干细胞分泌物及其制备方法、生物活性骨水泥及制备方法和应用
文献发布时间：2023-06-19 12:00:51
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其是涉及一种干细胞分泌物的制备方法、生物活性骨水泥及制备方法和应用。
背景技术
材料科技、生物科技和能源科技并称为“属于21 世纪的朝阳产业”，而生物医学材料更是位于材料领域和生物领域两大焦点的结合部。当代生物医学材料产业发展迅猛，根据全球知名的调查公司盖勒普的数据，2010 年全球医疗器械市场已达 2250 亿美元，其中生物医学材料及制品约占40%～50%，矫形外科修复材料和制品的世界市场年增长率26%，预计工程化材料上市后，将可开拓 800 亿美元的新市场。生物材料前沿研究正不断取得进展，这代表着更为广阔的市场空间，预计在今后10～15 年间，生物医学材料产业将达到相当于药物市场份额的规模。
骨缺损和骨损伤是骨科最常见疾病，对骨修复材料需求巨大，在骨缺损区域植入骨修复材料，有利于形成骨整合界面，提高骨密度，促进骨修复。其中，可注射骨水泥由于使用方便，具有重要的临床价值。在可注射骨水泥领域，α-半水硫酸钙是一种应用较为广泛的材料，但在由于其不具有生物活性，无法促进骨骼生长，难以满足临床骨修复需求。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种用于制备生物骨水泥的干细胞分泌物的制备方法，以通过干细胞分泌物在骨水泥中持续稳定释放，诱导内源干细胞在创伤区域富集，提高骨损伤修复效果。
本发明提供的干细胞分泌物的制备方法，包括以下步骤：
先将碘海醇与脐带干细胞共培养，再加入药物同时施加X射线辐照培养，然后弃去培养液并清洗后加入无血清培养基继续培养，最后收集细胞培养液，富集后得到干细胞分泌物。
进一步的，X射线的强度为0.5-4 Gy，优选为0.5-2 Gy。
进一步的，所述药物包括白藜芦醇、地塞米松、TN14003冻干粉、T140冻干粉或AMD3100冻干粉中的至少一种；
优选地，所述药物选自20-60 μM白藜芦醇、0.2-0.5 μM地塞米松，0.2-2 μMTN14003冻干粉，0.2-2 μM T140冻干粉或0.2-1 μM AMD3100冻干粉中的至少一种。
进一步的，碘海醇的质量浓度为2-100 μg/mL，优选为10-20 μg/mL；
优选地，碘海醇与脐带干细胞共培养1-2天后再加入药物；
优选地，X射线辐照后培养的时间为1-4天；
优选地，加入无血清培养基后培养的时间为1-4天。
本发明的目的之二在于提供上述干细胞分泌物制备方法制备得到的干细胞分泌物。
本发明的目的之三在于提供一种生物活性硫酸钙骨水泥，以改善现有硫酸钙骨水泥不具有生物活性，无法促进骨骼生长，难以满足临床骨修复需求的技术问题。
本发明提供的生物活性硫酸钙骨水泥，包括固相粉末和固化液，所述固相粉末包括微球和α-半水硫酸钙，所述微球中包含有生物活性物质，所述生物活性物质为干细胞分泌物或趋化因子SDF-1。
进一步的，所述微球和α-半水硫酸钙的质量比为0.03-0.8:1。
进一步的，所述微球的制备方法包括以下步骤：
（a）甲基化聚乙二醇-聚乙丙交酯溶于氯仿，得到油相；
（b）生物活性物质溶于PBS溶液，得到内水相；
（c）聚丙烯酸和/或聚乙烯醇溶于水，得到外水相；
（d）通过复乳法将油相、内水相和外水相制备成微球。
优选地，甲基化聚乙二醇-聚乙丙交酯与生物活性物质的质量比为3-10:1；
优选地，所述内水相中，生物活性物质的质量占比为0.5-2%。
进一步的，所述固化液为透明质酸的水溶液；
优选地，所述固化液中，透明质酸的质量占比为0.2-3%；
优选地，所述α-半水硫酸钙与固化液的质量比为1:0.5-0.6。
本发明的目的之二在于提供上述生物活性硫酸钙骨水泥的制备方法，包括以下步骤：
将α-半水硫酸钙与微球冻干粉混合均匀，加入固化液形成可注射骨水泥浆料，可注射骨水泥浆料固化，得到骨水泥。
优选地，所述可注射骨水泥浆料体外固化时间为8-16 min，可注射时间为2-8min。
本发明的目的之四在于提供上述生物活性硫酸钙骨水泥在制备牙种植区域骨填料、骨折内固定材料或骨缺损修复材料中的应用。
本发明提供的干细胞分泌物的制备方法通过在制备过程中加以药物和X射线联合使用诱导，使得干细胞分泌物中SDF-1趋化因子能够高水平表达，能够更好的诱导内源干细胞在创伤区域富集，提高骨损伤修复效果。
本发明提供的生物活性硫酸钙骨水泥，将干细胞分泌物或趋化因子SDF-1包载在微球中，提高生物活性物质在骨水泥固化过程中的稳定性，并在骨水泥注入患者体内后，能够通过逐渐降解释放生物活性物质，诱导内源干细胞在创伤区域富集，提高骨损伤修复效果。另外，微球在体内的降解速度慢，而α-半水硫酸钙在体内降解速度较快，使得骨水泥能够更好的适配骨骼生长。
