一种基于APS为活性磺酸供体的合成和再生系统的构建方法

技术领域

本发明涉及一种基于APS为活性磺酸供体的合成和再生系统的构建方法，属于生物技术领域。

背景技术

APS(腺苷-5′-磷酰硫酸，adenosine-5′-phosphosulfate)是PAPS的前体，由ATP硫酸化酶(ATPS，EC 2.7.7.4)催化ATP和硫酸根合成，并生成副产物PPi。通常认为PAPS是唯一通用的活性磺酸供体，本课题组在前期工作中猜想并验证了APS也是通用的活性磺酸供体。利用APS作为一个新的活性磺酸供体，比PAPS更有优势，其反应步骤更少，且副产物是AMP可直接通过聚磷酸激酶生成ATP，再生路径更短。

以APS为磺酸供体，构建磺酸修饰体系，应用至多糖类(肝素、硫酸软骨素)、肽类(水蛭素)、黄酮类(柚皮素)、植物次级代谢产物(葡萄糖甙)和激素(雌激素)等多种磺基产物的合成，具有十分重大的意义。

发明内容

本发明提供了腺苷5′-磷酰硫酸再生的方法，以AMP，ADP或ATP中的任一物质为底物，在磺基转移酶、聚磷酸激酶和ATP硫酸化酶的参与下合成APS。

在一种实施方式中，所述方法以ATP和硫酸盐为底物，催化合成APS。

在一种实施方式中，所述ATP硫酸化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～4任一所示。

在一种实施方式中，所述聚磷酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.9～13任一所示。

在一种实施方式中，所述方法还有焦磷酸酶参与，所述焦磷酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5～8任一所示。

在一种实施方式中，所述方法以聚磷酸polyP

在一种实施方式中，催化合成APS的催化体系中缓冲液为10～50mM Tris-HCl，pH为6.0～8.0，添加2～20mM ATP、1～5mM硫酸镁、10-200mM硫酸钠，0.5～1.0mg/mL ATP硫酸化酶、磺酸化酶和聚磷酸激酶。

在一种实施方式中，所述磺基转移酶包括硫酸软骨素A磺酸转移酶(氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示)、肝素N磺酸化转移酶(氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示)、海藻糖磺酸转移酶(氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示)或雌激素磺酸转移酶(氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示)。

在一种实施方式中，所述磺基转移酶还在出发序列的基础上进行了突变，所述突变包括但不限于：

(1)将第143位精氨酸突变为半胱氨酸；

(2)将第152位丝氨酸氨酸突变为脯氨酸；

(3)将第154位色氨酸氨酸突变为天冬酰胺。

本发明还提供了APS循环再生系统，所述APS循环再生系统具有将APS催化合成AMP，将AMP催化合成ATP，将ATP催化合成APS从而构成闭环的循环催化反应过程；所述催化反应过程在酶的催化作用下完成。

在一种实施方式中，所述酶包括磺基转移酶、聚磷酸激酶和ATP硫酸化酶。

在一种实施方式中，所述酶为磺基转移酶、聚磷酸激酶、焦磷酸酶和ATP硫酸化酶。

在一种实施方式中，所述磺基转移酶还具有如下至少一种突变：

(1)将第143位精氨酸突变为半胱氨酸；

(2)将第152位丝氨酸氨酸突变为脯氨酸；

(3)将第154位色氨酸氨酸突变为天冬酰胺。

在一种实施方式中，所述ATP硫酸化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～4任一所示；所述聚磷酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.9～13任一所示；所述焦磷酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5～8任一所示。

