一种大麻二酚衍生物及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药领域，特别涉及一种大麻二酚衍生物及其制备方法。

背景技术

大麻提取物中鉴定出的60多种植物大麻素中，最丰富的两个主要活性成分是精神活性成分Δ9-四氢大麻酚(THC)和非精神活性成分大麻二酚(CBD)。大麻素显示出广泛的治疗作用，许多大麻素，尤其是CBD，显示具有有效的抗炎和免疫调节活性。现有技术中也有对CBD进行分子设计，来改善CBD作用的研究。

如Juknat,A.在CBD碳链苄位引入两个甲基能够明显提高CBD衍生物抗炎活性，降低IL6和TNFαmRNA表达(Juknat,A.J Basic Clin Physiol Pharmacol 2016,27(3),289-96.)。再如CBD具有较大的细胞毒性，在10μM CBD浓度下，LPS处理的BV-2细胞在6h后出现明显死亡(Kozela,E.Journal ofBiological Chemistry2010,285(3),1616-1626.)。而Kinney,W.A.通过对侧链4号碳引入极性基团得到KLS-13019(Kinney,W.A.ACS Med ChemLett2016,7(4),424-8)，其治疗指数和神经保护活性明显提高。

但是现有CBD及其衍生物抗炎效果不够好，并且具有较大毒性，限制了CBD及其衍生物的运用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种大麻二酚衍生物及其制备方法。本发明提供的大麻二酚衍生物能够有效提升CBD的抗炎活性，降低其细胞毒性。

本发明提供了一种大麻二酚衍生物，具有式Ⅰ所示结构：

其中：

R

R

R

n为0～12。

优选的，R

所述卤素选自氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。

优选的，选自式Ⅰ-1～式Ⅰ-9所示结构中的一种或几种：

本发明还提供了一种上述技术方案中所述的大麻二酚衍生物的制备方法，包括以下步骤：

a)化合物X与溴化苄反应，形成化合物a；

b)化合物a与化合物Y反应，形成化合物b；

c)化合物b与三溴化磷反应，形成化合物c；

d)化合物c与氮杂环化合物反应，形成化合物d；

e)化合物d脱除苄基后，与反式-薄荷基-2,8-二烯-1-醇反应，形成式Ⅰ化合物；

或

化合物d脱除苄基后，与反式-薄荷基-2,8-二烯-1-醇反应，再与将所得反应物与R

其中：

R

R

R

所述氮杂环化合物选自以下化合物中的一种或几种：

所述化合物Y为硼氢化钠或C1～C12的烷烃。

优选的，所述步骤a)中，所述反应的温度为20～60℃，时间为12～48h；

所述化合物X与溴化苄的摩尔比为1∶(2～6)。

优选的，所述步骤b)中：

所述化合物Y的引入温度为-78～-20℃，

所述反应的温度为20～35℃，时间为2～8h；

所述化合物a与化合物Y的摩尔比为1∶(1～3)。

优选的，所述步骤c)中：

所述反应的温度为20～120℃，时间为4～12h；

所述化合物b与三溴化磷的摩尔比为1∶(1～3)。

优选的，所述步骤d)中；

所述反应在NaH的作用下进行；

所述NaH的引入温度为-40～-20℃；

所述反应的温度为20～100℃，时间为12～48h；

所述化合物c与氮杂环化合物的摩尔比为1∶(1.5～3)；

所述化合物c与NaH的摩尔比为1∶(2～4)。

优选的，所述步骤e)中：

所述反应的温度为20～35℃，时间为2～6h。

优选的，所述步骤e)中：

R

或

R

所述脱除苄基在Pd/C催化剂作用下进行；

所述化合物d与Pd/C催化剂的摩尔比为1∶(0.5～1.5)。

本发明提供的大麻二酚衍生物，在CBD基础上通过对苄位取代基改进以及侧链改进，形成式Ⅰ所示特定结构，其能够提高其抗炎效果，并降低毒性。实验结果表明，本发明提供的大麻二酚衍生物能够有效降低脂多糖处理BV-2细胞产生NO的药物浓度IC50、降低炎症因子mRNA表达和降低细胞毒性测试中的Viability值，表现出更佳的抗炎效果和较低的细胞毒性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为实施例1所得产物1f的核磁共振氢谱图；

