微型多光子显微成像装置及使用方法

技术领域

本申请涉及光学成像技术领域，特别是涉及一种微型多光子显微成像装置及使用方法。

背景技术

在自由活动的动物中直接记录其神经元活动是研究动物行为与神经功能之间的关系最直接有效的方法之一。而微型多光子显微成像装置凭借其良好的光学切片能力、较深的穿透深度以及较轻的重量成为对神经元观测中最重要和最广泛使用的工具。

在使用现有的微型多光子显微成像装置对待观测活体的神经元活动进行观测时，需要将微型多光子显示成像装置的探头固定在活体的待观测区域上。因此，每次对同一个活体的固定区域的神经元进行观测前，都需要将活体的身体用固定器进行固定，再将多光子显微成像装置的探头固定在正确的位置。但这样的过程耗时耗力，并且每次确定的位置都可能具有一定的偏差。

发明内容

第一方面，提供一种微型多光子显微成像装置，包括：探头；支架，用于固定所述探头，且与所述探头可拆式连接；连接板，与所述支架永久固定在一起，所述连接板用于与待观测活体连接。

第二方面，提供一种微型多光子显微成像装置的使用方法，所述方法包括：所述微型多光子显微成像装置包括：探头；支架，用于固定所述探头，且与所述探头可拆式连接；连接板，与所述支架永久固定在一起，所述连接板用于与待观测活体连接；所述方法包括：将所述连接板连接至待观测活体的目标区域；将所述探头固定在所述支架上，以对所述活体的目标区域进行观测；观测结束后，保持所述连接板与所述活体连接，并将所述探头从所述支架拆卸下来；当需要对所述目标区域进行重复观测时，将所述探头重新与所述支架固定在一起。

本申请的实施例为微型多光子显微成像装置的探头设置一个固定探头的支架，并且支架与探头之间可拆卸连接，同时支架被设置为与连接板永久固定在一起，连接板用于与待观测活体连接。因此使得微型多光子显微成像装置的探头与支架之间可以重复安装和拆卸，还能避免每次对同一活体的固定区域进行观测前需要寻找待观测位置的麻烦，能够极大地提升观测效率。

附图说明

图1是现有微型多光子显微成像装置结构示意图。

图2是现有微型多光子显微成像装置中的探头内的光路系统的示意图。

图3是本申请实施例提供的微型多光子显微成像装置在一种状态下的结构示意图。

图4是本申请实施例提供的微型多光子显微成像装置在另一种状态下的结构示意图。

图5是本申请实施例提供的微型多光子显微成像装置在又一状态下的结构示意图。

图6是本申请实施例提供的连接板的结构示意图。

图7是本申请实施例提供的支架的结构示意图。

图8是本申请实施例提供的微型多光子显微成像装置的使用方法的示意性流程图。

图9是本申请实施例提供的微型多光子显微成像装置的使用过程示意图。

图10是将本申请实施例提供的一种微型多光子显微成像装置固定在小鼠头部的示意图。

图11是本申请实施例提供的一种微型多光子显微成像装置固定在可自由活动的小鼠头部的示意图及其观测结果图。

图12是对小鼠头部同一位置进行为期一个月的观测的神经元变化图。

图13是小鼠在三种不同情况下的活动轨迹图及其运动距离和运动速度的对比图。

具体实施方式

在自由活动的动物中直接记录其神经元活动是研究动物行为与神经功能之间的关系最直接有效的方法之一。而微型多光子显微成像装置凭借其良好的光学切片能力、较深的穿透深度以及较轻的重量成为对神经元观测中最重要和最广泛使用的工具。

为了便于理解，下面结合图1和图2，对现有微型多光子显微成像装置及其存在的问题进行举例说明。

如图1所示，现有的微型多光子显微成像装置可以包括探头1、集成在探头上的支架11、颅骨的连接板3、载波片5以及集成在探头内的光路系统12。在使用微型多光子显微成像装置对活体的内部神经进行观测时，需要将被观测的活体的身体用固定器进行固定，利用台式多光子显微成像装置在活体4上选取待观测位置，然后将集成在多光子显微成像装置的探头1上的支架11粘合固定在活体4上的待观测位置。由于支架11和探头1是集成一体的，因此探头1也被固定在了活体4的待观测位置。

安装完成后，放开活体，通过光路系统12对活体的内部神经元进行观测。光路系统12的具体组成如图2所示：光线导入装置121用于接收光源输出的光线并导入到微型装光子显微成像装置的探头内。准直器122用于准直来自光线导入装置121的光线，减少不同频率光线之间的色差，以提高传输效率和激发效率。扫描仪124通过改变光线入射角角度，对活体内部的目标区域平面进行二维平面扫描。其中平面扫描指的是在活体内部的某一固定深度(深度不同，轴向位置或Z轴位置不同)的XY平面进行扫描。扫描透镜126设置在扫描仪124和物镜6之间的光路上，用于将扫描仪124二维扫描所产生的角度变化的光线转化成位置变化的光线。物镜6用于将导入的光线汇聚到活体的目标区域的内部，从而激发活体对象产生荧光信号。物镜6还用于输出荧光信号。双色镜129设置在物镜6和采集透镜128之间的光路上，用于将激光和荧光信号分开以及输出荧光信号。采集透镜128用于有效收集透过双色镜129的荧光信号。荧光信号输出装置127用于接受通过采集透镜128的荧光信号，并输出荧光信号。通过荧光信号即可得知该活体的待观测区域的神经元活动。

