一种高产水溶性蛋白腐乳的制备方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高产水溶性蛋白腐乳的制备方法。

背景技术

腐乳是我国的一种独具特色的发酵食品，以其营养丰富、质地细腻、滋味鲜美而越来越受到国内外消费者的喜爱。腐乳的制备一般包括两个过程，即大豆制备成豆腐的物理、生物过程，以及豆腐接种毛霉经过前发酵、后发酵等的生物过程。国内主要在低盐腐乳、新型再制腐乳等方面做了大量的研究工作，但对腐乳从豆腐到腐乳的整个流程研究较少，而商品腐乳多是受控于人工操作之下的纯种发酵，乳酸菌资源有限，而以家庭作坊式经自然发酵的腐乳，发酵原料中天然附着的自然微生物依然存在并参与发酵，微生物资源丰富，却没有得到充分的发掘与利用，因采用的豆腐坯（制备腐乳的豆腐块）、毛霉菌和发酵工艺的不同对水溶性蛋白的含量均会有较大影响，如何有效在保证腐乳风味的基础上有效提高水溶性蛋白在腐乳制备领域研究较少，且并无较为明确的可实际应用于生产的技术记载。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种高产水溶性蛋白腐乳的制备方法。

豆腐腐乳的制备一般包括两个阶段，即大豆制备成豆腐的物理、生物过程，以及豆腐接种毛霉经过前发酵、后发酵等的生物过程。

一种高产水溶性蛋白腐乳的制备方法：

利用植物乳杆菌制备豆腐白坯，包括如下步骤：

a.筛选浸泡：将经过筛选去除杂质的大豆送入泡料罐中清水浸泡；

b.磨浆：浸泡好的大豆用砂轮磨磨细；

c.浆渣分离：

d.加温浆：用溢流煮浆罐，或直接送入烧浆罐，将豆浆加热到95-98°C以上；

e.放浆混合：将熟浆放入榨缸内并与搅碎的豆边混合均匀；

f.采用植物乳杆菌CGMCCNo.16112发酵液点浆；

g.制坯：将豆腐脑用布包好，再用豆腐板压好，推入压榨机压制成豆腐片。包布使用前用热水煮10分钟以上；

h.切块：用切块机将压榨成型的豆腐片切成的豆腐块；切块产生的豆边及时绞碎返至放浆工序。

所述植物乳杆菌于2018年07月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为∶CGMCCNo.16112，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；

制备所的大豆喷洒总状毛霉孢子悬浮液至豆腐白坯表面进行前发酵，所述总状毛霉于2018年01月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为∶CGMCCNo.15265，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；

前发酵的培养温度为18-25℃，发酵时间为50~65h，发酵完成后自然光下晾晒1~2天，然后搓毛腌制，加入配料、装瓶后进行密封后发酵至产品成熟。

进一步，所述前发酵时的pH值为3-4。

进一步，所述搓毛腌制为用手抚抹毛坯上毛霉菌丝，使其包裹在豆腐坯上，块块搓开不连合,将搓开的毛坯整齐的码放在塑料盒中，一层豆腐撒一层盐腌制110-120小时。

进一步，所述撒盐的量为每100克豆腐0.1克盐。

进一步，加入配料、装瓶后进行密封后发酵60~80天即可成熟。本发明的有益效果：

1、植物乳杆菌和自然发酵酸浆豆腐中有机酸的总量相近，但乳酸产量远远高于采用自然发酵的酸浆，大量的乳酸产生能保证在豆腐制备过程中p H长期保存在3~4间，这非常利于大豆蛋白质水化。其制备获得的豆腐白坯的蛋白质含量高于采用自然发酵酸浆豆腐的蛋白质含量，一般可比采用自然发酵酸浆豆腐的蛋白质含量高2%~4%。