图2为实施例1所得产物1f的核磁共振碳谱图；

图3为实施例1所得产物1f的质谱图；

图4为CBD衍生物抑制脂多糖处理BV-2细胞产生NO及细胞毒性效果图；

图5为CBD及实施例3所得化合物CIAC003抑制炎症因子mRNA生成的效果图；

图6为实施例3所得化合物CIAC003抑制炎症因子的机理研究效果图。

具体实施方式

本发明提供了一种大麻二酚衍生物，具有式Ⅰ所示结构：

其中：

R

R

R

n为0～12的整数。

更优选的，式Ⅰ所示大麻二酚衍生物选自式Ⅰ-1～式Ⅰ-9所示结构中的一种或几种：

本发明提供的大麻二酚衍生物，在CBD基础上通过对苄位取代基改进以及侧链改进，形成式Ⅰ所示结构，能够提高其抗炎效果，并降低毒性。

本发明还提供了一种上述技术方案中所述的大麻二酚衍生物的制备方法，包括以下步骤：

a)化合物X与溴化苄反应，形成化合物a；

b)化合物a与化合物Y反应，形成化合物b；

c)化合物b与三溴化磷反应，形成化合物c；

d)化合物c与氮杂环化合物反应，形成化合物d；

e)化合物d脱除苄基后，与反式-薄荷基-2,8-二烯-1-醇反应，形成式Ⅰ化合物；

或

化合物d脱除苄基后，与反式-薄荷基-2,8-二烯-1-醇反应，再与将所得反应物与R

其中：

R

R

R

所述氮杂环化合物选自以下化合物中的一种或几种：

所述化合物Y为硼氢化钠或C1～C12的烷烃。

关于步骤a)：化合物X与溴化苄反应，形成化合物a。

所述化合物X与溴化苄的结构分别如下：

其中，R

所述化合物X与溴化苄的摩尔比优选为1∶(2～6)。

所述反应优选在弱碱性条件下进行，提供弱碱性条件，能够使化合物X上的酚羟基电离，促使反应正向进行。提供弱碱性条件的碱性物质优选为碳酸钾、氢氧化钠和碳酸钠中的一种或几种。所述弱碱性物质与化合物X的摩尔比优选为(0.1～1)∶1。

所述反应优选在溶剂介质中进行。所述溶剂优选为丙酮、四氢呋喃、乙腈和N,N-二甲基甲酰胺中的一种或几种。所述化合物X与溶剂的用量比优选为1mmol∶(5～20)mL。

所述反应的温度优选为20～60℃；反应的时间优选为12～48h。经上述反应后，体系中生成化合物a。

本发明中，在上述反应后，优选还进行后处理。所述后处理包括：向反应体系加水稀释，用乙酸乙酯萃取，再用饱和NaCl洗涤，无水Na

其中，R

关于步骤b)：化合物a与化合物Y反应，形成化合物b。

所述化合物Y为硼氢化钠或C1～C12的烷烃。所述化合物a与化合物Y的摩尔比优选为1∶(1～3)。所述化合物Y的引入温度优选为-78～-20℃。

所述反应优选在有机溶剂介质中进行。所述有机溶剂优选为二氯甲烷、甲醇、四氢呋喃和N,N-二甲基甲酰胺中的一种或几种。所述化合物a与有机溶剂的用量比优选为1mmol∶(10～20)mL。

具体的，先将化合物a溶解于有机溶剂中，再于一定温度下加入化合物Y，搅拌混匀后，转移至室温进行反应。所述室温具体可为20～35℃，所述反应的时间优选为2～8h。经上述反应，生成化合物b。

