一种乙肝用药检测固相PCR试剂盒

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，特别是涉及一种乙肝用药检测固相PCR试剂盒。

背景技术

聚乙二醇干扰素α-2b注射剂又名佩乐能，处方药，由爱尔兰先灵葆雅公司，经美国先灵葆雅公司授权生产，在全球长效干扰素中处方量排名第一。聚乙二醇干扰素α-2b注射剂是2000年及2001年第一个通过欧盟和美国FDA批准的长效干扰素。2004年5月在中国获得批准用于治疗慢性丙型肝炎,2007年3月在中国获批慢性乙型肝适应症。佩乐能是最优化设计的聚乙二醇干扰素，在延长半衰期的同时，最大程度地保留了抗病毒活性。佩乐能是唯一按体重给药的长效干扰素，使不同体重的病人不良反应发生率相同，避免了单一固定剂量给药时，体重小的病人骨髓抑制发生率高的缺点。2009年美国肝病研究协会(AASLD)慢性乙肝指南，2012年亚太肝病研究协会(APASL)慢性乙肝指南，2012年欧洲肝病研究协会(EASL)慢性乙肝指南，2010年中国慢性乙肝防治指南推荐聚乙二醇干扰素α-2b作为HBeAg阳性慢性乙肝患者初始治疗的一线用药之一。

利巴韦林又名病毒唑、三氮唑核苷、尼斯可等，是广谱强效的抗病毒药物，目前广泛应用于病毒性疾病的防治。常用剂型有注射剂、片剂、口服液、气雾剂等。利巴韦林副作用少，不良反应发生率低，根据其药理作用，应用时要注意大剂量长期使用本药可引起白细胞减少、贫血、血清转氨酶和胆红素升高。应避免盲目、超量用药。大剂量使用本药所引起的胆红素增高和血红蛋白下降，可对临床检验和诊断造成干扰。

亚太肝病研究协会(APASL)慢性丙肝指南，欧洲肝病研究协会(EASL)慢性丙肝指南，美国肝病研究协会(AASLD)慢性丙肝指南推荐聚乙二醇干扰素α-2b联合口服利巴韦林是慢性丙肝的一线治疗选择。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种方便快捷、通量高的2种乙肝用药基因检测试剂盒，利用其可检出03IL-28B*1rs12979860，04IL-28B*2rs8099917，05IL-28B*3rs12980275，116ITPA rs1127354基因。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种乙肝用药检测固相PCR试剂盒，所述的固相PCR试剂盒包括由PCR反应缓冲液、引物组、热启动DNA聚合酶构成；

所述引物组由以下4对引物组成：

03IL-28B*1rs12979860、04IL-28B*2rs8099917、05IL-28B*3rs12980275、116ITPArs1127354；

检测所述03IL-28B*1rs12979860引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQID NO.1、SEQID NO.2所示；

检测所述04IL-28B*2rs8099917引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ IDNO.3、SEQID NO.4所示；

检测所述05IL-28B*3rs12980275引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQID NO.5、SEQID NO.6所示；

检测所述116ITPA rs1127354引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ IDNO.7、SEQID NO.8所示。

一种固相PCR试剂盒的扩增方法，所述的固相PCR试剂盒是固定在96孔PCR反应板或12联排PCR反应孔中的。

优选的，所述的引物组及热启动DNA聚合酶、PCR反应缓冲液固定在96孔PCR反应板或12联排PCR反应孔中的，加样时只需要添加核酸模板即可上级扩增。

优选的，所述的固相PCR试剂盒中的引物浓度为100nM-1uM。

一种基于固相PCR试剂盒检测2种乙肝用药检测方法，包括如下步骤：步骤一：2种乙肝用药检测固相PCR扩增试剂盒的生产；步骤二：口腔拭子核酸的提取；步骤三：固相PCR扩增反应；步骤四：PCR产物电泳分析后测序。

优选的，所述的引物浓度为100nM-1000nM，优选500nM-800nM。

优选的，所述的固相PCR试剂盒是在含有PCR反应混合液的表面封闭一层石蜡混合物，石蜡混合物的熔点在30—38℃之间，用于隔离PCR反应液中的酶和其他成分，熔点适中，且不影响PCR反应灵敏度。该石蜡混合物由液体石蜡和熔化后的固体石蜡混合而成，固体石蜡选择自熔点高于50℃的固体石蜡，固体石蜡和液体石蜡的比值为1:4—1:12，优选1:7—1:9。