本发明提供的生物活性骨水泥的制备方法工艺简单，易于操作，便于临床应用。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种干细胞分泌物的制备方法，包括以下步骤：
先将碘海醇与脐带干细胞共培养，再加入药物同时施加X射线辐照培养，然后弃去培养液并清洗后加入无血清培养基继续培养，最后收集细胞培养液，富集后得到干细胞分泌物。
本发明提供的干细胞分泌物的制备方法通过在制备过程中加以药物和X射线联合使用诱导，使得干细胞分泌物中SDF-1趋化因子能够高水平表达，能够更好的诱导内源干细胞在创伤区域富集，提高骨损伤修复效果。
在本发明的一种优选方案中，当碘海醇的质量浓度为2-100 μg/mL时，易于与脐带干细胞进行共培养，尤其是当碘海醇的质量浓度为10-20 μg/mL时，更易于与脐带干细胞进行共培养。
典型但非限制性的，用于与脐带干细胞进行共培养的碘海醇的质量浓度如为2、5、8、10、20、50、80或100 μg/mL。
在本发明的一种优选方案中，药物诱导同时施加的X射线辐照强度为0.5-4 Gy时，得到的干细胞分泌物中SDF-1趋化因子的表达水平较高，尤其是当X射线辐照强度为0.5-2Gy时，得到的干细胞分泌物SDF-1趋化因子的表达水平更高。
典型但非限制性的，药物诱导同时施加的X射线的辐照强度如为0.5 Gy、0.8 Gy、1Gy、1.2 Gy、1.5 Gy、1.8 Gy、2 Gy、2.5 Gy、3 Gy、3.5 Gy或4 Gy。
在本发明的一种优选方案中，药物包括但不限于白藜芦醇、地塞米松、TN14003冻干粉、T140冻干粉或AMD3100冻干粉中的至少一种。
在本发明的进一步优选方案中，药物选自20-60 μM白藜芦醇、0.2-0.5 μM地塞米松，0.2-2 μM TN14003（Arg-Arg-Natl-Cys-Tyr-Cit-Lys -d-Lys-Pro-Tyr-Arg-Cit-Cys-Arg-NH
在本发明的一种优选方案中，在制备干细胞分泌物时，碘海醇与脐带干细胞共培养1-2天后再加入药物以及同时施加X射线辐照，以更利于脐带干细胞分泌干细胞分泌物，提高SDF-1趋化因子的表达水平。
在本发明的一种优选方案中，X射线辐照后培养的时间为1-4天，以使得药物联合X射线更利于诱导脐带干细胞分泌SDF-1等趋化因子的水平。
在本发明的一种优选方案中，加入无血清培养基后培养的时间为1-4天，以利于脐带干细胞分泌SDF-1等趋化因子的表达水平更高。
在本发明一种典型但非限制性的实施方案中，干细胞分泌物按照如下步骤制备而成：
(1)获取脐带干细胞：将脐带从无菌容器中取出放置于一次性平皿中，使用手术剪将脐带剪成约2 cm/段；用含肝素钠的生理盐水洗净血液，纵向剪破脐带，去除3条血管及外皮，洗净内部的血液；将脐带组织切成2.0-4.0 mm
(2)脐带干细胞培养传代：取生长状况良好的人体胚胎间充质干细胞，用含青霉素和链霉素双抗的DMEM/F12 +10%的胎牛血清培养基培养脐带干细胞，细胞铺板后放置在细胞孵育箱中37℃、5% CO
(3)药物诱导和辐照：干细胞传代至P5-P10，将2-100 μg/mL碘海醇与脐带干细胞共培养1-2天，加入药物并施加0.5-4 Gy的X射线辐照，继而培养1天后，弃去培养液并用PBS缓冲液清洗2次；加入无血清培养基继续培养1-4天。
(4)离心富集：收集细胞培养液，高速离心（20,000-50,000 rpm），富集干细胞分泌物并在4℃下保存备用。
当生物活性物质为干细胞分泌物时，生物活性物质的质量指的是干细胞分泌物的干重。
干细胞分泌物干重的测试方法为：将富集得到的干细胞分泌物用纯水洗涤3次后，-30℃预冻，-80～-60℃冷冻干燥后称重。
在本发明的一种优选方案中，微球的制备方法包括以下步骤：
（a）甲基化聚乙二醇-聚乙丙交酯溶于氯仿，得到油相；
（b）生物活性物质溶于PBS溶液，得到内水相；
（c）聚丙烯酸和/或聚乙烯醇溶于水，得到外水相；
（d）通过复乳法将油相、内水相和外水相制备成微球。
作为优选，甲基化聚乙二醇-聚乙丙交酯的数均分子量为100k，其中甲基化聚乙二醇的数均分子量为5k。
作为优选，甲基化聚乙二醇-聚乙丙交酯与生物活性物质的质量比为3-10:1，以利于制备得到的微球具有更为适宜的降解速度，从而使得生物活性物质的释放速度与骨骼的生长速率相匹配，其中生物活性物质为干细胞分泌物或趋化因子SDF-1。
典型但非限制性的，甲基化聚乙二醇-聚乙丙交酯与生物活性物质的质量比如为3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1或10:1。
根据本发明的第二个方面，本发明提供了根据上述干细胞分泌物的制备方法制备得到的干细胞分泌物，该干细胞分泌物中SDF-1趋化因子处于高表达水平，能够更好的诱导内源干细胞在创伤区域富集，提高骨损伤修复效果。
