嗜热羧酸酯酶突变体及其应用

文献发布时间：2023-06-19 16:06:26

本申请要求于2022年03月22日提交中国专利局、申请号为202210282464.0、发明名称为“嗜热羧酸酯酶突变体及其应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及嗜热羧酸酯酶突变体及其应用。

背景技术

羧酸酯酶(EC 3.1.1.1)作为一种重要的工业酶，可以催化羧酸酯的水解，属于酯酶的一种，基于羧酸酯酶的区域特异性，立体特异性，广泛的底物特异性，反应不需要辅酶并且对有机溶剂具有耐受性，羧酸酯酶成为一种具有吸引力的催化剂。羧酸酯酶属于α/β水解酶家族，水解水溶性的含有酯键的小分子物质，生成产物醇和羧酸。羧基酯酶一般是催化水溶性的较短(<10个碳原子)脂肪酸链酯的水解反应(Le L T H L，Yoo W，Jeon S，etal.Characterization and immobilization of a novel SGNH family esterase(LaSGNH1)from Lactobacillus acidophilus NCFM.Intemational Journal ofBiological Macromolecules，2020，21(1)：91；Bhatt P，Huang Y，Zhan H，et al.BraultG，Shareck F，Hurtubise Y，et al.Isolation and characterization of EstC，a newcold-active esterase from Streptomyces coelicolor A3(2).PLoS One 2012，7(3)：e32041.)。

羧酸酯酶的应用广泛，有几种来源于细菌或真菌的羧酸酯酶已成为商业用途的生物催化剂，广泛应用于各行各业，如食品，制药，化妆品，有机合成，洗涤剂，生物燃料和调味品生产中。

然而，通常的羧酸酯酶进行的催化反应，无法在条件苛刻的环境下进行，例如高温，盐度不合适，pH不适宜，或者强浓度的有机溶剂存在下。因此，需要进行大量的筛选，力求从已有的或者未挖掘的微生物中筛选具有特定性质的羧酸酯酶，或者通过改变现有的羧酸酯酶结构，期待改善其相关的催化性能。例如来源于嗜热芽孢杆菌Bacillusthermocloaceae的羧酸酯酶Est5250，对各种有机溶剂有很强的耐受性(Yang Y，Ghatge S，Hur H G.Characterization of a novel thermostable carboxylesterase fromthermoalkaliphilic bacterium Bacillus thermocloaceae.Biosci.Biotech.Bioch.2019，83(5)：882-891)。

但目前，由于过量或不规范使用农药，导致农药的残留或者超标，严重污染环境甚至危害生物的生存。而在农药的降解中，酶反应的环境通常是苛刻的，因此，进一步研究具有良好耐受性的嗜热羧酸酯酶存在重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供了稳定性良好的嗜热羧酸酯酶突变体及其应用。

本发明提供的嗜热羧酸酯酶突变体，其在如SEQ ID NO：1所示野生型的氨基酸序列中第160的蛋氨酸突变为赖氨酸。

在本发明中，所述嗜热羧酸酯酶突变体被记做Est

本发明还提供了编码嗜热羧酸酯酶突变体Est

野生型嗜热羧酸酯酶的核酸序列SEQ ID NO：3所示。其第478～480位核酸为编码蛋氨酸的密码子，本发明所述突变体的编码核酸序列中，第478～480位核酸为编码赖氨酸的密码子，例如，其可为AAA或AAG。一些具体实施例中，所述编码嗜热羧酸酯酶突变体Est

本发明还提供了一种表达载体，其包括本发明所述的编码嗜热羧酸酯酶突变体Est

本发明还提供了转化或转染所述的表达载体的宿主细胞。

本发明所述的表达载体可为穿梭载体，其在大肠杆菌中保存，在酵母菌中表达蛋白。所述表达载体的骨架载体为pPIC9K。所述大肠杆菌为大肠杆菌DH5α，所述酵母菌为毕赤酵母。

本发明所述突变体的制备方法，包括：培养本发明所述的宿主细胞，诱导所述突变体的表达。

在本发明所述的制备方法中，所述诱导的诱导剂为甲醇。所述培养的培养基为液体BMGY培养基。

本发明所述的突变体Est

本发明中，所述酯类包括C2～C16的酯类，包括对硝基苯乙酸酯(C2)、对硝基苯丁酸酯(C4)、对硝基苯己酸酯(C6)、对硝基苯辛酸酯(C8)、对硝基苯癸酸酯(C10)、对硝基苯月桂酸酯(C12)、对硝基苯肉豆蔻酸酯(C14)、对硝基苯棕榈酸酯(C16)。本发明所述的酯类还包括酯类杀虫剂。例如，所述酯类包括除虫菊酯、拟除虫菊酯和马拉硫磷。