本发明中，在上述反应后，优选还进行后处理。所述后处理优选包括：向体系中加水淬灭，分离有机相，用乙酸乙酯萃取水相，合并有机相，用饱和NaCl洗涤，无水Na

关于步骤c)：化合物b与三溴化磷反应，形成化合物c。

所述化合物b与三溴化磷的摩尔比优选为1∶(1～3)。

所述反应优选在溶剂中进行。所述溶剂优选为乙醚、甲苯和N,N-二甲基甲酰胺中的一种或几种。所述化合物b与溶剂的用量比优选为1mmol∶(1.5～3)mL。

所述反应的温度优选为20～120℃；反应的时间优选为4～12h。经反应后，生成化合物c。

本发明中，在上述反应后，优选还进行后处理。所述后处理优选包括：向体系中加入饱和碳酸氢钠淬灭，分离有机相，用乙酸乙酯萃取水相，合并有机相，用饱和NaCl洗涤，无水Na

关于步骤d)：化合物c与氮杂环化合物反应，形成化合物d。

所述氮杂环化合物选自以下化合物中的一种或几种：

所述化合物c与氮杂环化合物的摩尔比优选为1∶(1.5～3)。

所述反应在NaH的作用下进行，引入NaH能够拔去氮杂环N上的H原子，N带负电，溴相连的C相对带正电，这样促进二者反应。所述化合物c与NaH的摩尔比优选为1∶(2～4)。所述NaH的引入温度优选为-40～-20℃。

所述反应优选在溶剂介质中进行。所述溶剂优选为无水DMF、无水THF和无水N,N-二甲基乙酰胺中的一种或几种。

具体的，将氮杂环化合物溶解于溶剂中，再加入NaH混合均匀，然后滴加化合物c的溶液，控制反应温度进行反应。其中，氮杂环化合物与溶剂的用量比优选为1mmol∶(1.5～3)mL。所述化合物c的溶液为化合物c溶解于溶剂中的溶解液，二者用量比优选为1mmol∶(5～10)mL。其中，溶解氮杂环化合物的溶剂与溶解化合物c的溶剂优选相同；所述溶剂的种类与上述溶剂介质一致。所述反应温度优选为20～100℃，反应的时间优选为12～48h。经反应后，生成化合物d：

其中，R

本发明中，在上述反应后，优选还进行后处理。所述后处理优选包括：向体系中加水稀释，用乙醚萃取，合并有机相，用饱和NaCl洗涤，无水Na

关于步骤e)：化合物d脱除苄基后，与反式-薄荷基-2,8-二烯-1-醇反应，形成式Ⅰ化合物；或化合物d脱除苄基后，与反式-薄荷基-2,8-二烯-1-醇反应，再将所得反应物与R

所述化合物d脱除苄基的反应优选包括：将化合物d溶解于溶剂中，加入Pd/C催化剂，并通入氢气进行反应，形成脱苄基化合物e。

其中，所述溶剂优选为甲醇、乙酸乙酯和乙醇中的一种或几种。所述化合物d与溶剂用量比优选为1mmol∶(4～10)mL。所述Pd/C催化剂为钯炭催化剂，本发明对其来源没有特殊限制，为一般市售品即可；本发明中，所述Pd/C催化剂优选为10％Pd/C催化剂。本发明中，所述化合物d与Pd/C催化剂的摩尔比优选为1∶(0.5～1.5)。所述氢气的通入量优选为使体系气压达到0.1013～0.2026MPa。所述反应的温度优选为20～35℃，反应的时间优选为2～8h。经反应后，生成脱苄基产物e：

其中，R

本发明中，经上述脱除苄基的反应后，优选还进行后处理。所述后处理优选包括：将所得反应物过滤除去Pd/C催化剂，再旋干溶剂，然后，以二氯甲烷和甲醇为流动相，用硅胶柱进行梯度洗脱分离，得到化合物e。