根据本发明的第三个方面，本发明提供了一种生物活性硫酸钙骨水泥，包括固相粉末和固化液，固相粉末包括微球和α-半水硫酸钙，所述微球中包含有生物活性物质，所述生物活性物质为干细胞分泌物或趋化因子SDF-1。
在本发明中，微球由壁材和芯材组成，壁材由生物高分子材料制成，芯材为生物活性物质。
本发明提供的生物活性硫酸钙骨水泥，将干细胞分泌物或趋化因子SDF-1包载在微球中，提高生物活性物质在骨水泥固化过程中的稳定性，并在骨水泥注入体内后，能够通过微球逐渐降解释放生物活性物质，诱导内源干细胞在创伤区域富集，提高骨损伤修复效果。另外，微球在体内的降解速度慢，而α-半水硫酸钙在体内降解速度较快，使得骨水泥能够更好的适配骨骼生长。
在本发明的一种优选方案中，固相粉末中，微球和α-半水硫酸钙的质量比为0.03-0.8:1，以保证微球与α-半水硫酸钙两者的释放速率相互配合，更好的诱导内源干细胞在创造区域富集，更好的适配骨骼生长。
典型但非限制性的，微球和α-半水硫酸钙的质量比如为0.03:1、0.05:1、0.08:1、0.1:1、0.2:1、0.5:1或0.8:1.
典型但非限制性的，α-半水硫酸钙与固化液的质量比如为1:0.5、1:0.52、1:0.55、1:0.58或1:0.6。
在本发明的一种优选方案中，内水相中，生物活性物质的质量占比为0.5-2%，以使得微球降解过程中，释放出来的生物活性物质诱导内源干细胞在创伤区域富集的速度与骨骼的生长速度相适配，更利于促进骨骼的生长。
典型但非限制性的，内水相中，生物活性物质的质量占比如为0.5%、0.8%、1%、1.2%、1.5%、1.8%或2%。
在本发明的一种优选方案中，生物活性硫酸钙骨水泥中，固化液为透明质酸的水溶液，以利于调控骨水泥浆料的固化时间，提高骨水泥浆料的可注射性。
作为优选，固化液中，透明质酸的质量占比为0.2-3%，以利于调控骨水泥浆料的固化时间，更利于进行注射操作。
典型但非限制性的，固化液中，透明质酸的质量占比如为0.2%、0.5%、0.8%、1%、1.5%、2%、2.5%或3%。
硫酸钙材料本身具有良好的组织相容性，对骨骼的生长具有很好的促进作用。在固相粉末中加入固化液（透明质酸的水溶液）后得到的骨水泥浆料，骨水泥浆料固化时间明显延长，当固化液与α-半水硫酸钙的质量比为0.5-0.6:1时，固化时间能够延长至8-16min，可注射时间延长至2-8 min。
根据本发明的第三个方面，本发明提供了一种生物活性硫酸钙骨水泥的制备方法，包括如下步骤：
将α-半水硫酸钙与微球冻干粉混合均匀，加入固化液形成可注射骨水泥浆料，可注射骨水泥浆料固化，得到骨水泥。
本发明提供的生物活性骨水泥的制备方法工艺简单，易于操作，便于临床应用。
在本发明的一种优选方案中，采用透明质酸的水溶液作为固化液制备得到的生物活性硫酸钙骨水泥的浆料的体外固化时间为8-16 min，可注射时间为2-8 min，更易于医护人员进行注射操作。
典型但非限制性的，生物活性硫酸钙骨水泥浆料的体外固化时间如为8、10、12、14、15或16 min，可注射时间如为2、3、4、5、6、7或8 min。
根据本发明的第四个方面，本发明提供了上述生物活性硫酸钙骨水泥在制备骨修复材料中的应用。
作为优选，骨修复材料包括但不限于牙种植区域骨填料、骨折内固定材料或骨缺损修复材料。
为了利于本领域技术人员理解本方案，下面结合实施例和对比例对本发明提供的技术方案进行描述。
一、干细胞分泌物
（一）X射线强度对干细胞分泌物中SDF-1表达水平的影响
实施例1
本实施例提供了一种干细胞分泌物，按照以下步骤富集得到：
（1）获取脐带干细胞：将脐带从无菌容器中取出放置于一次性平皿中，使用手术剪将脐带剪成约2 cm/段；用含肝素钠的生理盐水洗净血液，纵向剪破脐带，去除3条血管及外皮，洗净内部的血液；将脐带组织切成2.0-4.0 mm
（2）脐带干细胞培养传代：取生长状况良好的人体胚胎间充质干细胞，用含青霉素和链霉素双抗的DMEM/F12 +10%的胎牛血清培养基培养脐带干细胞，细胞铺板后放置在细胞孵育箱中37℃、5% CO
（3）药物诱导和辐照：干细胞传代至P8，将10 μg/mL碘海醇与脐带干细胞共培养1天，加入0.5 μM地塞米松并施加0.5 Gy的X射线辐照，照射剂量率为143.25 cGy/min，继而培养2天后，弃去培养液并用PBS缓冲液清洗2次；加入无血清培养基继续培养2天。
（4）离心富集：收集细胞培养液，经30,000 rpm离心，富集干细胞分泌物并在4°C下保存备用。
实施例2
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例1的不同之处在于，步骤（3）中，施加2 Gy的X射线照射，其余步骤及工艺参数均与实施例1相同，在此不再赘述。
实施例3
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例1的不同之处在于，步骤（3）中，施加4 Gy的X射线照射，其余步骤及工艺参数均与实施例1相同，在此不再赘述。