本发明还提供了一种降解酯类物质的产品，其特征在于，包括本发明所述的突变体Est

本发明提供的降解酯类物质的产品为菌剂，或者固定化的酶制剂。在本发明实施例中，所述降解酯类物质的产品为填充床生物反应器。该反应器包括内部填充本发明所述的突变体Est

本发明还提供了一种降解酯类物质的方法，其包括以本发明所述的产品处理。

一些实施例中，所述一种降解酯类物质的方法包括将污染物通过本发明所述的填充床生物反应器，在60℃下进行孵育和降解。

本发明提供了嗜热羧酸酯酶突变体，其由嗜热乌氏芽孢杆菌的嗜热型羧酸酯酶突变而来，其最适pH为8.0，最适温度60℃，在pH 8.0条件下，70℃的条件下热稳定性良好，60℃孵育60h后，仍保留40％左右的残留酶活性。且在70℃保温1h，该羧酸酯酶仍具有良好的酶活，适于工业上应用的要求，该突变体在酵母中的表达酶活为387U/mg，其应用空间更广。

附图说明

图1：嗜热乌氏芽孢杆菌羧酸酯酶毕赤酵母KM71重组菌在1％甲醇下诱导表达的蛋白电泳图，M为蛋白Marker，1-2为Est

图2示对硝基苯酚(p-NP)的标准曲线；

图3示重组羧酸酯酶Est

图4示重组羧酸酯酶Est

图5示重组羧酸酯酶Est

图6示重组羧酸酯酶Est

图7示化学试剂对重组羧酸酯酶Est

图8示用于农药生物降解的填充床生物反应器；

图9示马拉硫磷标准曲线；

图10示固定化酶1x-Est

图11示联苯菊酯的检测波长，降解反应后的图片和反应前后HPLC检测结果，其中a示联苯菊酯的UV-Vis吸收光谱，b示联苯菊酯生物降解反应前后溶液变化的图片，c示联苯菊酯标准品和河水中加入联苯菊酯标准品之后的HPLC检测样品，d示固定化酶1x-Est

图12示固定化酶1x-Est

具体实施方式

本发明提供了嗜热羧酸酯酶突变体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。

本发明提供了一种来源于嗜热乌氏芽孢杆菌的嗜热型羧酸酯酶，其氨基酸序列为：MKIVPPKPFFFEAGERAALLLHGFTGNSADVRMLGRFLESKGYTCHAPIYKGHGVPPEELVRTGPDDWWQDVMNSYQFLKNKGYEKIAVAGLSLGGVFSLKLGYTVPIEGIVTMCAPMYVKSEETMYEGVLEYAREYKKREGKSAEQIEQEMERFKQTPMKTLKALQELIADVRAHLDLVYAPTFVVQARHDEMINPDSANIIYNEIESPVKRIKWYEQSGHVITLDQEKDQLHEDIYAFLESLDW(SEQ ID NO：1)。

编码SEQ ID NO：1所示嗜热乌氏芽孢杆菌的嗜热型羧酸酯酶的核酸序列为：atgaaaattgttccgccgaagccgtttttctttgaagccggggagcgggcggcgctgcttttgcacggattcactggcaattcggctgacgttcggatgctcgggcgattccttgaatcgaaaggctacacatgccatgccccgatttacaaagggcacggcgtgccgccggaagagctcgtccgcaccgggccggacgattggtggcaagacgttatgaacagctatcagtttttaaaaaacaaaggttacgaaaaaattgccgtggccgggttgtcgcttggaggggtattttcgttgaaattaggttacactgtacctatagaagggattgtgacgatgtgcgcgccgatgtatgtcaaaagcgaggaaacgatgtatgaaggcgtcctcgagtatgcgcgcgaatataaaaagcgggaaggaaaatcggccgaacaaatcgaacaggaaatggaacggttcaagcagacgccgatgaagacgttgaaagccttacaggagctcattgccgatgtgcgcgcccatcttgatttggtttatgcaccgacgttcgtcgtccaagcgcgccatgatgagatgatcaatcccgacagcgcgaacatcatttataacgaaattgaatcgccggtcaaacggatcaaatggtatgagcagtctggccatgtgattacgcttgatcaagaaaaagatcagctgcatgaagatatttatgcatttcttgaatcgttagattggtaa(SEQ ID NO：2)。

