏糖含量，计算水苏糖保留率，从而确定黄浆水分级过滤的最佳pH值；

步骤四、水苏糖纯度测定；

将分级过滤后的水苏糖粗提液进行冷冻干燥，称取干燥后样品5mg加入10mL乙腈(40％)，配制成浓度为0.5mg/mL的溶液，称取1mg水苏糖标品，加入5mL乙腈(40％)，配制成浓度为0.2mg/mL溶液，经0.45μm滤膜过滤，进行高效液相测定，进样量10μL。

优选的，通过离子交换树脂处理、凹凸棒土脱色、真空浓缩及蛋白的脱除可以对豆腐黄浆水中的低聚糖进行提取。

优选的，通过高温离心去除蛋白、电渗析脱盐、活性炭脱色可以对豆清水中低聚糖进行提取，最终低聚糖的保留率为80.41％。

优选的，通过超滤处理(10000D)、活性炭脱色、电渗析和离子交换树脂脱盐的方法可以对豆腐黄浆水中的大豆低聚糖进行提取。

优选的，通过絮凝沉降、离心、微滤预处理后再经超滤(10000D)、纳滤(500D)可以对黄浆水中低聚糖进行提取得到大豆低聚糖粉，最终水苏糖的回收率为29.03％；

优选的，以大豆废水为原料，通过超滤和反渗透以及纳滤技术对低聚糖进行提取，最终水苏糖回收率为24.70％。

与现有技术相比，本发明提供了一种分级过滤分离大豆黄浆水中水苏糖的方法，具备以下有益效果：

本发明发现260g的大豆将会产生约1L的黄浆水，经分级过滤后可收集到大约80mL的水苏糖粗提液，再经冷冻干燥后获得大约0.8g的固形物，经HPLC-ELSD测定后最终水苏糖纯度为42.6％，虽然分级过滤过程中，水苏糖有所损失，但本发明最终得到的水苏糖粗提液中水苏糖纯度得到明显的提高。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制，在附图中：

图1为二级超滤膜元件渗透通量的衰减曲线示意图；

图2为三级超滤膜元件渗透通量的衰减曲线示意图；

图3为二级超滤膜元件的蛋白去除率及水苏糖保留率示意图；

图4为三级超滤膜元件的蛋白去除率及水苏糖保留率示意图；

图5为操作压强对超滤后水苏糖保留率的影响示意图；

图6为操作压强对纳滤后水苏糖保留率的影响示意图；

图7为黄浆水温度对分级过滤后水苏糖保留率的影响示意图；

图8为黄浆水pH值对分级过滤后水苏糖保留率的影响示意图；

图9为水苏糖标品高效液相色谱图。

图10为水苏糖粗品高效液相色谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-10，本发明提供一种技术方案：一种分级过滤分离大豆黄浆水中水苏糖的方法，包括以下步骤：

步骤一、黄浆水预处理；

称取大豆，按照豆水比1:5浸泡14-16h后，去掉水分，加干豆9倍体积的水磨浆，滤出豆渣，将豆浆进行水浴加热至90℃保持10min进行煮浆，之后加入凝固剂，硫酸钙添加量为干豆的2％，保温12min后放入模具中进行压制，最后收集黄浆水；将制备好的黄浆水保存至4℃冰箱备用；选择壳聚糖絮凝法对其进行预处理，静沉时间68min，pH＝5.5，静沉温度30.9℃，壳聚糖添加量0.7g/L；

步骤二、超滤纳滤膜元件的选择；

2.1、一级超滤膜元件：选择截留分子量为10000D的聚醚砜超滤膜元件对预处理后的黄浆水进行一级超滤；

2.2、二级超滤膜元件：将一级膜元件超滤后的透过液分别通过截留分子量为5000、6000、8000D的超滤膜元件，收集透过液，通过比较渗透通量、蛋白去除率以及水苏糖保留率来确定二级超滤膜元件；

2.3、三级超滤膜元件：将二级膜元件超滤后的透过液分别通过截留分子量为1000、2000、3000D的超滤膜元件，通过比较渗透通量、蛋白去除率以及水苏糖保留率来确定三级超滤膜元件；