实施例4
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例1的不同之处在于，步骤（3）中，采用50 μg/mL碘海醇与脐带干细胞共培养，其余步骤及工艺参数均与实施例1相同，在此不再赘述。
实施例5
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例4的不同之处在于，步骤（3）中，施加2 Gy的X射线照射，其余步骤及工艺参数均与实施例1相同，在此不再赘述。
实施例6
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例4的不同之处在于，步骤（3）中，施加4 Gy的X射线照射，其余步骤及工艺参数均与实施例1相同，在此不再赘述。
实施例7
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例1的不同之处在于，步骤（3）中，采用100 μg/mL碘海醇与脐带干细胞共培养，其余步骤及工艺参数均与实施例1相同，在此不再赘述。
实施例8
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例7的不同之处在于，步骤（3）中，施加2 Gy的X射线照射，其余步骤及工艺参数均与实施例1相同，在此不再赘述。
实施例9
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例7的不同之处在于，步骤（3）中，施加4 Gy的X射线照射，其余步骤及工艺参数均与实施例1相同，在此不再赘述。
对比例1
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例1的不同之处在于，步骤（3）中未施加X射线辐照。
对比例2
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例4的不同之处在于，步骤（3）中未施加X射线辐照。
对比例3
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例7的不同之处在于，步骤（3）中未施加X射线辐照。
试验例1
分别测定实施例1-9及对比例1-3提供的干细胞分泌物中SDF-1的含量，结果如下表1所示，其中，SDF-1含量按照Western blot法检测。
表1
（二）药物及添加剂量对干细胞分泌物SDF-1表达水平的影响
实施例10
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例4的不同之处在于，步骤（3）中，加入0.2 μM的地塞米松且未施加X射线辐照，其余步骤及工艺参数均与实施例1相同，在此不再赘述。
实施例11
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例10的不同之处在于，步骤（3）中，加入0.35 μM的地塞米松，其余步骤及工艺参数均与实施例10相同，在此不再赘述。
实施例12
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例10的不同之处在于，步骤（3）中，加入0.5 μM的地塞米松，其余步骤及工艺参数均与实施例10相同，在此不再赘述。
实施例13
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例4的不同之处在于，步骤（3）中，加入20 μM的白藜芦醇且未施加X射线辐照，其余步骤及工艺参数均与实施例1相同，在此不再赘述。
实施例14
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例13的不同之处在于，步骤（3）中，加入40 μM的白藜芦醇，其余步骤及工艺参数均与实施例13相同，在此不再赘述。
实施例15
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例13的不同之处在于，步骤（3）中，加入60 μM的白藜芦醇，其余步骤及工艺参数均与实施例13相同，在此不再赘述。
实施例16
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例4的不同之处在于，步骤（3）中，加入0.2 μM的TN14003冻干粉且未施加X射线辐照，其余步骤及工艺参数均与实施例1相同，在此不再赘述。
实施例17
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例16的不同之处在于，步骤（3）中，加入1 μM的TN14003冻干粉，其余步骤及工艺参数均与实施例16相同，在此不再赘述。