2、在腐乳腌制发酵过程中采用了新型总状毛霉菌，通过对其发酵温度和时间的调控，有效的获得了在有效在保证腐乳风味的基础上有效提高水溶性蛋白含量的制备方案，该方法制备获得牟定腐乳水溶性蛋白含量远远高于标准值。

3、通过在豆腐腐乳的制备的二个阶段，即大豆制备成豆腐的物理、生物过程，以及豆腐接种毛霉经过前发酵、后发酵等的生物过程中采用新菌种和新工艺，有效的改变了传统牟定腐乳制备无法获得较高水溶性蛋白含量的技术问题；同时，为如何有效提高腐乳水溶性含量开拓出了一条新的研发方向。

生物材料保藏信息：

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）于2018年07月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为∶CGMCCNo.16112，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

总状毛霉（Mucor racemosus）于2018年01月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为∶CGMCCNo.15265，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1是实施例2中豆腐制备发酵过程中7种有机酸总量含量对照图。

图2是实施例2送检报告检测数据。

图3是实施例3送检报告检测数据。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明采用的的符合《GB 4789.2-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》、《GB 478915-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》对腐乳毛坯的霉菌进行采集、培育，所获的菌种均已在申请日前保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为∶CGMCCNo.16112、保藏编号为∶CGMCCNo.15265，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

通过校企联合以云南牟定天台羊泉、牟定润丰源、牟定华峰、牟定天和等十三家腐乳生产公司采集到的腐乳样品为材料，采用传统生物学筛选，结合形态学、分子生物学鉴定、生理生化鉴定等方法对分离菌种进行鉴定，从腐乳传统生产环境中分离纯化得到多株适合腐乳生产的优质菌株，已保藏了多株可用于腐乳生产的毛霉菌株和植物乳杆菌至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）和中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏。

实施例1：

植物乳杆菌CGMCCNo.16112的菌种分离提纯鉴定方法：

以云南牟定天台羊泉腐乳生产公司（云南羊泉生物科技股份有限公司）采集到的腐乳样品为材料。


称取10g样品于90mL无菌水中，用玻棒捣碎并强力振荡5 min，即成为10

16S rDNA序列的PCR扩增∶取上述纯化的培养物，采用biosopin细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA，作为PCR扩增的模板，利用16S引物进行PCR扩增。PCR反应体系为50uL∶10xPCR Buffer5uL，基因组 DNA2uL（25nguL），dNTP（脱氧核苷三磷酸，deoxyNTP）0.6 uL（10mmoLL），10pumoL的Primer各2 uL，Taq DNA聚合酶0.6uL（2.5U/uL），ddH;O37.8L。PCR扩增程序∶94℃变性5min，94℃变性30s，50℃退火 30s，72℃延伸90s，30个循环，72℃延伸10min。

16S r DNA扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行检验，电泳结果用琼脂糖凝胶成像仪拍照记录，产物送至华大基因公司测序，测序结果拼接后用BLAST程序在GENBANK数据库中进行比对，根据比对结果分析菌种的种属地位和形态特征。

实施例2：

利用植物乳杆菌CGMCCNo.16112制备豆腐白坯，包括如下步骤：

a.筛选浸泡：将经过筛选去除杂质的大豆送入泡料罐中清水浸泡；

b.磨浆：浸泡好的大豆用砂轮磨磨细；

c.浆渣分离：

d.加温浆：用溢流煮浆罐，或直接送入烧浆罐，将豆浆加热到95-98°C以上；

e.放浆混合：将熟浆放入榨缸内并与搅碎的豆边混合均匀；

f.采用植物乳杆菌CGMCCNo.16112发酵液点浆；

g.制坯：将豆腐脑用布包好，再用豆腐板压好，推入压榨机压制成豆腐片。包布使用前用热水煮10分钟以上；

h.切块：用切块机将压榨成型的豆腐片切成的豆腐块；切块产生的豆边及时绞碎返至放浆工序。

植物乳杆菌CGMCCNo.16112发酵液的制备采用在MRS培养基（含有0.5%CaCO）中，于37℃恒温培养48 h后，转移至制坯中豆腐压块的过滤液中，于35-37℃扩大培养48h，即可获得植物乳杆菌CGMCCNo.16112发酵液。