观测完成后，再次将活体的身体用固定器进行固定，拆下支架11。如果需要再一次对同一个活体4的相同位置进行观测，就需要再一次固定活体，同时再一次将支架11粘合固定在活体4上的待观测位置。

通过以上表述可知，每次对同一个活体的固定区域的神经元进行观测前，都需要将活体的身体用固定器进行固定，利用台式多光子显微成像装置在活体身上选取待观测位置，再将多光子显微成像装置的探头固定在此位置。但这样的过程耗时耗力，并且每次确定的位置都可能具有一定的偏差。

为了解决上述问题，本申请提供一种微型多光子显微成像。作为一种实现方式，如图3-5所示，为其探头1设置一个固定探头的支架2，且支架2与探头1为可拆式连接，同时支架2与连接板3被永久固定在一起。

当需要用微型多光子显微成像装置对活体4的神经元进行观测时，只需要首次将该微型多光子显微成像装置中与支架2永久固定的连接板3固定在待观测位置，再将探头1连接在支架2上。由于支架2与探头1为可拆式连接，所以观测完成后可单独拆下探头1。如果需要再次对同一活体4的同一位置进行观测，只需将探头1重新连接到支架2上。

因此可见，该微型多光子显微成像装置的探头1与支架2之间的安装和拆卸可以被重复进行，拆装过程非常方便。并且由于支架2的位置固定不变，不需要每次对同一活体观测前寻找待观测位置，能够精准定位到待观测区域，因此极大地提升观测效率。

此外，如图1所示，连接板3的底部通常装有载波片5，由于现有的微型多光子显微成像装置中的探头1的微型光路系统的工作距离较短，使得物镜6需要直接接触载玻片。由于载玻片5没有保护，如果物镜6将载玻片5直接碰坏，容易造成待观测活体的内部的感染。

为了防止载玻片5破碎的现象，对微型多光子显微成像装置中的探头内的物镜进行了重新设计，从而将微型光学系统的工作距离进行了扩展。因此作为一种实现方式，如图6所示，可以在连接板3上设置窗片31，并且窗片31位于载波片5的上方。在此基础上，载玻片5能够受到较好的保护，避免物镜6跟载玻片5的直接接触，从而可以避免载玻片5的破碎对待观测活体的内部造成感染。

作为一种实现方式，如图6所示，连接板3需要安装在活体4的目标区域上，可以在连接板3上设计安装孔32。通过安装孔32可以将连接板3安装在活体4的目标区域上，连接方式可以是通过安装孔安装螺钉或者通过安装孔在孔及孔的周边使用氰基丙烯酸胶或者牙胶。在此基础上，可以简单方便的实现连接板3的安装。需要说明的是，安装孔32的形状和数量不做限制，通过安装孔与待观测活体的连接方式也不受限制。

作为一种实现方式，如图7所示，该微型多光子显微成像装置的支架2上可以设置容纳物镜的孔21。该孔21可以位于支架2的底面上，物镜6可以穿过该孔21接触连接板3上的窗片31。使得支架2对探头1起到支撑作用的同时还能对物镜6部分形成容纳空间。

需要说明的是，图6和图7不是本申请实施例实现的唯一方式，只要是与本申请实施例中的连接板3和支架2的作用相同的其他结构形式，均落入本申请的保护范围。

作为一种实现方式，该微型多光子显微成像装置的探头1与支架2之间可通过螺钉7拆卸连接。从而简单方便的实现重复拆装过程。

需要说明的是本申请实施例的探头1与支架2之间的可拆式连接方式不限于此，该微型多光子显微成像装置的探头1与支架2之间也可通过销子拔插式拆卸连接；或者探头1与支架2可直接设计为可拔插结构，或者探头和支架之间可以为磁吸连接或者卡扣连接；或者探头与支架之间设计为螺纹连接。只要探头1与支架2之间的连接方式是可拆的，任何其他结构均落入本申请的保护范围。

可选地，该微型多光子显微成像装置的支架2上可以设置用于安装螺钉7或者销子的孔22。

作为一种实现方式，该微型多光子显微成像装置中的探头内的光路系统包括：变焦器件，用于对待观测活体对象内的神经元进行轴向的扫描(或称Z轴扫描)；扫描仪，用于对所述神经元进行平面扫描(该平面与内部组织的轴向垂直，该平面扫描也可称为X-Y平面扫描)；光学系统，位于所述变焦器件和所述扫描仪之间，所述光学系统的设置使所述变焦器件的实际变焦位置与所述扫描仪的位置重合，或使所述实际变焦位置处于所述变焦器件的位置和所述扫描仪的位置之间。从而实现对不同工作距离(成像深度)的像面进行成像，同时避免扫面仪器和变焦器件之间对焦复杂的问题。