实施例18
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例16的不同之处在于，步骤（3）中，加入2 μM的TN14003冻干粉，其余步骤及工艺参数均与实施例16相同，在此不再赘述。
实施例19
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例4的不同之处在于，步骤（3）中，加入0.2 μM的T140冻干粉且未施加X射线辐照，其余步骤及工艺参数均与实施例1相同，在此不再赘述。
实施例20
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例19的不同之处在于，步骤（3）中，加入1 μM的T140冻干粉，其余步骤及工艺参数均与实施例19相同，在此不再赘述。
实施例21
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例19的不同之处在于，步骤（3）中，加入2 μM的T140冻干粉，其余步骤及工艺参数均与实施例19相同，在此不再赘述。
实施例22
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例4的不同之处在于，步骤（3）中，加入0.2 μM的AMD3100冻干粉且未施加X射线辐照，其余步骤及工艺参数均与实施例1相同，在此不再赘述。
实施例23
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例22的不同之处在于，步骤（3）中，加入0.6 μM的AMD3100冻干粉，其余步骤及工艺参数均与实施例22相同，在此不再赘述。
实施例24
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例22的不同之处在于，步骤（3）中，加入1 μM的AMD3100冻干粉，其余步骤及工艺参数均与实施例22相同，在此不再赘述。
对比例4
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例10的不同之处在于，步骤（3）中，未加入药物直接进行，其余步骤及工艺参数均与实施例10相同，在此不再赘述。
试验例2
分别测定实施例10-24及对比例4提供的干细胞分泌物中SDF-1的含量，结果如下表2所示，其中，SDF-1含量按照Western blot法检测。
表2
（三）X射线照射后培养时间对干细胞分泌物SDF-1表达水平的影响
实施例25
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例1的不同之处在于，步骤（3）中，采用20 μg/mL碘海醇与脐带干细胞共培养2天后，加入40 μM的白藜芦醇且同时施加0.5 Gy剂量的X射线照射，照射剂量率为143.25 cGy/min，照射后培养时间为1天，其余步骤及工艺参数均与实施例1相同，在此不再赘述。
实施例26
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例25的不同之处在于，步骤（3）中，X射线照射后培养时间为2天，其余步骤及工艺参数均与实施例25相同，在此不再赘述。
实施例27
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例25的不同之处在于，步骤（3）中，X射线照射后培养时间为4天，其余步骤及工艺参数均与实施例25相同，在此不再赘述。
实施例28
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例25的不同之处在于，步骤（3）中，施加1 Gy剂量的X射线照射，照射剂量率为143.25 cGy/min，照射后培养时间为1天，其余步骤及工艺参数均与实施例25相同，在此不再赘述。
实施例29
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例28的不同之处在于，步骤（3）中，X射线照射后培养时间为2天，其余步骤及工艺参数均与实施例28相同，在此不再赘述。
实施例30
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例28的不同之处在于，步骤（3）中，X射线照射后培养时间为4天，其余步骤及工艺参数均与实施例28相同，在此不再赘述。
实施例31
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例25的不同之处在于，步骤（3）中，施加2 Gy剂量的X射线照射，照射剂量率为143.25 cGy/min，照射后培养时间为1天，其余步骤及工艺参数均与实施例25相同，在此不再赘述。
实施例32
