一种4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮的检测方法

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种采用气相-质谱方法检测样品中4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮杂质含量，更具体的是采用气相-串联质谱方法检测样品中4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮杂质含量。

背景技术

4-氯甲基-5-甲基-1,3-二氧杂环戊烯-2-酮（DMDO-Cl）是一种重要的化学中间体，其可用来合成奥美沙坦酯、阿齐沙坦、阿齐沙坦酯、阿齐沙坦酯钾、仑氨西林、普卢利沙星等，可改善药物的生物利用度和稳定性。文献（SHOJI IKEDA,YASUSHI TAKEBE,RYOICHIHIRAYAMA,FUMIO SAKAMOTO,KOJI IUCHI,GORO TSUKAMOTO. A Convenient and PracticalPreparation of 4-Chloromethyl-5-methyl-1, 3-dioxol-2-one[J]. Chemical andPharmaceutical Bulletin,1988,36(1).）报道了DMDO-Cl的制备方法，由4,5-二甲基-1,3-二氧杂环戊烯-2-酮（DMDO）经氯化试剂氯化得到4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮（式I），再经烯丙位重排作用得到DMDO-Cl，式I化合物（杂质A）可残留在DMDO-Cl中，进而传递到下一步反应的产物中，甚至残留在终产品中。

文献（刘勇军,熊学武,巢燕芳,杨铁金.气相色谱-质谱联用测定奥美沙坦酯中基因毒性杂质4-氯甲基-5-甲基-1,3-二氧杂环戊烯-2-酮[J].合成材料老化与应用,2017,46(03):91-95.）报道了采用GC-MS测定奥美沙坦酯中的DMDO-Cl，为了降低基质奥美沙坦酯对杂质DMDO-Cl的影响，需要对待测样品进行特殊处理，以便降低基质效应，提高回收率，获得良好的重现性。

未见有报道杂质A的检测方法，因此，开发针对杂质A的检测方法，对相关原料药工艺开发、质量控制具有重要的意义。

发明内容

本发明提供了一种4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮杂质含量的检测方法，本发明人经过对气象色谱条件的深入研究，获得了无需对待测样品进行特殊处理回收率即可符合标准的条件。所述的检测方法采用气相色谱-质谱法（GC-MS），该方法灵敏度高、准确性高、重复性好，可用于样品中杂质A的检测。

本发明提供的一种4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮杂质含量的检测方法，其特征在于采用GC-MS/MS进行检测，包括如下步骤：

溶液配制：分别配制对照品溶液、灵敏度溶液和供试品溶液；所述的对照品溶液和灵敏度溶液均为杂质A的溶液；

其中，所述的对照品溶液和灵敏度溶液均为采用杂质A溶解于稀释液配制而成；供试品溶液采用供试样品溶解于稀释液配制而成；

所述的供试样品为含有或可能含有杂质A；所述的供试样品化学结构式中含有式III片段，

进样：待GC-MS/MS仪器系统稳定后，进空白溶液1针（必要时进多针），灵敏度溶液1针，对照品溶液6针，供试品溶液1针，记录谱图;

其中，

所述的检测方法采用的色谱条件为：色谱柱为以（14%-氰丙基-苯基）-甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管柱，采用程序升温；

所述检查方法的质谱条件如表1所示：

所述对照品溶液中杂质A的浓度为150 ng/ml~350ng/ml，优选200ng/ml~250ng/ml；所述灵敏度溶液中杂质A的浓度为20ng/ml~60ng/ml，优选40ng/ml~50ng/ml；所述供试品溶液浓度为2 mg/ml~15mg/ml，优选5 mg/ml~8mg/ml。

所述的对照品溶液的配制方法为：精密量取对照品储备液2适量于量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀；

灵敏度溶液：精密量取对照品溶液适量置量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。

所述的对照品储备液2的配制方法为：精密量取对照品储备液1适量于量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀；

所述的对照品储备液1的配制方法为：取对照品适量，精密称定，置适量量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。

所述的供试品溶液：取供试品适量，精密称定，置量瓶中，加稀释液超声溶解并稀释至刻度。

所述的的空白溶液和稀释液均为卤代烷烃，所述的卤代烷烃优选三氯甲烷。

其中所采用的卤代烷烃为AR及以上，杂质A对照品外购得到，为AR级及以上。所述的（14%-氰丙基-苯基）-甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管柱为Agilent DB-1701, 30 m x0.25 mm, 1μm或效能相当的色谱柱。

所述的程序升温为柱温初始温度为150℃，保持1分钟；以每分钟35℃的速率升温至200℃，保持5min；以每分钟30℃的速率升温至250℃，保持3min；进样口温度：130℃；载气：He；分流模式：分流；载气流速：1mL/min；分流比：10：1；GC运行时间：12.095min；进样量：1µL。

更优选的，本发明所述的检测方法，包括以下步骤：

（1）溶液配制：

稀释液：三氯甲烷

空白溶液：稀释液

对照品储备液①：取对照品约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。（浓度：4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮1000µg/mL）