按照本发明，在得到化合物e后，将其与反式-薄荷基-2,8-二烯-1-醇反应，形成式Ⅰ化合物(对应的R

所述反式-薄荷基-2,8-二烯-1-醇的结构如下：

所述化合物e与反式-薄荷基-2,8-二烯-1-醇的摩尔比优选为1∶(1.5～3)。

所述反应优选在HCOOH的作用下进行，加入HCOOH的作用是促进反式-薄荷基-2,8-二烯-1-醇形成碳正离子与苯环反应。所述HCOOH与化合物e的摩尔比优选为(1.5～3)∶1。

所述反应优选在溶剂介质中进行。所述溶剂优选为二氯甲烷和THF中的一种或几种。所述化合物e与溶剂的用量比优选为1mmol∶(5～20)mL。

所述反应的温度优选为室温，具体可为20～35℃；所述反应的时间优选为2～8h。经反应后，生成式Ⅰ化合物(对应的R

本发明中，在上述反应后，优选还进行后处理。所述后处理优选包括：向体系中加入饱和碳酸氢钠淬灭，分离有机相，用乙酸乙酯萃取水相，合并有机相，用饱和NaCl洗涤，无水Na

按照本发明，在得到R

所述R

所述反应优选在弱碱性条件下进行。提供弱碱性条件的碱性物质优选为碳酸钾、碳酸钠和氢氧化钠中的一种或几种。所述弱碱性物质与化合物f的摩尔比优选为(0.1～1)∶1。

所述反应优选在溶剂介质中进行。所述溶剂优选为丙酮、THF和乙腈中的一种或几种。所述化合物f与溶剂的用量比优选为1mmol∶(10～15)mL。

所述反应的温度优选为20～60℃，反应的时间优选为8～16h。经反应后，生成式Ⅰ化合物(R

本发明中，在上述反应后，优选还进行后处理。所述后处理优选包括：向体系中加水稀释，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和NaCl洗涤，无水Na

本发明提供的上述制备方法简单易行，条件温和，能够高效获得式Ⅰ化合物。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

实施例1合成CIAC001

合成路线如下：

合成过程如下：

S1、合成化合物1a：

3,5-二羟基苯乙酮(16mmol)和溴化苄(40mmol)溶解于丙酮(50mL)中，加入碳酸钾(32mmol)，于65℃回流反应过夜。反应完成后，加水稀释，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和NaCl洗涤，无水Na

S2、合成化合物1b：

将化合物1a(5mmol)溶解于110mL二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中(二氯甲烷∶甲醇体积比＝10∶1)中，-20℃加入硼氢化钠(6mmol)，搅拌10分钟后，转移至室温(25℃)反应2h。反应完成后加入水淬灭，分离有机相，乙酸乙酯萃取水相，合并有机相，饱和NaCl洗涤，无水Na

S3、合成化合物1c：

将化合物1b(4mmol)溶解于50mL乙醚中，加入三溴化磷(4.8mmol)，于50℃回流反应6h。反应完成后加入饱和碳酸氢钠淬灭，分离有机相，乙酸乙酯萃取水相，合并有机相，饱和NaCl洗涤，无水Na

S4、合成化合物1d：

将1,2,3-三氮唑(5mmol)溶解于无水DMF(50mL)中，-20℃加入NaH，搅拌10min，得到反应液；化合物1c(2.5mmol)溶解于无水DMF(5mL)中，将所得溶解液滴加入上述反应液中，转移至120℃反应24h。反应完成后，加入水稀释，乙醚萃取，合并有机相，饱和NaCl洗涤，无水Na

S5、合成化合物1e：

将化合物1d(2mmol)溶解于22mL混合溶剂中(甲醇∶乙酸乙酯体积比＝10∶1)中，加入Pd/C催化剂(10％w/vPd/C，200mg)，通入氢气反应，反应4h。反应完后，过滤除去Pd/C，旋干溶剂，用硅胶柱，以二氯甲烷和甲醇为流动相，梯度洗脱分离得到产物1e(产率80.4％)。