本发明提供了一种具有羧酸酯酶活性的突变体，其为SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第160位的蛋氨酸突变为赖氨酸，即est

编码SEQ ID NO：3所示嗜热乌氏芽孢杆菌的嗜热型羧酸酯酶突变体的核酸序列为：atgaaaattgttccgccgaagccgtttttctttgaagccggggagcgggcggcgctgcttttgcacggattcactggcaattcggctgacgttcggatgctcgggcgattccttgaatcgaaaggctacacatgccatgccccgatttacaaagggcacggcgtgccgccggaagagctcgtccgcaccgggccggacgattggtggcaagacgttatgaacagctatcagtttttaaaaaacaaaggttacgaaaaaattgccgtggccgggttgtcgcttggaggggtattttcgttgaaattaggttacactgtacctatagaagggattgtgtcgatgtgcgcgccgatgtatgtcaaaagcgaggaaacgatgtatgaaggcgtcctcgagtatgcgcgcgaatataaaaagcgggaaggaaaatcggccgaacaaatcgaacaggaaatggaacggttcaagcagacgccgaagaagacgttgaaagccttacaggagctcattgccgatgtgcgcgcccatcttgatttggtttatgcaccgacgttcgtcgtccaagcgcgccatgatgagatgatcaatcccgacagcgcgaacatcatttataacgaaattgaatcgccggtcaaacggatcaaatggtatgagcagtctggccatgtgattacgcttgatcaagaaaaagatcagctgcatgaagatatttatgcatttcttgaatcgttagattggtaa(SEQ ID NO：4)。

本发明从嗜热乌氏芽孢杆菌(Geobacillus uzenensis)中克隆获得了新的热稳定性羧酸酯酶基因，发现了该基因编码的酶蛋白具有的优异的酶学性质，可运用于酯水解类的催化反应等生产过程。同时本次发明也成功克隆得到了可以大量表达羧酸酯酶的工程菌，可实现该酯酶的规模化生产，成为后续工业化应用的基础。

在微生物降解农药的过程中，周围的环境会大大影响微生物的生长代谢等。如果降解反应可以使用相应的农药降解酶，可以消除这种环境的影响。另外，农药降解酶具有较好的环境耐受性，且催化反应高效，应用安全且易于广泛降解农药。本发明所述的突变体能够有效的降解联苯菊酯。

对农药马拉硫磷进行降解实验：当马拉硫磷浓度为20mg/L时，在50U固定化酶1x-Est

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1羧酸酯酶及其突变体基因的扩增

1.1菌株及其培养

本发明所述的羧酸酯酶基因克隆自嗜热乌氏芽孢杆菌(Geobacillusuzenensis)，可以从德国微生物菌种保藏中心直接购买，菌种编号为DSMZ23157。因此，本发明所述的嗜热乌氏芽孢杆菌可通过商购途径获得，也可以通过野外采集和其他途径获得。

接种甘油菌至1号培养基，50℃培养48h收集菌体，用于基因组提取。

1.2基因组提取

参照Generay细菌基因组DNA快速提取试剂盒说明书。

1.3嗜热乌氏芽孢杆菌羧酸酯酶基因的扩增

在NCBI上找到嗜热乌氏芽孢杆菌相近种属羧酸酯酶的基因序列，设计引物，以基因组DNA为模板进行PCR扩增，对得到的PCR产物进行测序。测序结果表明，PCR扩增得到的核酸片段包含酶切位点和具有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的核酸片段；SEQ ID NO：3所示核苷酸序列共743bp，编码SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，共246个氨基酸残基。将该具有SEQID NO：3所示核苷酸序列的核酸片段命名为est

1.4嗜热乌氏芽孢杆菌羧酸酯酶突变体编码核酸序列的合成

突变体Est

实施例2含有羧酸酯酶及其突变体的毕赤酵母重组表达载体的构建及表达

2.1重组表达载体pPIC9K-Est

含pPIC9K的大肠杆菌DH5α宿主菌用AxyPrep质粒DNA提取试剂盒提取质粒(操作步骤参照说明书)，用Not I和EcoR I(购自Themo)对pPIC9K质粒进行双酶切，将酶切产物与上述实施例1扩增的基因片段在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒，转化至大肠杆菌DH5α(购自天根生化科技(北京)有限公司)，PCR验证阳性克隆并测序，将测序结果在NCBI上进行比对并分析表明，所获得的羧酸酯酶基因DNA由741个核苷酸组成，序列如SEQID NO：3所示。该DNA编码246个氨基酸，其序列如SEQ ID NO：1。