在一种实施方式中，所述APS循环再生系统以细胞为载体。

在一种实施方式中，所述细胞包括但不限于可表达磺基转移酶、聚磷酸激酶和ATP硫酸化酶中至少一种酶的微生物细胞。

在一种实施方式中，所述APS循环再生系统是含有磺基转移酶、聚磷酸激酶和ATP硫酸化酶的组合物。

在一种实施方式中，所述APS循环再生系统还含有聚磷酸polyP

在一种实施方式中，所述硫酸盐包括但不限于硫酸镁或硫酸钠。

在一种实施方式中，所述硫酸盐的含量为2～200mM。

本发明还提供所述APS循环再生系统在磺酸化产品合成中的应用。

在一种实施方式中，所述磺酸化产品包括不限于肝素、硫酸软骨素、水蛭素或黄酮。

在一种实施方式中，所述催化反应温度为20～40℃，催化时间为24～72h。

本发明提供了腺苷-5′-磷酰硫酸(APS)在作为新的通用活性磺酸供体中的应用。

在一种实施方式中，所述应用是将APS向AMP的转化反应用于磺酸化合物的催化生产过程。

本发明还提供所述方法在提高腺苷5′-磷酰硫酸再生循环次数或在合成磺酸产品中的应用。

有益效果：

1、本发明通过验证APS为新的活性磺酸基供体，实现了更短步骤的磺酸供体合成和更短步骤的再生，大大降低了磺酸化修饰反应的成本，并成功完成了成功在肝素、硫酸软骨素和磺酸海藻糖等磺酸化修饰合成。

2、本发明通过在APS合成体系中加入副产物焦磷酸的水解酶，大大提高了APS的合成效率。

3、本发明通过修饰磺酸转移酶中的3'PB motif(3'-磷酸结合位点)，提高磺基转移酶对APS的亲和力，提高APS的利用率，进而提高APS再生循环的磺酸化修饰效率。

附图说明

图1是APS和PAPS的结构区别。

图2是APS作为磺酸供体修饰合成磺酸化产品。

图3是不同来源ATP硫酸化酶的比酶活。

图4是不同来源焦磷酸酶的比酶活。

图5是APS循环再生系统示意图。

图6是不同来源聚磷酸激酶的比活力。

图7是APS循环再生系统用于磺酸产品修饰的循环次数。

图8是不同磺基转移酶的3'PB位置定位。

图9是海藻糖磺酸转移酶的3'PB位置突变体的相对酶活。

具体实施方式

1.Escherichia coli BL21(DE3)、pET28a(+)为实验室保藏。

2.质粒构建试剂及测序验证均在上海生物生工公司购买和完成。

3.各种分析纯试剂购自国药集团，APS分析品在sigma购买。

4.培养基：

LB培养基：10g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母粉。

TB培养基，2.31g/L KH

蛋白表达：将含有编码目的蛋白基因的重组质粒转入E.coli BL21(DE3)，验证后在含有相应抗生素的平板上划线培养，挑取单菌落接种于LB种子培养基中，培养至种子液后，将种子液按1mL/50mL体积分数转接到50mL TB发酵培养基中，继续培养1～2h后加入0.5mM的IPTG并在30℃进行诱导培养10h。结束后收集菌体，超声破碎后用于纯化和分析。

蛋白纯化：将收集的菌体超声破碎后高速离心去除细胞碎片，上清利用0.22μm水系膜过滤，利用Ni-NTA亲和层析对目的蛋白进行纯化。A液平衡柱子后上样粗酶液，再利用A液平衡层析柱，之后利用不同浓度的B液冲洗层析柱并收集冲洗液，利用SDS-PAGE验证纯化的组分，并将最纯的组分用PD-10脱盐柱进行脱盐，脱盐时使用低盐缓冲液(10mM Tris-HCl，0.1M NaCl；pH 6.0)，收集得到纯化脱盐的蛋白。A液：20mM Tris-HCl buffer pH 7.5，500mM NaCl；B液：20mM Tris-HCl buffer pH 7.5，500mM NaCl，500mM咪唑。

AMP、ADP、ATP、APS检测方法：采用Agilent 1600HPLC系统，Polyamine II柱(4.6×250mm,12nm)，流动相：50mM KH