上述变焦器件例如可以是液体变焦透镜，如电可调透镜(electrically tunablelens，ETL)。

作为一种实现方式，该光学系统包括焦距相同的第一透镜和第二透镜；所述第一透镜位于所述变焦器件和所述第二透镜之间，所述第二透镜位于所述第一透镜和所述扫描仪之间，所述第一透镜和所述第二透镜形成4f系统。通过4f系统可以更容易的调节扫面仪器和变焦器件之间的焦点，使之重合。

上文结合图3-图7，详细描述了本申请的装置实施例。下面结合图8，描述本申请的使用方法实施例。应理解，使用方法实施例的描述与装置在实施例的描述相互对应，因此，未详细描述的部分可以参见前面装置实施例。

图8是本申请实施例提供的微型多光子显微成像装置的使用方法的示意性流程图。

图8的方法包括步骤：

S610，将所述连接板连接至待观测的活体的目标区域；

S620，将所述探头固定在所述支架上，以对所述活体的目标区域进行观测；

S630，观测结束后，保持所述连接板与所述活体连接，并将所述探头从所述支架拆卸下来；

S640，当需要对所述目标区域进行重复观测时，将所述探头重新与所述支架固定在一起。

具体使用过程示意如图9所示。其中步骤S610前需要对活体对象进行手术。手术一到两周后，用牙胶将连接板3固定在活体的目标区域上，再将支架永久安装在连接板上。

作为一种实现方式，步骤S620中对所述活体的目标区域进行观测的方法还包括步骤：

S621，控制变焦器件，以对待观测活体的目标区域进行轴向的激光扫描；

S622，控制扫描仪，以对所述目标区域进行平面激光扫描；

S623，控制所述变焦器件的实际变焦位置，使得所述变焦器件的实际变焦位置与所述扫描仪的位置重合，或使所述实际变焦位置处于所述变焦器件的位置和所述扫描仪的位置之间。

作为一种实现方式，探头和支架之间为可插拔式连接。

可选地，探头与支架之间的连接也可用螺钉或者销子实现快速的插拔连接。

需要说明的是，探头与支架也可直接被设计为可拔插的结构，或者探头和支架之间可以为磁吸连接或者卡扣连接；或者探头与支架之间为螺纹连接。只要探头与支架之间的连接方式是可拆的，任何其他结构均落入本申请的保护范围。

需要说明的是，本申请对待观测活体的类型不做限制，例如可以是小鼠，如图10所示，也可以是其他类型的动物。本申请对观测部位或观测内容不做限制，例如，可以是脑神经、脊柱神经等。因此连接板3可以固定连接于待观测活体的身体部位的任意位置，只要该位置内有神经元。图11中的(a)为将本申请的微型多光子系统固定在可自由活动的小鼠的脑部，并对其脑神经进行的观测，观测结果如图11中的(b)所示。

由于该微型多光子显微成像装置的探头与支架之间的安装和拆卸可以被重复进行，因此拆装过程非常方便。并且由于支架的位置固定不变，不需要每次对同一活体观测前寻找待观测位置，能够精准定位到待观测区域，因此极大地提升观测效率。也就是说通过该微型多光子显微系统可以实现对活体的长期观测，同时在这期间可以有不观测的时间段，而经历了每次不观测时间后重新进行观测时，可以非常方便的将其精确的安装到待观测的位置。图12为用本申请的微型多光子显微成像装置对小鼠脑部同一位置进行为期一个月的观察的神经元变化图。

需要说明的是，本申请涉及的微型多光子显微成像装置，可以是微型多光子显微镜或包含微型多光子显微探头的其他设备。同时，本申请涉及的多光子可以是：双光子、三光子、二次谐波或三次谐波等非线性激发信号。

需要说明的是，本申请中“微型”指的是多光子显微成像装置在观测活体期间，对待观测活体的活动影响较小。由于本申请实施例提供的一个多光子微型显微成像装置的安装于活体头部，其重量为4.2g，因此，设计了小鼠头部无负载、有4.2g负载与头部装有本申请提供的一种微型化多光子显微镜的对比实验，实验结果如图13。图13中的(a)显示了小鼠无负载自由活动的活动轨迹；图13中的(b)显示了小鼠的头部有4.2g负载的活动轨迹；图13中的(c)显示了小鼠的头部装有本申请实施例提供的一种微型化多光子显微系统的运动轨迹。图13中的(d)为上述三种情况的运动距离对比图，图13中的(e)为上述三种情况的运动速度对比图。由图8可看出，本申请的多光子微型化显微系统对小鼠的运动轨迹、运动距离、运动速度几乎没有影响。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。