采集样本并提取核酸

采用口腔拭子DNA提取试剂盒按照说明书提取核酸，浓度不低于10ng/ul，纯度1.6-1.8之间。

以核酸样本为模板进行固相PCR扩增反应

25ul PCR反应体系为：固相PCR反应MIX，核酸模板2ul。

所述的PCR反应MIX为含有Buffer、Mg+、dNTPs、酶及表1中引物组。

与现有技术相比，本发明实现的有益效果：本发明，操作简便，仅需在固相PCR板中加入核酸模板即可直接上机扩增，且操作简单，临床检测特异性好，灵敏度与定量PCR相当，具有较强的临床应用推广价值；

本发明，灵敏度高、特异性强，固相PCR试剂盒采用热启动DNA聚合酶，避免非特异性扩增，提高检测灵敏度和特异性；

本发明，检测位点全，适宜于乙肝用药指导，固相PCR试剂盒可一次性检测与乙肝用药检测相关的4种靶点检测；

综上所述，本发明提供一种乙肝用药检测固相PCR试剂盒。本发明采用特异性的引物序列，保证检测结果的可靠性；该检测方法操作简单，省时省力；检测通量大，试剂耗材成本低；可直接对提取的核酸检测；对检测平台和检测人员的要求低，能够在临床一线广泛推广。

附图说明

以下结合附图和具体实施方式来进一步详细说明本发明：

图1为试剂盒检测患者1电泳图；

图2为试剂盒检测患者1测序结果。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

请参阅图1至图2。

实施例1：

一种乙肝用药检测固相PCR试剂盒，所述的固相PCR试剂盒包括由PCR反应缓冲液、引物组、热启动DNA聚合酶构成；

所述引物组由以下4对引物组成：

03IL-28B*1rs12979860、04IL-28B*2rs8099917、05IL-28B*3rs12980275、116ITPArs1127354；

检测所述03IL-28B*1rs12979860引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQID NO.1、SEQID NO.2所示；

检测所述04IL-28B*2rs8099917引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ IDNO.3、SEQID NO.4所示；

检测所述05IL-28B*3rs12980275引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQID NO.5、SEQID NO.6所示；

检测所述116ITPA rs1127354引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ IDNO.7、SEQID NO.8所示。

一种固相PCR试剂盒的扩增方法，所述的固相PCR试剂盒是固定在96孔PCR反应板或12联排PCR反应孔中的。

所述的引物组及热启动DNA聚合酶、PCR反应缓冲液固定在96孔PCR反应板或12联排PCR反应孔中的，加样时只需要添加核酸模板即可上级扩增。

所述的固相PCR试剂盒中的引物浓度为100nM-1uM。

表1本试剂盒检测靶标及引物序列：

实施例2：

4种乙肝固相PCR检测试剂盒的组成：

该试剂盒由PCR反应液混合液及12联排管或96孔PCR反应板构成，其中PCR反应混合液为5×PCRBuffer(Tris-HCl pH8.5100mM、KCl 500nM、MgCl215nM)、dNTPs(10mM each)、Mg2+、4对引物及热启动DNA聚合酶构成。

该试剂盒是在上述PCR反应混合液的表面封闭一层石蜡混合物，石蜡混合物由固体石蜡和液体石蜡按照1:8(W/V)混合而成。

该试剂盒的反应体系(25ul)为：PCR反应液23ul，模板2ul。

实施例3：

试剂盒的操作和结果判定

1、基因组DNA的提取

采用口腔拭子提取人口腔内表面脱落细胞，用口腔拭子基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技，货号：DP322)按照试剂盒说明书提取DNA。

2、反应体系的配制

取乙肝固相PCR反应试剂盒12联排管或者96孔PCR反应板，加入2ul提取的DNA。

3、PCR扩增

将PCR管放入普通PCR仪中按照说明书建议才做程序进行PCR扩增。

4、1.0％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物

5、结果判读

本试剂盒结果判读标准如下表2：

实施例4：

测序结果解读及用药指导

以1例健康人口腔拭子提取的DNA为模板，用上述试剂盒扩增后，得到如下测序结果，根据测序结果给出相应用药指导如下：

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。