2.4、纳滤膜元件：将超滤后的透过液进行纳滤，纳滤可选取截留分子量分别为150、200、300、500、600D的聚酰胺纳滤膜元件，参照水苏糖分子量，选择截留分子量为500D的纳滤膜元件，收集截留液；

步骤三、分级过滤条件的选择；

超滤纳滤膜元件选定后，进行分级过滤条件的选择，考察操作压强、黄浆水温度和pH值对分级过滤后水苏糖含量的影响，从而确定最佳分级过滤条件；

3.1、操作压强的选择：取等体积预处理后的黄浆水样液，保持样液在温度20℃，pH＝5.5条件下，调节超滤操作压强分别为0.1、0.3、0.5、0.7MPa，通过一级、二级和三级超滤膜元件，收集超滤透过液测定水苏糖保留率，在最佳超滤压强下保持相同的温度和pH条件进行纳滤，调节纳滤的操作压强分别为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1MPa，将超滤透过液通过纳滤膜元件，收集纳滤截留液，利用高效液相色谱仪测定纳滤截留液中水苏糖含量，计算水苏糖保留率，从而确定黄浆水分级过滤的最佳操作压强；

3.2、黄浆水温度的选择：取等体积预处理后的黄浆水样液，调节样液pH＝5.5，温度分别为10、20、30、40℃，控制操作压强0.3MPa，依次通过超滤和纳滤膜元件，收集截留液，并测定其水苏糖含量，计算水苏糖保留率，从而确定黄浆水分级过滤的最佳温度；

3.3、黄浆水pH值的选择：取等体积预处理后的黄浆水样液，保持样液在温度20℃，调节pH值分别为4.5、5.5、6.5、7.5、8.5，控制操作压强0.3MPa，依次通过超滤和纳滤膜元件，收集截留液，测定其水苏糖含量，计算水苏糖保留率，从而确定黄浆水分级过滤的最佳pH值；

步骤四、水苏糖纯度测定；

将分级过滤后的水苏糖粗提液进行冷冻干燥，称取干燥后样品5mg加入10mL乙腈(40％)，配制成浓度为0.5mg/mL的溶液，称取1mg水苏糖标品，加入5mL乙腈(40％)，配制成浓度为0.2mg/mL溶液，经0.45μm滤膜过滤，进行高效液相测定，进样量10μL。

本发明中，优选的，通过离子交换树脂处理、凹凸棒土脱色、真空浓缩及蛋白的脱除可以对豆腐黄浆水中的低聚糖进行提取。

本发明中，优选的，通过高温离心去除蛋白、电渗析脱盐、活性炭脱色可以对豆清水中低聚糖进行提取，最终低聚糖的保留率为80.41％。

本发明中，优选的，通过超滤处理(10000D)、活性炭脱色、电渗析和离子交换树脂脱盐的方法可以对豆腐黄浆水中的大豆低聚糖进行提取。

本发明中，优选的，通过絮凝沉降、离心、微滤预处理后再经超滤(10000D)、纳滤(500D)可以对黄浆水中低聚糖进行提取得到大豆低聚糖粉，最终水苏糖的回收率为29.03％；

本发明中，优选的，以大豆废水为原料，通过超滤和反渗透以及纳滤技术对低聚糖进行提取，最终水苏糖回收率为24.70％。

实施例一：黄浆水预处理

称取大豆，按照豆水比1:5浸泡14-16h后，去掉水分，加干豆9倍体积的水磨浆，滤出豆渣，将豆浆进行水浴加热至90℃保持10min进行煮浆，之后加入凝固剂(硫酸钙添加量为干豆的2％)，保温12min后放入模具中进行压制，最后收集黄浆水。将制备好的黄浆水保存至4℃冰箱备用。选择壳聚糖絮凝法对其进行预处理，静沉时间68min，pH＝5.5，静沉温度30.9°C，壳聚糖添加量0.7g/L。