S6、合成化合物1f：

将化合物1e(1mmol)溶解于二氯甲烷(5mL)中，加入反式-薄荷基-2,8-二烯-1-醇(2mmol)、HCOOH(2mmol)，室温(25℃)反应12h。反应完成后加饱和碳酸氢钠淬灭反应，分离有机相，乙酸乙酯萃取水相，合并有机相，饱和NaCl洗涤，无水Na

所得产物1f的结构表征参见图1-3，图1为实施例1所得产物1f的核磁共振氢谱图，图2为实施例1所得产物1f的核磁共振碳谱图，图3为实施例1所得产物1f的质谱图。

实施例2合成CIAC002

合成路线如下：

合成过程如下：

S1、合成化合物2a：

3,5-二羟基苯甲醛(26mmol)和溴化苄(65mmol)溶解于丙酮(100mL)中，加入碳酸钾(52mmol)，于60℃回流反应过夜。反应完成后，加水稀释，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和NaCl洗涤，无水Na

S2、合成化合物2b：

将化合物2a(10mmol)溶解于100mL无水二氯甲烷中，-20℃加入正丁基(15mmol)，室温(25℃)反应2h。反应完成后加入水淬灭，分离有机相，乙酸乙酯萃取水相，合并有机相，饱和NaCl洗涤，无水Na

S3、合成化合物2c：

将化合物2b(8mmol)溶解于50mL乙醚中，加入三溴化磷(9.6mmol)，于50℃回流反应6h。反应完成后加入饱和碳酸氢钠淬灭，分离有机相，乙酸乙酯萃取水相，合并有机相，饱和NaCl洗涤，无水Na

S4、合成化合物2d：

将咪唑(10mmol)溶解于无水DMF(100mL)中，-20℃加入NaH，搅拌10min，得到反应液；化合物2c(5mmol)溶解于无水DMF(8mL)中，将所得溶解液滴加入上述反应液中，转移至120℃反应24h。反应完成后，加入水稀释，乙醚萃取，合并有机相，饱和NaCl洗涤，无水Na

S5、合成化合物2e：

将化合物2d(4mmol)溶解于50mL混合溶剂中(甲醇∶乙酸乙酯体积比＝10∶1)中，加入Pd/C催化剂(10％w/vPd/C，400mg)，通入氢气反应，反应4h。反应完后，过滤除去Pd/C，旋干溶剂，用硅胶柱，以二氯甲烷和甲醇为流动相，梯度洗脱分离得到产物2e(产率76.4％)。

S6、合成化合物2f：

将化合物2e(2mmol)溶解于二氯甲烷(10mL)中，加入反式-薄荷基-2,8-二烯-1-醇(4mmol)、HCOOH(4mmol)，室温(25℃)反应12h(产物产率为27.8％)。反应完成后加饱和碳酸氢钠淬灭反应，分离有机相，乙酸乙酯萃取水相，合并有机相，饱和NaCl洗涤，无水Na

实施例3合成化合物CIAC002

合成路线如下：

合成过程如下：

S1～S6：同实施例2。

S7、合成化合物2g：

将化合物2f(1mmol)溶解于丙酮(8mL)中，加入CH

实施例4

抗炎性和细胞毒性测试

S1、细胞计数，用DMEM培养基(10％血清，1％双抗)配置成5×10

S2、移去培养基，加入不含血清和双抗的DMEM培养基200μL，同时加入不同剂量的药物，孵育24h。

S3、NO浓度测试：取100μL培养基，加入10μL 2,3-二氨基萘溶液(浓度为0.5mg/mL)，孵育15min，然后加入5μL NaOH溶液(浓度为3M)终止反应。以360nm激发，检测430nm吸光值。测试结果参见图1。

S4、细胞毒性测试：除去剩余培养基，加入100μL多聚甲醛溶液(浓度为5％w/v)，孵育5min，除去多聚甲醛加入100μL结晶紫(浓度为0.5％w/v)孵育15min，除去结晶紫，蒸馏水清洗3次，加入150μL无水乙醇，孵育20min，测试540nm吸光度值。测试结果参见图4。

