bowl基因在肢体再生及害虫防治中的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及bowl基因在肢体再生及害虫防治中的应用。

背景技术

组织器官的再生一直是生物学研究中最令人着迷的现象之一，也被国际顶级期刊Science列入全世界最前沿的125个科学问题。强大的组织再生能力是生物在长期进化历程中获得的一种生存技能，在种群环境适应性方面具有重要的生物学和生态学意义。肢体再生现象在昆虫中较为常见，但不同昆虫的再生能力差异较大，昆虫再生研究领域的发展可为高等脊椎动物再生生物学的发展提供借鉴与参考。随着现代生物科学与技术的蓬勃发展，脊椎动物再生生物学研究取得了显著进步，然而再生能力更强的昆虫附肢再生机理研究远远滞后。

美洲大蠊(Periplaneta americana)，隶属于昆虫纲蜚蠊目(俗称蟑螂)蜚蠊科，因其生命力旺盛、组织再生能力强等特点，素有“小强”之称。附肢丢失后可再生，且其全虫提取物作为中成药在伤口修复等临床应用方面疗效显著，是研究昆虫断肢再生的理想材料。转录因子在调控基因表达和动植物发育过程中发挥关键作用。转录因子的本质是与DNA特异性结合的一系列蛋白质。一般有不同的功能区域，如DNA结合结构域与效应结构域。转录因子不单与基因上游的启动子区域结合，也可以和其它转录因子形成转录因子复合体来影响基因的转录，可以产生很复杂而精细的影响。转录因子bowl可以在控制细胞命运与分化中发挥关键作用，但是在昆虫肢体再生中的研究还未见报道，通过对bowl进行基因操作(RNAi)，在破坏该基因表达的情况下可显著影响美洲大蠊的伤口修复和肢体再生过程，该方法有望成为蟑螂绿色防治的理想策略，在其他动物中的伤口修复和肢体再生中也有着较好应用前景。

发明内容

本发明第一方面的目的，在于提供一种dsRNA。

本发明第二方面的目的，在于提供与本发明第一方面的dsRNA相关的生物材料。

本发明第三方面的目的，在于提供一种试剂。

本发明第四方面的目的，在于提供本发明第一方面的dsRNA、本发明第二方面的生物材料和/或本发明第三方面的试剂的应用。

本发明第五方面的目的，在于提供一种防治蜚蠊目昆虫的方法。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明第一个方面，在于提供一种dsRNA，所述dsRNA包含由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列和其反向互补序列所示的核苷酸序列组成的双链RNA。