ATP硫酸化酶活定义为：35℃条件下，每小时降解1μM APS所需要的酶量。

磺基转移酶酶活：35℃条件下，每小时转移1mM磺酸基团至目的产物上所需要的对应磺基转移酶的酶量。

循环次数：具体实施方式中提及的循环次数是指加入的底物APS在整个APS循环系统中的利用次数，其计算方法为初始加入APS的催化中产物的量除循环体系中产物的量。

实施例1：APS作为活性磺酸供体的应用

APS是PAPS的合成前体，仅在3'位置上相差一个磷酸基团，为了验证APS可作为通用的磺酸供体，筛选多种、不同类别的磺酸转移酶是否能利用APS。分别选择硫酸软骨素A磺酸转移酶(C4ST，氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示)、肝素N磺酸化转移酶(NST，氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示)、海藻糖磺酸转移酶(Gene ID:66738808，Stf0，氨基酸序列如SEQ IDNO:13所示)和雌激素磺酸转移酶(Gene ID:360268，EST，氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示)。将上述磺酸转移酶在Tris-HCl反应体系下反应，反应体系含有：50mM Tris-HCl pH＝7.5，10mM APS,10mM待磺酸化底物，0.5g/L对应磺酸转移酶；反应温度为35℃，反应12h。催化结果利用液质联用进行检测。结果如图2所示，底物脱乙酰肝素、雌激素、硫酸软骨素和海藻糖都分别以APS作为磺酸供体在对应位置生成了磺酸基团，生成了N-磺酸化肝素、磺酸雌激素、硫酸软骨素A和海藻糖-2-硫酸，证明了APS是一个通用活性磺酸供体。

实施例2：APS合成催化体系的构建

APS由底物ATP和硫酸根经过ATP硫酸化酶催化合成，并产生副产物焦磷酸。比较筛选不同来源的ATP硫酸化酶，包括酿酒酵母(Gene ID:853466，ScATPS，氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示)、克鲁维酵母(Gene ID:2894185,KlATPS，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)、毕赤酵母(Gene ID:8196926,KpATP，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)和产黄青霉菌(ProteinID:CAP86100.1，PcATPS，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)。将所筛选的ATP硫酸化酶表达、纯化后，测定比酶活，如图3所示，其中产黄青霉菌来源的ATP硫酸化酶PcATPS活性最高为860U/mg，而ScATPS的酶活为620U/mg，KlATPS的酶活为598U/mg以及KpATPS的酶活为580U/mg。

为了进一步提高APS的转化效率，通过向APS合成体系中引入焦磷酸酶，水解焦磷焦磷酸，拉动反应正向进行，提高ATP硫酸化酶的催化效率。比较筛选不同来源的ATP硫酸化酶，包括大肠杆菌(Gene ID:948748，EcPPA，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示)、铜绿假单胞菌(Gene ID:879025，PaPPA，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示)、和酿酒酵母(Gene ID:855309，ScPPA，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示)。所述蛋白经表达纯化后加入到APS的合成体系中，分别测定对ATP硫酸化酶的促进作用，结果如图4所示。焦磷酸酶的引入均能提高ATP硫酸化酶的活性，其中铜绿假单胞菌对ATP硫酸化酶的促进作用最明显。

实施例3：AMP转化ATP的酶的筛选

为了实现APS的再生，需要将AMP再次转化为ATP，因此筛选了不同来源的聚磷酸激酶。分别选择铜绿假单胞菌(PA2428,Gene ID:882843，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；PA0414,Gene ID:879494，氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示)、谷氨酸棒杆菌(PPK2A,ProteinID:WP_011013972.1，氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示)、表皮葡萄球菌(SePPK2，CDD:274736，氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示)和耐辐射奇球菌(DrPPK2，CDD:274737，氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示)来源的聚磷酸激酶。合成编码聚磷酸激酶的基因片段，将基因片段连接至质粒pET28a(+)的Nde I和Hind III限制性酶切位点之间，得到重组质粒。将重组质粒转化至Escherichia coli BL21(DE3)细胞中，在30℃条件下培养2h后，添加0.5mMIPTG继续诱导10h，收集胞内酶，测定酶活。结果显示，聚磷酸激酶同时具有AMP磷酸化酶和ADP磷酸化酶活性，可从AMP一步直接合成ATP，磷酸供体为polyP