分别以CBD(大麻二酚)和实施例1合成的化合物CIAC001作为药物进行上述测试，结果参见图4。图4为CBD衍生物抑制脂多糖处理BV-2细胞产生NO及细胞毒性效果图，其中，A为CBD的抗炎性实验效果图，C为实施例1化合物CIAC001的抗炎性实验效果图，B为CBD的细胞毒性实验效果图，D为实施例1化合物CIAC001的细胞毒性实验效果图。

图4中，A、C曲线图测定的是一氧化氮(NO)含量，当脂多糖(LPS)处理细胞后，会引发炎症从而使NO释放量增加，此实验中以不加药LPS组的NO含量作为100％，测定加入不同剂量的药物后NO变化，并通过拟合计算出NO含量变为不加药LPS组的50％时所需要的药物浓度即IC50，因此，IC50值越低表明药物抗炎效果越好。

图4中，B、D曲线图测定的是药物的细胞毒性，此实验通过结晶紫染色测定活细胞的数量，将不加药物LPS处理组作为100％，测定加入不同浓度药物后活细胞的数量变化并通过拟合计算出活细胞变为不加药物LPS处理组50％时的药物浓度即Viability，因此Viability值越大毒性越小。

通过图4测试结果可以看出，与CBD相比，实施例1所得化合物CIAC001的IC50和Viability值均提升，证明，其提高了抗炎效果，降低了毒性。

实施例5

抗炎性测试

S1、细胞计数，用DMEM培养基(10％血清，1％双抗)配置成5×10

S2、移去培养基，加入不含血清和双抗的DMEM培养基2mL，同时加入不同剂量的药物，孵育6h。

S3、移除培养基，用1mL PBS缓冲液洗涤2次，加入1mL Trizol细胞裂解液，孵育5min。将裂解液转移至1mL无RNA离心管中，加入200μL氯仿，涡旋振荡1min，12000g，4℃离心10min。取400μL上清液加入400μL异丙醇，混匀后冰上静置10min，然后12000g，4℃离心7min。除去上清液，加入1mL混合溶液(乙醇：DEPC水溶液体积比＝3:1)，12000g，4℃离心5min。除去上清液，冰上静置3min，加入25μL DEPC水溶液，混合均匀，测定RNA浓度，逆转录成cDNA。

S4、测定cDNA浓度，配置成600ng/mL模板量，加入DNA合成酶和不同引物进行qPCR扩增，测定不同基因的含量。

测试效果参见图5-6，图5和图6的测试实验除使用引物不同外，步骤一致，均按照上述步骤进行。其中，CBD衍生物抑制炎症因子mRNA生成的效果参见图5，图5为CBD及实施例3所得化合物CIAC003抑制炎症因子mRNA生成的效果图。图5测定的是炎症因子的mRNA含量，选取的3个基因都是与炎症强弱呈正相关的炎症因子；当加入LPS后，Control组炎症因子明显提高，表明LPS处理后引发了炎症，当给予CBD时仅在10μM浓度下对IL-1β有抑制作用，而CIAC003在1μM浓度下对3种炎症因子都有明显下调，同时在10μM浓度下有剂量依赖效益，因此，CIAC003相较CBD能更好的降低炎症因子mRNA表达，抗炎效果更佳。

CBD衍生物抑制炎症因子的机理探索参见图6，图6为实施例3所得化合物CIAC003抑制炎症因子的机理研究效果图。从图6可以看出，小胶质细胞LPS处理后，会从静息态M0变为激活态M1，M1态细胞会释放大量促炎因子，导致炎症加深，而机体会令M1态细胞向M2态转化，M2态会释放抗炎因子，起到抑制炎症效果，从而保护自身。图中IL-1β,IL-6和iNOS都是M1态特异性炎症因子，当加入CIAC003后三者都明显下调，说明M1态细胞减少。另一方面，加入CIAC003后M2态特异性炎症因子IL-10会明显上调，表明M2态细胞增多。所以CIAC003是通过促进小胶质细胞从M1态向M2态转化而达到抗炎效果。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。