实施例二：超滤纳滤膜元件的选择

1、一级超滤膜元件：选择截留分子量为10000D的聚醚砜超滤膜元件对预处理后的黄浆水进行一级超滤；

2、二级超滤膜元件：将一级膜元件超滤后的透过液分别通过截留分子量为5000、6000、8000D的超滤膜元件，收集透过液，通过比较渗透通量、蛋白去除率以及水苏糖保留率来确定二级超滤膜元件；

3、三级超滤膜元件：将二级膜元件超滤后的透过液分别通过截留分子量为1000、2000、3000D的超滤膜元件，通过比较渗透通量、蛋白去除率以及水苏糖保留率来确定三级超滤膜元件；

4、纳滤膜元件：将超滤后的透过液进行纳滤，纳滤可选取截留分子量分别为150、200、300、500、600D的聚酰胺纳滤膜元件，参照水苏糖分子量，选择截留分子量为500D的纳滤膜元件，收集截留液。

蛋白去除率、水苏糖保留率和渗透通量计算公式如下：

式中：W

式中：M

式中：L—透过液体积；m

结果与分析

1.二级和三级超滤膜元件渗透通量的衰减曲线

如图1和图2所示，图1和图2分别为二级和三级超滤膜元件渗透通量的衰减曲线，从图中可以看出，图1和图2中不同截留分子量膜元件的渗透通量都随着透过液体积的增加而不断下降，随着渗透液体积的增大，大分子量膜元件的渗透通量衰减速率要快于小分子量膜元件的渗透通量衰减速率，因此选择截留分子量小的膜元件有利于膜的长期使用；

2.二级和三级超滤膜元件的蛋白去除率和水苏糖保留率

如图3和图4所示，图3和图4分别为二级和三级超滤膜元件的蛋白去除率及水苏糖保留率，从图中可以看出，随着膜元件截留分子量的增大，蛋白去除率都随之下降而水苏糖保留率都随之上升，从图3可以看出，与截留分子量5000D的超滤膜元件相比，6000D和8000D的透过液中蛋白去除率显著下降(p<0.05)，对于水苏糖保留率而言，与截留分子量5000D的超滤膜元件相比，6000D的透过液中水苏糖保留率差异不显著，8000D的透过液中水苏糖保留率差异显著，从图4可以看出，与截留分子量1000D相比，2000D和3000D的透过液中蛋白去除率显著下降差异显著(p<0.05)，而对于水苏糖保留率而言，与截留分子量1000D的超滤膜元件相比，2000D的透过液中水苏糖保留率差异不显著，3000D的透过液中水苏糖保留率差异显著，综上，分别选择截留分子量分别为5000和1000D的超滤膜作为二级和三级超滤膜元件。

实施例三：分级过滤条件的选择

超滤纳滤膜元件选定后，进行分级过滤条件的选择，考察操作压强、黄浆水温度和pH值对分级过滤后水苏糖含量的影响，从而确定最佳分级过滤条件。

1、操作压强的选择：取等体积预处理后的黄浆水样液，保持样液在温度20℃，pH＝5.5条件下，调节超滤操作压强分别为0.1、0.3、0.5、0.7MPa，通过一级、二级和三级超滤膜元件，收集超滤透过液测定水苏糖保留率，在最佳超滤压强下保持相同的温度和pH条件进行纳滤，调节纳滤的操作压强分别为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1MPa，将超滤透过液通过纳滤膜元件，收集纳滤截留液，利用高效液相色谱仪测定纳滤截留液中水苏糖含量，计算水苏糖保留率，从而确定黄浆水分级过滤的最佳操作压强；

2、黄浆水温度的选择：取等体积预处理后的黄浆水样液，调节样液pH＝5.5，温度分别为10、20、30、40℃，控制操作压强0.3MPa，依次通过超滤和纳滤膜元件，收集截留液，并测定其水苏糖含量，计算水苏糖保留率，从而确定黄浆水分级过滤的最佳温度；