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例31的不同之处在于，步骤（3）中，X射线照射后培养时间为2天，其余步骤及工艺参数均与实施例31相同，在此不再赘述。
实施例33
本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例33的不同之处在于，步骤（3）中，X射线照射后培养时间为4天，其余步骤及工艺参数均与实施例33相同，在此不再赘述。
对比例5
本对比例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例25的不同之处在于，步骤（3）中，未施加X射线照射，加入40 μM的白藜芦醇培养1天，其余步骤及工艺参数均与实施例25相同，在此不再赘述。
对比例6
本对比例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与对比例5的不同之处在于，步骤（3）中，加入40 μM的白藜芦醇培养2天，其余步骤及工艺参数均与对比例5相同，在此不再赘述。
对比例7
本对比例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与对比例5的不同之处在于，步骤（3）中，加入40 μM的白藜芦醇培养4天，其余步骤及工艺参数均与对比例5相同，在此不再赘述。
试验例3
分别测定实施例25-33及对比例5-7提供的干细胞分泌物中SDF-1的含量，结果如下表3所示，其中，SDF-1含量采用ELISA法检测。
表3
从表3中实施例25-33与对比例5-6的对比可以看出，第1天2 Gy组SDF-1略有下降，4 Gy组SDF-1显著降低；第2天2 Gy组SDF-1明显恢复并逐渐升高，而4 Gy组SDF-1进一步下降；至第4天，4 Gy组几乎不能测出SDF-1，而2 Gy组SDF-1的含量为所有组别中最高的一组。
各组对应时间点比较：0.5 Gy组随着照射后培养时间延长SDF-1表达水平呈缓慢增长，其SDF-1含量与对比例5-7相比略有提高；2 Gy组的SDF-1含量在第1天有所下降，在第2天即明显回升，直至第4天SDF-1含量升高至明显超过对照组；4 Gy组中的SDF-1含量持续降低直至测不出。
通过表3中的数据显示说明，较小剂量(0.5 Gy)X射线辐射后SDF-1含量随着时间推移逐渐升高，对比例5-7组略有提升。而2 Gy剂量X射线辐射后，SDF-1含量先下降，后回升恢复至对照组水平之后持续上升。而较大剂量(4 Gy)X射线辐射后SDF-1显著下降，在随后的时间内依然未见恢复，直至最后完全检测不到。
二、生物活性硫酸钙骨水泥
（一）工艺条件对骨水泥固化时间以及可注射时间的影响
实施例34
本实施例提供了一种生物活性硫酸钙骨水泥，按照如下步骤制备而成：称取30 gα-半水硫酸钙，加入24 g微球冻干粉，再加入18 mL含3% 透明质酸的固化液到混合物中，整个过程在冰面上操作，并持续缓慢搅拌，调成泥浆状，然后静置，在凝结时间测定仪上测定固化时间，当孔点深度在1 mm时，则为终凝时间。浆液在8 min后开始初凝，在13 min后终凝，可注射时间为2-4 min。
其中，微球冻干粉按照以下步骤制备而成：
(1)分析天平称取25 mg甲基化聚乙二醇-聚乙交酯丙交酯(Mermethoxy-poly(ethylene glycol)–poly(lactide-co-glycolide), mPEG-PLGA)，溶于1 mL氯仿(CHCl
（2）取400 μL高压灭菌的双蒸水，加入干细胞分泌物的浓溶液稀释至SDF-1的质量含量为2%，作为内水相。
（3）将步骤S1、S2得到的油相和内水相超声混合5次，每次2 s，得到初乳剂。
（4）向步骤S3的产物加入4 mL聚乙烯醇（PVA）水溶液（5 wt%），超声混合5次（2 s，100W）形成复乳剂。
（5）将步骤S4的产物稀释到聚丙烯酸（PAA）水溶液中（5 wt%，40 mL），室温下过夜搅拌、避光挥发。
（6）用50 mL高速离心管收集步骤S5含微球溶液，先用无水乙醇清洗一次，高速离心（14500 rpm，20 min），弃上清，超声均匀，再加入纯水清洗，高速离心（12000 rpm，10min），重复2～3次，最终所得沉淀即为微球，将微球冷冻干燥，即得到微球冻干粉。
通过差量法检测微球离心后收集的上清液，经ELISA或蛋白定氮法检测计算上清液中的蛋白质含量，实测包封率为45.3%。
实施例35
本实施例提供了一种生物活性硫酸钙骨水泥，按照如下步骤制备而成：
称取30 g α-半水硫酸钙，加入15 g微球冻干粉（微球冻干粉同实施例34），再加入16.5 mL含1.5% 透明质酸的固化液到混合物中，整个过程在冰面上操作，并持续缓慢搅拌，调成泥浆状，然后静置。在凝结时间测定仪上测定固化时间，当孔点深度在1 mm时，则为终凝时间。浆液在6 min后开始初凝，在12 min后终凝，可注射时间为2-5 min。