2.2重组表达载体pPIC9K-Est

重组表达载体pPIC9K-Est

2.3毕赤酵母系统表达

用Sal I对pPIC9K-Est

pPIC9K-Est

图1：嗜热乌氏芽孢杆菌羧酸酯酶毕赤酵母KM71重组菌在1％甲醇下诱导表达的蛋白电泳图，其中M为蛋白Marker，1-2为Est

实施例3羧酸酯酶酶活测定

3.1标准曲线绘制

将配制浓度为50mM的对硝基苯酚母液稀释10倍，按下表体系加入到Ep管中，在405nm处测定其的吸光值。以对硝基苯酚(p-NP)的浓度和OD

反应体系：

3.2酶活测定

羧酸酯酶酶活测定方法通过水解对硝基苯酚酯生成产物对硝基苯酚(p-NP)在405nm有紫外吸收峰(呈黄色)，最终检测生成p-NP的量来定义羧酸酯酶的酶活。1个单位酶活(U)：单位时间生成1μmoL的产物p-NP所需的羧酸酯酶。各种底物(25mM)溶液均用体积比为3∶1的异丙醇∶二甲基亚砜溶液配置。测定酶活体系：取2mL的EP管，900μL缓冲液，20μL的底物溶液混合，再加入20μL适当稀释羧酸酯酶溶液。在该酶最适温度的条件下反应5min，向体系中加入1mL的95％乙醇终止反应后测定吸光值(405nm)，酶活通过对照标准曲线(对硝基苯酚)得出(用空白对照试管的样品调零分光光度计)。

实施例4重组羧酸酯酶的酶学性质测定

4.1最适反应底物测定：首先在pH为7.0的磷酸盐缓冲液中通过测定羧酸酯酶水解各种对硝基苯酚酯(C2-C16)底物的能力来确定最适底物，受试底物包括：对硝基苯乙酸酯(C2)、对硝基苯丁酸酯(C4)、对硝基苯己酸酯(C6)、对硝基苯辛酸酯(C8)、对硝基苯癸酸酯(C10)、对硝基苯月桂酸酯(C12)、对硝基苯肉豆蔻酸酯(C14)、对硝基苯棕榈酸酯(C16)。其中酶活力最高的设为100％。

如图4所示，纯化后测定Est

4.2最适反应温度测定：按标准反应体系通过使用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液(以C6为底物)测定羧酸酯酶的最适反应温度，温度梯度为30-80℃，其中酶活力最高的设为100％。

如图5所示，表明重组羧酸酯酶Est

4.3最适pH值测定：最适pH是通过在50℃下以C6为底物并在pH为4.0至10.0的不同缓冲液中测量酶活性来确定的(pH为4.0-5.0：50mM柠檬酸盐缓冲液，pH为6.0-7.0：50mM磷酸钠缓冲液，pH为8.0的50mM Tris-盐酸缓冲液，pH为9.0-10.0：50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，其中酶活力最高的设为100％。

如图3所示，Est

4.4热稳定性分析：热稳定性通过在一定温度下(50℃，60℃，70℃)将酶保温60小时来确定其残留酶活性来评估。对照(保温前的酶)酶活力为100％活性，每组测定3次。

如图6所示，Est

4.5化学试剂对羧酸酯酶酶活的影响

为了实际应用，还确定了各种表面活性剂和一些化学试剂对羧酸酯酶活性的影响，本研究实验了几种典型的化学试剂(如SDS，CTAB，Tween-20，Tween-80，TritonX-100和螯合剂EDTA)加入反应体系中，保温1小时并测定它们对羧酸酯酶活性的影响。

如图7所示，表面活性剂SDS和Tween20对羧酸酯酶活性几乎没有影响，CTAB和TritonX-100降低了酶活性，而EDTA改善了酶活性。这些结果表明，常见的螯合剂EDTA和经典的表面活性剂SDS对酶活性几乎没有影响。该羧酸酯酶适用于工业应用，可以用作废水处理中化学催化剂的替代品。

实施例5重组羧酸酯酶的对农药的降解作用

5.1实验试剂

几种农药标准物购于国家标准中心，通过将不同浓度的市售农药添加到生活用水中，模拟了不同浓度的农药污染废水。马拉硫磷快速测试卡购自绿洲食品技术(广州)有限公司。所有其他化学品均为分析纯或HPLC纯，并从当地市场购买。