3、黄浆水pH值的选择：取等体积预处理后的黄浆水样液，保持样液在温度20℃，调节pH值分别为4.5、5.5、6.5、7.5、8.5，控制操作压强0.3MPa，依次通过超滤和纳滤膜元件，收集截留液，测定其水苏糖含量，计算水苏糖保留率，从而确定黄浆水分级过滤的最佳pH值。

结果与分析

1.操作压强对分级过滤水苏糖保留率的影响

如图5和图6所示，为操作压强对分级过滤水苏糖保留率的影响，从图5可以看出，随着超滤的操作压强不断增大水苏糖保留率无显著差异(p>0.05)，从图6可以看出，随着纳滤的操作压强不断增大水苏糖保留率也无显著差异(p>0.05)，由于不同操作压强下水苏糖保留率无显著差异，因此不考虑操作压强对分级过滤水苏糖保留率的影响，只需保证其在正常的工作压强下进行即可。

2.黄浆水温度对分级过滤后水苏糖保留率的影响

从图7可知，随着黄浆水温度的不断升高水苏糖的保留率发生了显著变化，随着黄浆水温度的升高，水苏糖保留率呈先上升后下降的趋势，当温度达到30℃时，水苏糖的保留率最高而后显著下降，这可能是由于随着温度的升高，黄浆水的粘度降低，膜表面的疏松程度增加，但当其达到一定温度时，会增大膜孔，导致有部分溶质透过滤膜，导致水苏糖含量降低，因此选取30℃作为黄浆水分级过滤的最佳温度条件。

3.黄浆水pH值对分级过滤后水苏糖保留率的影响

从图8可以看出，随着黄浆水pH值的不断增加，水苏糖保留率发生了显著变化(p<0.05)，当黄浆水pH＝6.5时水苏糖保留率最高而后明显下降，这可能是因为当黄浆水pH值大于蛋白等电点时，蛋白质和膜元件都带负电，两种电荷是互斥的，降低了其在膜表面的浓度和极化现象，随着黄浆水的pH值不断增大，样液浊度增加，蛋白容易沉淀，膜表面的阻力增大，因此选择pH＝6.5作为黄浆水分级过滤的最佳pH值条件。

通过对比不同截留分子量膜元件的渗透通量、蛋白去除率和水苏糖保留率的指标，选择了截留分子量分别为5000和1000D的膜元件作为分级过滤二级和三级的超滤膜元件，参照相关研究和水苏糖分子量，选择截留分子量分别为10000和500D的聚醚砜超滤膜和聚酰胺纳滤膜作为分级过滤的一级超滤和纳滤膜元件，最终选择了截留分子量为10000、5000、1000、500D的膜元件进行分级过滤。

通过比较操作压强、黄浆水温度和pH值对分级过滤水苏糖保留率的影响，确定最佳的分级过滤条件，由于操作压强对水苏糖保留率无显著差异，因此选择温度30℃，pH＝6.5作为分级过滤的最佳操作条件。

实施例四：水苏糖纯度测定

将分级过滤后的水苏糖粗提液进行冷冻干燥，称取干燥后样品5mg加入10mL乙腈(40％)，配制成浓度为0.5mg/mL的溶液，称取1mg水苏糖标品，加入5mL乙腈(40％)，配制成浓度为0.2mg/mL溶液，经0.45μm滤膜过滤，进行高效液相测定，进样量10μL。

结果与分析

如图9和图10所示，为水苏糖的高效液相色谱图，其中图9为水苏糖标品的色谱图，图10为冻干后水苏糖粗品的色谱图，图9和图10色谱图中水苏糖的色谱峰保留时间基本一致，约为29.60min，经计算，冻干后水苏糖粗品纯度为42.6％。

本发明发现260g的大豆将会产生约1L的黄浆水，经分级过滤后可收集到大约80mL的水苏糖粗提液，再经冷冻干燥后获得大约0.8g的固形物，经HPLC-ELSD测定后最终水苏糖纯度为42.6％，虽然分级过滤过程中，水苏糖有所损失，但最终得到的水苏糖粗提液中水苏糖纯度得到明显的提高。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。