实施例4：APS循环再生系统的构建

如图5所示，建立APS循环再生系统。所述APS循环再生系统具有能够在酶的催化作用下，将APS催化合成AMP，将AMP催化合成ATP，将ATP催化合成APS从而构成闭环的循环催化反应过程。

其中，APS在磺基转移酶的催化下合成AMP；所述磺基转移酶包括但不限于硫酸软骨素A磺酸转移酶(C4ST，氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示)、肝素N磺酸化转移酶(NST，氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示)、海藻糖磺酸转移酶(氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示)和雌激素磺酸转移酶(氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示)。AMP在聚磷酸参与和聚磷酸激酶的催化作用下生成ATP；所述聚磷酸激酶可选择氨基酸序列如SEQ ID NO.8～SEQ ID NO.12所示的聚磷酸激酶。ATP在硫酸盐的参与及ATP硫酸化酶的催化作用下生成APS；所述ATP硫酸化酶可以为氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4任一所示的ATP硫酸化酶。

APS循环再生系统可以以含有酶制剂的催化体系参与反应；催化体系含有：在Tris-HCl反应体系下反应，反应体系含有：50mM Tris-HCl pH＝7.5，10mM ATP,20mMMgSO

实施例5：APS再生系统的在硫酸软骨素生产中的应用

APS再生系统含有：0.5g/L聚磷酸激酶SePPK2、0.5g/L ATP硫酸化酶ScATPS、20mMpolyP

实施例:6：APS再生系统的在肝素生产中的应用

APS再生系统含有：0.5g/L聚磷酸激酶SePPK2、0.5g/L ATP硫酸化酶ScATPS、20mMpolyP

实施例7：APS再生系统的在海藻糖-2-磺酸盐生产中的应用

APS再生系统含有：0.5g/L聚磷酸激酶SePPK2、0.5g/L ATP硫酸化酶ScATPS、20mMpolyP

实施例8：APS结合区域3'PB重新编辑提高APS再生系统的循环能力

通过比对不同磺酸转移酶结合APS的结合区域3'PB motif(图8)，3'PB区域对APS和PAPS的结合十分重要，其中3'PB motif是结合APS结构中3'OH的区域，重新改造3'PBmotif区域对提高磺酸转移酶对APS的亲和力十分重要。

以海藻糖磺酸转移酶(SEQ ID NO:13)为例，通过分子对接确定与APS直接作用的氨基酸的位置为143、152和154位，分别对其进行饱和突变，确定将第143位精氨酸突变为半胱氨酸，第152位丝氨酸突变为脯氨酸，将第154位色氨酸突变为天冬酰胺，构建单突变体。在单突变的基础上进行叠加突变。表达突变酶时，挑取单菌落在LB中过夜培养，1％(v/v)的接种量转接到发酵培养基TB中37℃培养2h后加入0.5mM IPTG转移到30℃继续培养12h，对野生酶和突变酶的比酶活进行测定，结果显示，野生酶的比酶活为3.2U/mg蛋白，突变体相对野生酶大大提高了对APS的利用率(图9)。突变体应用到构建的APS再生系统中，其磺酸化效率较野生型也提高了2倍。为其他磺基转移酶的突变也提供了参考。

对比例1：

具体实施方式同实施例1，区别在于，将实施例1的焦磷酸酶替换为等量的PcATPS(Protein ID:CAP86100.1)。结果显示，其生成APS的速度没有提高。

对比例2：

具体实施方式同实施例7，区别在于，还构建了将第142位突变为半胱氨酸的突变体，结果显示，对该位点的突变对于APS的亲和力没有提高作用。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。