对照品储备液②：精密量取对照品储备液①1.0mL置100mL量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。（浓度：4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮10µg/mL）

对照品溶液：精密量取对照品储备液②450µL置20mL量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。

灵敏度溶液：精密量取对照品溶液2.0mL置10mL量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。

供试品溶液：取供试品约120mg，精密称定，置20mL量瓶中，加稀释液超声溶解并稀释至刻度。

所述的供试样品为4-氯甲基-5-甲基-1,3-二氧杂环戊烯-2-酮、奥美沙坦酯、阿齐沙坦、阿齐沙坦酯、阿齐沙坦酯钾、普卢利沙星、仑氨西林或仑氨西林药学上可接受的盐，其中所述的仑氨西林药学上可接受的盐优选仑氨西林盐酸盐；

所述的对照品为4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮；

（2）进样：待GC-MS/MS仪器系统稳定后，进空白溶液1针（必要时进多针），灵敏度溶液1针，对照品溶液6针，供试品溶液1针，记录谱图；

其中，

所述的检测方法采用的色谱条件为：色谱柱为Agilent DB-1701, 30 m x 0.25mm, 1μm，采用程序升温：初始温度为150℃，保持1分钟；以每分钟35℃的速率升温至200℃，保持5min；以每分钟30℃的速率升温至250℃，保持3min；进样口温度：130℃；载气：He；分流模式：分流；载气流速：1mL/min；分流比：10：1；GC运行时间：12.095min；进样量：1µL；

所述的检测方法的质谱条件为如表1所示。

其中灵敏度溶液中4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮的S/N应不小于3；

其中6针对照品溶液中4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮峰面积RSD应不大于10.0%。

所述的的空白溶液和稀释液均为三氯甲烷，为AR及以上级别，，杂质A对照品外购得到，为AR级及以上。

所采用的仪器为气相色谱仪、自动进样器、Agilent GC\MS QQQ 7000D配备EI离子源、电子分析天平。

以对照品溶液为限度控制溶液，供试品溶液中4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮的峰面积与6针对照品溶液中4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮的平均峰面积比较：

当供试品溶液中的4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮峰面积不小于6针对照品溶液中4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮的平均峰面积时，报告该样品中4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮的测定值不小于37.5ppm；

当供试品溶液中的4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮峰面积小于6针对照品溶液中4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮的平均峰面积且不小于灵敏度溶液中4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮的峰面积时，报告该样品中4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮的测定值小于37.5ppm；

当供试品溶液中的4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮峰面积未检出或小于灵敏度溶液中4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮的峰面积时，报告该样品中4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮的测定值小于LOD。

4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环 -2-酮的限度≤37.5ppm，LOD 7.1ppm。

所述的检测方法采用奥美沙坦酯为供试品进行方法学验证，验证结果表明，符合相关要求，其测试结果如下：

本发明所述的GC-MS为气相色谱-质谱，GC-MS/MS为气相色谱-串联质谱。

本发明所提供的用于检测供试品中杂质A含量的方法，具有灵敏度高，定量限低，根据相关指导原则，按照从严控制杂质含量，杂质A奥美沙坦酯中的限度为37.5ppm，所述的检测方法采用奥美沙坦酯为供试品进行经系统适用性、专属性、检测限、耐用性等项目验证，均符合相关要求，本发明所提供的方法可用于杂质A在奥美沙坦酯中含量的检测,所述的方法也可用于4-氯甲基-5-甲基-1,3-二氧杂环戊烯-2-酮、阿齐沙坦、阿齐沙坦酯、阿齐沙坦酯钾、普卢利沙星、仑氨西林或仑氨西林药学上可接受的盐中杂质A含量的检测。

附图说明

图1 实施例2中灵敏度溶液谱图

图2 实施例2对照品溶液谱图

图3实施例3中奥美沙坦酯定位溶液谱图

图4实施例3中对照品溶液谱图

图5实施例3中选择性溶液谱图

图6实施例4中仪器LOD溶液谱图

图7实施例4中方法LOD溶液谱图

图8 实施例5中供试品溶液3hr谱图

图9 实施例5中对照品溶液4hr谱图

图10 实施例5中选择性溶液3hr谱图

具体实施方式

下面通过具体实施例来进一步说明本发明。应当理解为：本发明的实施例仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制。在本发明技术方案的基础上对本发明的简单改进或者采用惯用手段或成分进行等同替换所得得到的技术方案均属于本发明的保护范围。

本发明实施例所采用的仪器、色谱柱、试剂、对照品、供试品等信息如表3、表4、表5所示。

实施例1 检测方法

仪器条件及试剂

仪器：气相色谱仪、自动进样器、Agilent GC\MS QQQ 7000D配备EI离子源、电子分析天平

色谱柱：以（14%-氰丙基-苯基）-甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管柱（如：AgilentDB-1701, 30 m x 0.25 mm, 1μm或效能相当的色谱柱）