自然发酵的酸浆之所以能够作为豆腐凝固剂，是因为乳酸菌代谢产生了较多有机酸。经过对采用植物乳杆菌CGMCCNo.16112发酵液点浆过程中的pH进行检测，发现随着发酵过程的进行，采用植物乳杆菌CGMCCNo.16112黄浆水的p H值逐降低，植物乳杆菌发酵黄浆水过程中p H值变化较快，发酵结束时p H值最低为3.65，表明植物乳杆菌产酸较快且具有较强的产酸能力。

为对比，对采用自然发酵的酸浆的黄浆水过程中p H值同样进行了对照检测，发现采用自然发酵的酸浆的黄浆水，在整个发酵过程中，发酵前期p H 值下降较快，而发酵后期p H 值变化则较慢，并趋于平稳，发酵发酵结束时p H值最低为4.55，p H 值较高，表明产酸能力较弱。

如图1所示，同时，对采用植物乳杆菌CGMCCNo.16112发酵液点浆过程中黄浆水的甲酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、丁二酸等7种有机酸总量变化进行了检测，黄浆水经植物乳杆菌发酵24 h 后，7种有机酸的总量从 7.55 g/L 增加到 15.81g/L。其中乳酸含量从最开始的0 g/L 增加至 7.37 g/L，占总酸含量的45.98%；乙酸在发酵的前 2 h 含量降低，随后逐渐升高，趋于平缓；柠檬酸含量变化较小；丁二酸含量呈现先升高随后降低的趋势。因此乳酸含量较高。

为对比选用采用自然发酵的酸浆的黄浆水作为对照进行检测，经自然发酵的酸浆发酵 24 h 后，7种有机酸的总量从 7.15 g/L 增加到 15.39g/L。其中乳酸含量从最开始的 0 g/L

增加至 3.72 g/L，占总酸含量的 24.17%；乙酸在发酵的前 2 h 含量降低，随后逐渐升高，趋于平缓；柠檬酸含量在整个发酵过程中逐渐降低；丁二酸含量呈现先升高随后降低的趋势。

植物乳杆菌和自然发酵酸浆豆腐中有机酸的总量虽然相近，但乳酸产量远远高于采用自然发酵的酸浆，大量的乳酸产生能保证在豆腐制备过程中p H长期保存在3~4间，这非常利于大豆蛋白质水化。且生产的乳酸菌含量较高，使豆腐凝胶的形成时间更短，豆腐凝胶的强度更大。

一般大豆约含36%的蛋白质，但依品种的不同而有差异，蛋白质含量可在36%~40%。大豆蛋白质中溶于水的占86—88%，而水溶性蛋白质中球蛋白（即大豆球蛋白）占84%。磨浆的目的在于尽可能把大豆的细胞破碎，使其中的可溶性蛋白质溶解出来。为了提高磨浆的效果，在磨浆前要将大豆浸在水中，经一定时间使细胞充分吸收水份。

蛋白质的水化受到pH的影响这是显然的，为本领域的公知认可，这是因为蛋白质分子中含有氨基和羧基，其具有酸碱两性和等电点。不同来源的植物蛋白质，其等电点具有显著差异。即使同种植物蛋白质,由于其结构与环境的不同，其等电点也各不相同。常见植物蛋白质的等电点介于pH4～pH6之间，而大豆蛋白的等电点在pH 4.5左右。在此条件下，蛋白质所带净电荷接近于零，蛋白质分子间缺乏静电斥力，其水化作用最弱溶解度最小。为了提高植物蛋白分子的水化能力和溶解度，因此，在满足口感和风味的前提下, 应使植物蛋白远离该植物蛋白的等电点。