实施例36
本实施例提供了一种生物活性硫酸钙骨水泥，按照如下步骤制备而成：
称取30 g α-半水硫酸钙，加入0.9 g微球冻干粉（微球冻干粉同实施例34），再加入15 mL含3% 透明质酸的固化液到混合物中，整个过程在冰面上操作，并持续缓慢搅拌，调成泥浆状，然后静置。在凝结时间测定仪上测定固化时间，当孔点深度在1 mm时，则为终凝时间。浆液在7 min后开始初凝，在16 min后终凝，可注射时间为2-8 min。
实施例37
本实施例提供了一种生物活性硫酸钙骨水泥，按照如下步骤制备而成：
称取30 g α-半水硫酸钙，加入24 g微球冻干粉（微球冻干粉同实施例34），再加入18 mL含0.2% 透明质酸的固化液到混合物中，整个过程在冰面上操作，并持续缓慢搅拌，调成泥浆状，然后静置，在凝结时间测定仪上测定固化时间，当孔点深度在1 mm时，则为终凝时间。浆液在5 min后开始初凝，在8 min后终凝，可注射时间为2-3 min。
实施例38
本实施例提供了一种生物活性硫酸钙骨水泥，按照如下步骤制备而成：
称取30 g α-半水硫酸钙，加入24 g微球冻干粉（微球冻干粉同实施例34），再加入12 mL含0.2% 透明质酸的固化液到混合物中，整个过程在冰面上操作，并持续缓慢搅拌，调成泥浆状，然后静置，在凝结时间测定仪上测定固化时间，当孔点深度在1 mm时，则为终凝时间。浆液在2 min后开始初凝，在3-4 min后终凝，可注射时间为1-2 min，因固化不完全，需要施加极大的压力(>2 MPs)才能从0.8 mm内径针头中挤出。
实施例39
本实施例提供了一种生物活性硫酸钙骨水泥，按照如下步骤制备而成：
称取30 g α-半水硫酸钙，加入24 g微球冻干粉（微球冻干粉同实施例34），再加入24 mL含3% 透明质酸的固化液到混合物中，整个过程在冰面上操作，并持续缓慢搅拌，调成泥浆状，然后静置，在凝结时间测定仪上测定固化时间，当孔点深度在1 mm时，则为终凝时间。浆液在10 min后开始初凝，在30 min后终凝，可注射时间为10-20 min，因固化用水太多，固化后压缩强度低于正常值50%以上。
（二）工艺条件对骨水泥生物活性的影响
实施例40
本实施例提供了一种生物活性硫酸钙骨水泥，由30 g α-半水硫酸钙、15 mgSDF-1冻干粉（上海联迈生物工程有限公司）和15 mL含3% 透明质酸制成。
实施例41
本实施例提供了一种生物活性硫酸钙骨水泥，由30 g α-半水硫酸钙、3 g微球冻干粉（同实施例34微球冻干粉）和15 mL含3% 透明质酸制成。
实施例42
本实施例提供了一种生物活性硫酸钙骨水泥，由30 g α-半水硫酸钙、20 g微球冻干粉（同实施例34微球冻干粉）和15 mL含3% 透明质酸制成。
对比例8
本对比例提供了一种生物活性硫酸钙骨水泥，由30 g α-半水硫酸钙、和15 mL含3% 透明质酸制成，未加入微球冻干粉及SDF-1。
试验例4
分别测定实施例40-42及对比例8提供的骨水泥的生物活性，结果如表4所示，具体测试方法为：采用Transwell悬挂式细胞培养皿，下层放置上述α-半水硫酸钙骨水泥材料，将间充质干细胞以2×10
表4
试验例5
以大鼠为模型，分别将实施例41-42及对比例8提供的生物活性硫酸钙骨水泥进行动物实验，测定生物活性硫酸钙骨水泥对骨质疏松大鼠颅骨缺损的修复效果。
所述测定方法按照如下步骤进行：
（1）动物模型的建立：
将24只大鼠先用1%戊巴比妥(40 mg/kg)进行腹腔麻醉。麻醉显效后采用俯卧位，置于恒温固定台上，四肢及头部固定良好。于背部正中线旁开1.5 cm，双侧肋缘下1.5 cm处为中心，1.5 cm为半径常规备皮，术区消毒，盖无菌铺单，然后用11号手术刀以背部后正中线旁开1.5 cm，双侧肋缘下1 cm作切口，切口长1.0-1.5 cm，切开皮肤后，钝性分离腹肌、腹膜后进腹。找到脂肪包裹呈粉红色桑葚状的卵巢，轻柔分离卵巢下输卵管与脂肪，并在子宫角上方的输卵管狭部作丝线结扎，结扎后用眼科剪剪去卵巢，然后检查卵巢是否切除干净及子宫角有无出血，修整后轻柔送回腹腔内，缝合肌肉、筋膜，并间断缝合皮肤，撒以青霉素粉。用同样的方法切取对侧卵巢，缝合伤口。去势术后12周，动物在全麻醉下，行颅骨极量缺损。用质量分数为10%的水合氯醛（3.0～3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，俯卧位固定于手术台上，用空心环钻头垂直于颅骨表面用力，在矢状缝左右两侧的顶骨各钻取直径5 mm的圆形全层骨缺损。
（2）动物试验分组：
将步骤（1）中的24只颅骨缺损的骨质疏松大鼠模型随机分为3组，将实施例41-42及对比例8提供的生物活性硫酸钙骨水泥分别注射入3组大鼠颅骨缺损处，初凝后逐层缝合，术后动物侧卧位，注意保温，连续3 d每日每只肌肉注射青霉素（20万单位）以防止感染。