柱温：初始温度为150℃，保持1分钟；以每分钟35℃的速率升温至200℃，保持5min；以每分钟30℃的速率升温至250℃，保持3min。

进样口温度：130℃ 载气：He

分流模式：分流 载气流速：1mL/min

分流比：10：1 GC运行时间：12.095min

进样量：1µL

质谱条件：

试剂及对照品

三氯甲烷：AR及以上

4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮：外购

（1）溶液配制：

稀释液：三氯甲烷

空白溶液：稀释液

对照品储备液①：取对照品约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。

对照品储备液②：精密量取对照品储备液①1.0mL置100mL量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。

对照品溶液：精密量取对照品储备液②450µL置20mL量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。

灵敏度溶液：精密量取对照品溶液2.0mL置10mL量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。

供试品溶液：取供试品约120mg，精密称定，置20mL量瓶中，加稀释液超声溶解并稀释至刻度。

所述的供试样品为4-氯甲基-5-甲基-1,3-二氧杂环戊烯-2-酮、奥美沙坦酯、阿齐沙坦、阿齐沙坦酯、阿齐沙坦酯钾、普卢利沙星、仑氨西林或仑氨西林药学上可接受的盐，其中所述的仑氨西林药学上可接受的盐优选仑氨西林盐酸盐；

所述的对照品为4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮；

（2）进样：待GC-MS/MS仪器系统稳定后，进空白溶液1针（必要时进多针），灵敏度溶液1针，对照品溶液6针，供试品溶液1针，记录谱图；

其中灵敏度溶液中4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮的S/N应不小于3；

其中6针对照品溶液中4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮峰面积RSD应不大于10.0%。

以对照品溶液为限度控制溶液，供试品溶液中4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮的峰面积与6针对照品溶液中4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮的平均峰面积比较：

当供试品溶液中的4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮峰面积不小于6针对照品溶液中4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮的平均峰面积时，报告该样品中4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮的测定值不小于37.5ppm；

当供试品溶液中的4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮峰面积小于6针对照品溶液中4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮的平均峰面积且不小于灵敏度溶液中4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮的峰面积时，报告该样品中4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮的测定值小于37.5ppm；

当供试品溶液中的4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮峰面积未检出或小于灵敏度溶液中4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮的峰面积时，报告该样品中4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮的测定值小于LOD。

4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环 -2-酮的限度≤37.5ppm，LOD 7.1ppm。

实施例2 系统适用性

系统适用性是通过灵敏度溶液中4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮的S/N和6针对照品溶液中4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮峰面积的RSD而实现的，要求灵敏度溶液中4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮的S/N应不小于3，6针对照品溶液中4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮峰面积RSD应不大于10.0%，为确认序列运行过程中的系统适用性，在验证过程中每隔约8小时或序列的最后，进一针新配制的对照品溶液，要求后连续6针对照品溶液中4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮单位浓度峰面积RSD应不大于10.0%；如超出该范围，应作评估调查。

溶液配制，按照实施例1条件进样，测试结果见表6~8。

实施例3 专属性

专属性是通过测定空白溶液对4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮检测有无干扰，选择性溶液中4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮与相邻峰的分离度而实现的；要求空白溶液对检测无干扰，选择性溶液中4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮与相邻杂质峰间的分离度应不小于1.5，选择性溶液中4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮的回收率应在80.0%~120.0%之间。

溶液配制，按照实施例1条件进样，测试结果见表9、表10。

其中，供试品带入峰面积=供试品溶液峰面积÷供试品溶液取样量×选择性溶液取样量；对照品溶液平均峰面积引用实施例2中6针对照品溶液平均峰面积；测得浓度=（选择性溶液峰面积-供试品带入峰面积）/对照品溶液平均峰面积×对照品溶液浓度；回收率（%）=测得浓度/理论浓度×100%。

实施例4 检测限

检测限是通过检测其响应信号与噪声之比不小于3：1而得到的。要求所得的色谱图中，LOD应不大于11.25ppm，LOD溶液中4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮的信噪比应不小于3。

溶液配制，按照实施例1条件进样，测试结果见表11。

实施例5 耐用性（溶液稳定性）

考察对照品溶液、供试品溶液和选择性溶液在室温下避光放置一段时间后进样，检测结果随时间变化的规律，为检测时对照品溶液和供试品溶液的放置时间提供参考依据。要求：

对照品溶液在室温下避光放置一段时间内，回收率应在80.0%~120.0%之间，则在考察期间稳定；

若供试品溶液0h有检出4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮，供试品溶液在室温下避光放置一段时间内，测定结果变化值在4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮限度的20%以内，则供试品溶液在室温考察期间稳定；若供试品溶液0h未检出4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮，供试品溶液在室温下避光放置一段时间内，仍无4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮检出，则供试品溶液在室温考察期间稳定；

选择性溶液在室温下避光放置一段时间内，4-氯-4-甲基-5-亚甲基-1,3-二氧戊环-2-酮回收率应在80.0%~120.0%之间，则选择性溶液在考察期间稳定。

溶液配制，按照实施例1条件进样，测试结果见表12-14。