而上述已经指出了采用自然发酵的酸浆p H值4.55会长期处于等电点附近，不利于大豆蛋白质溶于水，采用植物乳杆菌制备获得的豆腐蛋白质可以有效提升，为第二阶段豆腐接种毛霉经过前发酵、后发酵等的生物过程中提供较高含量的蛋白质。

经检测采用自然发酵的酸浆制备获得的豆腐的水份含量约为88%，蛋白质6%，粗脂肪3.5%，可溶性无氮物（糖质）1.9%；

而采用上述植物乳杆菌制备获得的豆腐的水份含量约为86%，蛋白质9.4%，粗脂肪2.8%，可溶性无氮物（糖质）1.4%。

总状毛霉CGMCCNo.15265可以有效保证腐乳的蛋白酶活力，提高腐乳的水溶性蛋白产出。

采用上述制备获得豆腐白坯。

喷洒浓度为10

然后，搓毛腌制手抚抹毛坯上毛霉菌丝，使其包裹在豆腐坯上，块块搓开不连合,将搓开的毛坯整齐的码放在塑料盒中，一层豆腐撒一层盐腌制110小时。

撒盐的量为每100克豆腐0.1克盐。

装瓶、灌汤后进行密封后发酵，后发酵采用发酵室室温在25℃，发酵80天。

首先通过分析前发酵过中蛋白酶的活力特征，因为腐乳发酵过程中蛋白酶活力的大小是蛋白质水解的表征之一，经过检测后发现：在前发酵阶段，霉菌生长繁殖开始大量分泌蛋白酶，因此开始缓慢提高；腌制阶段，由于食盐浸入坯体中会破坏蛋白酶的结构以及此时的毛霉生长繁殖趋于停滞，因此蛋白酶活力直线下降；进入后发酵时由于添加的各种辅料的作用，腐乳中蛋白酶活力又有回升的趋势。

在前发酵阶段，当发酵时间在54.88h，pH值为3.55，蛋白酶活力40.62µg/mL，蛋白酶活力最高，随着时间的延长，霉菌不断生长繁殖，菌丝群的代谢率处于旺盛期，因此蛋白酶活力不断增长；随着发酵时间的增长，蛋白酶活力从最大值开始较少，因此前发酵时间因选择在为50~65h内，优选的为55h左右为宜。

对腌制阶段和后发酵阶段则采取取样蛋白质水解程度的查定以分析水溶性蛋白质，分别采取腌制前腐乳、腌制后腐乳和后发酵阶段腐乳进行测定。

测定方法采用国标，“GB 5009.5-2016 食品安全国家标准食品中蛋白质的测定”进行。

通过取样检测获得，腌制前腐乳的水溶性蛋白质含量为2.76g/100g，腌制后由于食盐浸入坯体中会破坏蛋白酶的结构以及此时的毛霉生长繁殖趋于停滞，因此蛋白酶活力直线下降；腐乳的水溶性蛋白质含量为2.81g/100g。

进入后发酵时由于添加的各种辅料的作用，腐乳中蛋白酶活力又有回升的趋势，发酵期腐乳的水溶性蛋白质含量分别为，第10天时2.56g/100g，第20天时3.24g/100g，第30天时4.82g/100g，第40天时6.31g/100g，第50天时7.53g/100g，第60天时8.12g/100g，第70天时8.55g/100g，第80天时8.56g/100g。

通过将实施例2的试产产品送检后发现，其水溶性蛋白均远大于云南省地方标准DB53/T 713-2015《地理标志产品牟定腐乳》的水溶性蛋白要求；色泽、口感、形状均达到云南省地方标准DB53/T 713-2015《地理标志产品牟定腐乳》的色泽、口感、形状要求。