本发明第二个方面，在于提供与本发明第一方面的dsRNA相关的生物材料，所述生物材料包含a1)～a8)中任一中：

a1)编码本发明第一方面的dsRNA的核酸分子；

a2)包含a1)所述核酸分子的表达盒；

a3)包含a1)所述核酸分子的载体；

a4)包含a2)所述表达盒的载体；

a5)包含a1)所述核酸分子的转基因细胞系；

a6)包含a2)所述表达盒的转基因细胞系；

a7)包含a3)所述载体的转基因细胞系；

a8)包含a4)所述载体的转基因细胞系。

优选地，所述转基因细胞系不包含繁殖材料。

本发明第三个方面，在于提供一种试剂，所述试剂包调控蜚蠊目昆虫bowl基因的物质。

优选地，所述调控包括降低蜚蠊目昆虫bowl基因的表达量和沉默蜚蠊目昆虫bowl基因的表达。

优选地，所述bowl基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示。

优选地，所述物质包括本发明第一方面的dsRNA和/或本发明第二方面的生物材料。

优选地，所述蜚蠊目昆虫包括黑胸大蠊、美洲大蠊、澳洲大蠊、德国小蠊、日本大蠊中的至少一种；进一步优选地，所述蜚蠊目昆虫为美洲大蠊。

本发明第四个方面，在于提供本发明第一方面的dsRNA、本发明第二方面的生物材料和/或本发明第三方面的试剂在b1)～b6)中任一项中的应用：

b1)抑制蜚蠊目昆虫组织再生；

b2)制备抑制蜚蠊目昆虫组织再生的产品

b3)防止防治蜚蠊目昆虫；

b4)制备防止防治蜚蠊目昆虫的产品；

b5)抑制蜚蠊目昆虫伤口修复；

b6)制备抑制蜚蠊目昆虫伤口修复的产品。

优选地，所述蜚蠊目昆虫包括黑胸大蠊、美洲大蠊、澳洲大蠊、德国小蠊、日本大蠊中的至少一种。

优选地，所述组织包括昆虫器官组织或肢体。

本发明第五个方面，在于提供一种防治蜚蠊目昆虫的方法，包括降低蜚蠊目昆虫中bowl基因的表达量和/或活性的步骤。

优选地，所述降低蜚蠊目昆虫中bowl基因的表达量和/或活性的步骤是将本发明第一方面的dsRNA、本发明第二方面的生物材料和/或本发明第三方面的试剂导入蜚蠊目昆虫体内。

优选地，所述导入的方式包括饮食或注射。

优选地，所述饮食包括通过预先施用、喷涂、喷雾而使食物或水中含有本发明第一方面的dsRNA、本发明第二方面的生物材料和/或本发明第三方面的试剂。

本发明的有益效果是：

本发明首次公开了蜚蠊目昆虫bowl基因对于其断肢再生能力的影响，并基于RNAi干扰技术，开发得到了一种能够有效抑制蜚蠊目昆虫断肢再生的dsRNA以及与dsRNA相关的生物材料。通过合成的dsRNA来靶向bowl基因来影响蜚蠊目昆虫的断肢后的伤口修复和再生过程，限制其活动能力，降低了其生存能力，从而达到了蜚蠊目昆虫防治的效果，也可将其应用于其他动物的伤口修复和组织再生。

本发明提供的防治蜚蠊目昆虫的方法，在其昆虫防治过程中，不会产生抗药性、对人畜没有危害，且对环境没有污染。

附图说明

图1为bowl基因RNAi效率检测图，图中*代表P＜0.05。

图2为bowl基因干扰导致美洲大蠊肢体再生异常表型及再生能力统计结果图；其中，A为美洲大蠊肢体再生异常表型，B为再生能力统计结果图，图中***代表P＜0.005。

具体实施方式

现结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不限制本发明的范围。

本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。

实施例1美洲大蠊bowl序列及其dsRNA的获得

使用TRIzol(使用提取试剂盒，Life Technologies，按照说明书执行)方法提取美洲大蠊的总RNA，然后使用oligodT引物和反转录酶PrimeScript II reversetranscriptase(Takara Bio,Shiga,Japan)进行反转录，得到cDNA。