（3）骨修复指标测定方法：
（3.1）微型计算机断层扫描（Micro-CT）技术：Micro-CT 用于定量评估缺损部位新生骨形成。使 Micro-CT（Scanco Medical，Bassersdorf，瑞士）进行高分辨率 70 kV 电压扫描成像。同时通过扫描采用标准化的分割参数（sigma：0.8，阈值：220~1 000）进行三维重建。在缺损区域（直径=5 mm）周围（不包括相邻的原生骨）绘制圆形轮廓线，通过机器内置软件从 2D 切片生成样本的 3D 重建图像。最后再采用 Micro-CT 软件包中包含的定量三维评价程序计算所选圆形缺损内的骨体积。定量结果包括骨量/组织体积分数（bone volume/tissue volume，BV/TV）和骨密度（bone mineral density，BMD）。
（3.2）组织学分析：将骨组织样品以10％福尔马林溶液固定，然后以9％甲酸（Sigma-Adrich，St. Louis，MA）在室温下置于摇床，进行为期3周的脱钙。乙醇中梯度脱水后，将样品包埋在石蜡中并以冠状平面进行切片（厚度=5 μm）。切片经苏木素-伊红染色。为检测新生骨组织中成骨的活跃程度，行免疫组化染色检测骨涎蛋白（osteopontin，OPN；抗OPN抗体，Santa Cruz，USA）表达情况。辣根过氧化物酶显色，苏木素复染，脱水封片后显微镜下观察。
（4）统计学处理：
使用SPSS 16.0（SPSS，Chicago，IL，US）进行统计学分析，正态分布数据以均数±标准差（x±s）表示。通过单因素方差分析法分析计量资料 BV/TV和BMD的组间统计学差异，以Turkey’st检验进行组间两两比较，检验水准 α=0.05。
（5）测定结果：
Micro-CT扫描结果显示对比例8（空白对照组）缺损部位显示出不规则点状或片状骨形成，边缘具有部分新生骨；而实施例41（低微球含量组）在缺损边缘具有较多矿化区域。与其他组相比，注射入实施例42（高微球含量）的骨水泥后，在缺损区域内发现了明显的矿化组织形成，基本覆盖缺损区域。
定量数据统计分析结果如表5所示，从表5可以看出对比例8（空白对照组）、实施例41（低微球含量组）和实施例42（高微球含量组）的BV/TV分别是（5.23±1.32）%、（9.17±1.17）%和（12.6±3.50）%，BMD分别是（86.33±14.98）mg/cm
组织学结果表明，骨缺损区新生骨组织的分布和数量与Micro-CT分析结果一致。对照组仅有薄层纤维结缔组织覆盖，仍有大量未填充的间隙；而在注射入低微球含量的骨水泥后，缺损区比空白区发现更多的新生骨形成。在注射入高微球含量的骨水泥的缺损中，新骨形成明显增强，新生骨组织与颅骨缺损处的原骨融合良好。免疫组化染色结果提示成骨分化指标OPN在新生骨组织中高度表达。
表5
试验例6
建立16只兔桡骨远端骨折模型，随即分成不做处理组（A组），注射骨水泥（实施例35提供的骨水泥）内固定组（B组），每组8只。术后第1 w、2 w、3 w、4 w桡骨直接数字化X射线摄影（DR）检查，于术后第6 w、8 w、10 w、12 w进行桡骨三维CT检查。放射学检查显示，在术后 1 w-4 w，同时期DR摄片检查B组骨痂生成量比A组生成量少15%，且骨痂密度较低；第6w、8 w、10 w、12 w的三维 CT，后经三维重建骨痂显示，同时期B组骨痂三维重建后，骨痂生成比A组少约30%。
试验例7
本试验例用于验证实施例36提供的生物活性硫酸钙骨水泥对修复牙槽骨缺损的治疗效果，具体按照如下步骤进行：
（1）动物模型的建立：
共纳入6只贵州小型猪，用台式慢机磨除的方法建立贵州小型猪上下颌骨二类牙周骨缺损模型，骨缺损位于第三前磨牙和第四前磨牙之间，暴露第四前磨牙的近中牙根。
（2）动物试验分组：
将6只贵州小型猪分为2组：实验组在骨缺损处注入实施例36提供所述骨水泥进行缺损修复；对照组不进行修复。两组在骨缺损区域表面都覆盖口腔生物膜。造模后12周，进行结果验证。
（3）治疗效果验证指标：
（3.1）临床指标观察：造模后12周进行临床指标测量，通过牙周探针测量牙周探诊深度，牙龈退缩和附着水平指标，观察3组愈合情况。
（3.2）主要观察指标：各组动物牙周骨缺损的修复情况。
（4）统计学分析：
临床检查指标结果用x±s表示，采用SPSS 17.0统计软件包的单因素方差分析进行组间比较，两两比较采用t检验，P<0.05为差异有显著性意义。
（5）结果如表6所示：
表6
从表6可以看出注射实施例36提供的骨水泥修复牙周骨缺损小型猪临床指标的改善造模后12周，通过牙周探针测量发现，实验组动物的牙周探诊深度、牙龈退缩及附着水平情况等均明显优于对照组牙周情况，各指标间两两比较差异均有显著性意义(P<0.05)。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。