如图2所示，送检报告（第1页有关信息如下所示），报告由楚雄州质量技术监督综合检测中心（云南省酒类产品质量监督检测中心）检测，判断标准为云南省地方标准DB53/T713-2015《地理标志产品牟定腐乳》，报告编号Y15J20183555，送检日期2018年12月8日，送检样品规格200g/瓶，送检数量8瓶；水溶性蛋白质含量为8.74g/100g，远远大于标准值3.5g/100g。

实施例3：

仍采用如实施例2所述的植物乳杆菌制备获得豆腐白坯。

喷洒浓度为10

然后，搓毛腌制手抚抹毛坯上毛霉菌丝，使其包裹在豆腐坯上，块块搓开不连合,将搓开的毛坯整齐的码放在塑料盒中，一层豆腐撒一层盐腌制120小时。

撒盐的量为每100克豆腐0.1克盐。

装瓶、灌汤后进行密封后发酵，后发酵采用发酵室室温在35℃，发酵60天。

首先通过分析前发酵过中蛋白酶的活力特征，因为腐乳发酵过程中蛋白酶活力的大小是蛋白质水解的表征之一，经过检测后发现：在前发酵阶段，霉菌生长繁殖开始大量分泌蛋白酶，因此开始缓慢提高，且随着发酵温度相对于实施例2的提升，蛋白酶活性也有所提升；腌制阶段，由于食盐浸入坯体中会破坏蛋白酶的结构以及此时的毛霉生长繁殖趋于停滞，因此蛋白酶活力直线下降；进入后发酵时由于添加的各种辅料的作用，腐乳中蛋白酶活力又有回升的趋势。

在前发酵阶段，当发酵时间在52.84h，pH值为3.45，蛋白酶活力42.81µg/mL，蛋白酶活力最高，随着时间的延长，霉菌不断生长繁殖，菌丝群的代谢率处于旺盛期，因此蛋白酶活力不断增长；随着发酵时间的增长，蛋白酶活力从最大值开始较少，因此前发酵时间因选择在为50~65h内，优选的为55h左右为宜。

对腌制阶段和后发酵阶段则采取取样蛋白质水解程度的查定以分析水溶性蛋白质，分别采取腌制前腐乳、腌制后腐乳和后发酵阶段腐乳进行测定。

测定方法采用国标，“GB 5009.5-2016 食品安全国家标准食品中蛋白质的测定”进行。

通过取样检测获得，腌制前腐乳的水溶性蛋白质含量为2.81g/100g，腌制后由于食盐浸入坯体中会破坏蛋白酶的结构以及此时的毛霉生长繁殖趋于停滞，因此蛋白酶活力直线下降；腐乳的水溶性蛋白质含量为2.87g/100g。

进入后发酵时由于添加的各种辅料的作用，腐乳中蛋白酶活力又有回升的趋势，发酵期腐乳的水溶性蛋白质含量分别为，第10天时3.06g/100g，第20天时4.62g/100g，第30天时5.58g/100g，第40天时6.92g/100g，第50天时7.53g/100g，第60天时8.42g/100g。

通过将实施例2的试产产品送检后发现，其水溶性蛋白均远大于云南省地方标准DB53/T 713-2015《地理标志产品牟定腐乳》的水溶性蛋白要求；色泽、口感、形状均达到云南省地方标准DB53/T 713-2015《地理标志产品牟定腐乳》的色泽、口感、形状要求。

如图3所示，送检报告（第1页有关信息如下所示），报告由楚雄州质量技术监督综合检测中心（云南省酒类产品质量监督检测中心）检测，判断标准为云南省地方标准DB53/T713-2015《地理标志产品牟定腐乳》，报告编号Y15J20183557，送检日期2018年12月8日，送检样品规格200g/瓶，送检数量8瓶；水溶性蛋白质含量为8.41g/100g，远远大于标准值3.5g/100g。

以上通过具体的和优选的实施例详细的描述了本发明，但本领域技术人员应该明白，本发明并不局限于以上所述实施例，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。