根据已有的美洲大蠊基因组信息，通过与其他物种进行比对找到美洲大蠊bowl基因的完整序列。

美洲大蠊bowl基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。

5’-ATGCCGGTGGAGGGCGCTGCGGAAGGTTCCGCCGCTTCCGCGGGGTCGTC AGGCGGCGCTTCCACATCATCAGCCCCGCGGGACGAACCCCTATCCCTGTCGCTACCGCGCCCGCCCTTGTCAGGGCGGAGCTCGTCGTCGTCGCGTGGAGGCCCCGGGTTCGAACTCTACCACCATCACCTGGCAGCCGGTCTGGGCGGCCTGCACCGAGAGAGTTCGGCCTTCGTGCCCGTCGTGCCCCAGCGCTTCGTGGCGTACCCTCCCCTTCTCATGGAGGACAAAGTCGAGGGCCGCAAGTCGACGTCTGGCACCAGCTTCGAGCTGATGGCGCTCATGGCCGACAAGAGGAAGGAGCTGGCGCTGAGGGAGGAGGCCGCACGCGTCGCCGCCGCCCACGCCGCGGCTGCCGCTGCCATGCTGCTGCCGCACCCGCACAGGGGCCAGCCGCCCCCGCCGGGGATACTGGAGGGGCTCCCGGGAGCGCCGCCGCCCCACCACCCGTACGGCCCGCCGGCCGGGATCTTTGCGCCCGGCGGATCGGGGTCCGGGTCGGGTGCCGGACCCGGCAGCTTCCCGTTCCCCGGTGCCGCGTTCCCGCCACACCCCCACCACCCCCACGCGCACCTGGACCGCAGGCTGCTGAGGGCGCCCGGCAGGGCGTCGCGCCCCAAGAAGCAGTTCATCTGCAAGTTCTGCAGCCGGCAGTTCACCAAGTCGTACAACCTGCTGATCCACGAGCGCACGCACACGGACGAGCGGCCCTACTCGTGCGACATCTGCGGCAAGGCGTTCAGGCGGCAGGACCACCTCAGGGACCACAGGTACATCCACTCCAAGGAGAAGCCCTTCAAGTGCGGCGAGTGCGGGAAAGGTTTCTGCCAGTCGCGGACGCTGGCCGTGCACAAGATCCTGCACATGGAGGAGTCGCCGCACAAGTGCCCCGTGTGCAGCCGCAGCTTCAACCAGCGCTCCAACCTCAAGACGCACCTGCTCACGCACACAGACCACAAGCCCTATGAGTGCGGCTCCTGCGGCAAGGTGTTCCGGCGCAACTGCGACCTGCGGCGCCACGCCCTCACGCACGCCGTGGG CGACGTCCCGCCCGAGGTGCTGGGCGAGGCGTCAGCGAGCCGTCCCGACCCACCGCCGCCGCCGCCACCACCCCCTCCGCCCCCGCTCAAAGAGTCGTCAGAGTCGACGCCTCCGCCACCGCCGCCGAGGCGCGGGTCGCCGCCTCCGACGACGCGCTGTCATCACCACGACGCAGCATCGTCATCGTCCTCGTATACAATGCGCCCCCCGCCTCCCGAAGCGCCCCCGGACCCGCCCCTGCTGCAGATCAGGAGAGATCTGCTGCACAAGCCGTCGACAGTGACGAGTCTGGAACCCACGCCGGGCACCAGCATGGGGGCGCTCGGGATATTCCGGAGAAAGCTGCCGGAGCCGCCGGACATCCGGGTGAGGAGCGCACTGCCCGCCACCGTGACGCGTCCCGACGCGGCCGATCCGGGGCCCTCCACATCCGCGTCCACGTCGACCTCGAGGCCGCCCGCCAGGAACCCGTCCACGAAGATGCACGGCTTCAGCATCGAGGAGATCATGAGGCGCTAG-3’(SEQ ID No:1)。

利用dsRNA设计网站E-RNAi(https://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3/)，将整个靶向的美洲大蠊bowl基因开放阅读框序列复制粘贴到网站中，通过设计参数筛选得到最佳的dsRNA靶向序列，dsRNA靶向序列的DNA序列如SEQ ID No:3所示。

5’-CGCTTCCGCGGGGTCGTCAGGCGGCGCTTCCACATCATCAGCCCCGCGGGA CGAACCCCTATCCCTGTCGCTACCGCGCCCGCCCTTGTCAGGGCGGAGCTCGTCGTCGTCGCGTGGAGGCCCCGGGTTCGAACTCTACCACCATCACCTGGCAGCCGGTCTGGGCGGCCTGCACCGAGAGAGTTCGGCCTTCGTGCCCGTCGTGCCCCAGCGCTTCGTGGCGTACCCTCCCCTTCTCATGGAGGACAAAGTCGAGGGCCGCAAGTCGACGTCTGGCACCAGCTTCGAGCTGATGGCGCTCATGGCCGACAAGAGGAAGGAGCTGGCGCTGAGGGAGGAGGCCGCACG-3’(SEQ ID No:3)。

然后设计用于扩增dsRNA靶向的引物序列，具体的，上游引物bowl F：5’-CGCTTCCGCGGGGTCGTC-3’(SEQ ID NO:4)，下游引物bowl R：5’-CGTGCGGCCTCCTCCCTC-3’(SEQ ID NO:5)。以cDNA为模板扩增得到含有靶向序列的DNA片段(SEQ ID No:3)，并将其克隆改到pTOPO载体(购自Aidlab)中，测序验证序列是否存在碱基突变，挑选没有任何突变的克隆用于后续实验，基于该步骤获得的载体命名为pTOPO-bowl。

采用PCR在靶向序列两侧引入T7启动子，具体方法为：用所设计的两端含有T7启动子的引物(5’-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGCGCTTCCGCGGGGTCGTC-3’(SEQ ID No:6)和5’-GGATCCTAATACGACTCACTATAGG CGTGCGGCCTCCTCCCTC-3’(SEQ ID No:7))，以pTOPO-bowl载体为模板进行扩增，得到两端含有T7启动子的PCR产物。

利用T7RiboMAX Express RNAi System(Promega Corporation)来合成正向和反向RNA，在T7 RNA聚合酶和DNaseI依次处理后将两条正反向的RNA混合并70℃处理10min，然后逐渐降温到室温使其退火变成dsRNA，即得到如SEQ ID No:2所示的核苷酸序列和相对应的反向互补的核苷酸组成的双链RNA。

5’-CGCUUCCGCGGGGUCGUCAGGCGGCGCUUCCACAUCAUCAGCCCCGCGG GACGAACCCCUAUCCCUGUCGCUACCGCGCCCGCCCUUGUCAGGGCGGAGCUCGUCGUCGUCGCGUGGAGGCCCCGGGUUCGAACUCUACCACCAUCACCUGGCAGCCGGUCUGGGCGGCCUGCACCGAGAGAGUUCGGCCUUCGUGCCCGUCGUGCCCCAGCGCUUCGUGGCGUACCCUCCCCUUCUCAUGGAGGACAAAGUCGAGGGCCGCAAGUCGACGUCUGGCACCAGCUUCGAGCUGAUGGCGCUCAUGGCCGACAAGAGGAAGGAGCUGGCGCUGAGGGAGGAGGCCGCACG-3’(SEQ ID No:2)。

实施例2dsRNA的美洲大蠊活体注射实验

挑选刚蜕皮的美洲大蠊进行饲养，在其蜕皮后的第二天将其低温麻醉后放在显微镜解剖台上，然后使用显微注射方法将靶向bowl基因的dsRNA(SEQ ID No:2)按照一定的剂量(注射1μL，浓度是1μg/μL)注射到美洲大蠊的腹部作为bowl基因干扰组，总共注射一次，同时以注射无法靶向美洲大蠊任何內源基因的dsMock(GAAAGCUCGGUACCACGCAUGCUGCAGACGCGUUACGUAUCGGAUCCAGAAU UCGUGAUAUCUGAAUUCGUCGACAAGCUUCUCGAGCCUAGGCUAGCUCUAGACCACACGUGUGGGGGCCCGAGCUCGCGGCCGCUGUAUUC(SEQ ID No:10))为对照组，注射后持续观察dsRNA处理对美洲大蠊肢体再生的影响，在使基因表达量降低的情况下研究bowl基因对美洲大蠊伤口修复和肢体再生的影响。

(一)dsRNA对bowl基因干扰效果验证

在注射一次dsRNA后的48h将美洲大蠊麻醉并进行解剖，将其腿部组织解剖出来并提取RNA，使用RN28-EASYspin Plus组织/细胞RNA快速提取试剂盒(Aidlab，RN2802)对脂肪体进行处理，按照试剂盒说明书进行操作。利用Nanodrop One对RNA浓度进行测定，然后量取2μg RNA进行反转录得到cDNA。利用premier 5引物设计软件设计qPCR引物(5’-GCTGTGACGCCGTTGATTTCT-3’(SEQ ID No:8)和5’-GCGGGGCTGATGATGTGG-3’(SEQ ID No:9))，使用SYBR Green qPCR mix进行基因表达定量检测，通过对定量结果进行分析，检测靶基因干扰效果。

结果如图1所示，可以发现dsRNA处理可以显著干扰靶基因bowl的表达。

(二)美洲大蠊断再生情况观察与统计

与对照组(注射无法靶向美洲大蠊任何内源基因的dsMock)进行比较，观察bowl基因干扰组的美洲大蠊的肢体再生异同，并进行统计。

实验结果发现，注射对照组的美洲大蠊在蜕皮断肢后可以正常长出新的正常附肢(新附肢的长度正常)，bowl基因干扰组的美洲大蠊出现再生障碍，只能长出很小比例的肢体组织(新附肢的长度显著低于对照组)(图2中A)，从而极大的影响了其活动能力，降低了其生存能力，从而达到了防治的效果。进一步统计bowl基因干扰组和对照组美洲大蠊的断肢再生能力，结果如图2中B所示，两组美洲大蠊的断肢再生能力存在显著差异，从而证明了bowl基因可以在美洲大蠊伤口修复和肢体再生中发挥重要作用。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。