5.2其他材料

本实验采用的是柱式反应器，反应器由长度为10cm，内径为1.0cm，双层套管玻璃组成，填充体积为10mL，柱子进出口安装有0.22μm过滤器，所有的开口都用带捏软木塞的硅管封闭。输送泵BT1002(LongerPump，保定，中国)。

5.3实验方法

5.3.1农药降解反应器的设置

自制的小型柱反应器由双层聚氯乙烯管组成，体积为10mL。将适量的固定化酶1x-Est

在选择反应器的类型时，考虑了本实验所使用的酶的状态、酶的性质、反应底物农药的物理化学性质、酶促反应的条件、羧酸酯酶的稳定性、反应的操作要求与应用的广泛性和实用性等方面因素。依照之前章节的研究结果、羧酸酯酶对农药的催化性质、固定化酶的形态和性质，综合考虑下来，本实验选择了经典的PBR(填充床式反应器)。将一定质量的固定化酶1x-Est

如图8的装置顺序图，具体的操作步骤如下：

1.底物预处理：将农药(市售或者标准品)在水中溶解，然后向其中加入一定浓度的盐溶液，调节pH至8.0左右，加热烧饼并搅拌约20min后，将底物溶液的pH再次调节所需的pH值8.0左右。

2.利用恒速输送泵将预处理好的底物(农药)溶液输入到装有固定化酶1x-Est

3.反应完成后，收集处理后的液体，用适量的缓冲溶液将反应器中固定化酶1x-Est

5.3.2 1x-Est

对于利用1x-Est

酶催化反应的高特异性、可以不受影响微生物生长和催化效率的外界环境条件、在高盐度或稀释条件下全细胞系统功能效率低下而对酶基本可以无影响、可以应用于不利于微生物生长的营养不良的各种环境中、对环境无害且不会产生类似于微生物转化产生的有毒有害的副产物、生产这些酶微生物未工程菌，生产速度较快且可以大批量生产，经济效益颇高、能够承受较宽的温度和pH微环境的各种变化。上述这些优点有利于开发的新型羧酸酯酶Est

有机磷农药马拉硫磷的降解条件如下：将反应体系置于10mL的锥形瓶中，加入固定化酶1x-Est

5.3.3 1x-Est

1x-Est

5.3.4利用反应器处理含联苯菊酯的废水

称取适量的联苯菊酯分别溶解至100mL自来水和河水中，置于烧杯或者锥形瓶中，联苯菊酯的终浓度为500mg/mL，调节pH至8.0左右(与标准品对比判定实验分析方法的可信度)。将反应的瓶子置于50℃的恒温水浴锅中，通过泵输送至装有2.5g固定化酶1x-Est

5.4实验结果与讨论

5.4.1 1x-Est

尽管马拉硫磷由于其良好的物理化学特性被广泛使用，但其大规模的生产和大量的使用对环境也造成了威胁，而且它也会对水，空气甚至是土壤污染。在一般的河水环境中，也会检测到马拉硫磷，且浓度范围是在0.001至0.6mg/L范围内，对生物的生存也会有影响。当马拉硫磷含量为0.06ppb时，对存在的淡水鱼类和一些无脊椎鱼类具有剧毒，而且马拉硫磷的毒性具有遗传性，对于鱼类的组织和DNA破坏较严重。另外，马拉硫磷的污染也会危害人类健康，据报导，在一定的马拉硫磷浓度下，会引起人类肝脏的氧化应激反应，对组织和细胞有毒害的影响，处于马拉硫磷污染的环境中，可能会改变细胞增殖并影响人类荷尔蒙。

为了研究马拉硫磷浓度对1x-Est

对于降解结果的试纸展示如图10中的a所示，该马拉硫磷标准品在试纸上未显示颜色，表明存在马拉硫磷且农药浓度超过1mg/L(实际滴加的马拉硫磷标品的浓度为10mg/L)。1x-Est

本实验测试了在60℃和pH 8.0的条件下1x-Est

5.4.2 1x-Est

首先，我们选择在10mL瓶具塞锥形瓶的反应系统中，使用固定化酶1x-Est

表1 1x-Est

为了进一步的实际应用，本实验使用10mL的填充床柱反应器降解联苯菊酯，先是模拟了常见废水的条件，在水中加入一定浓度的联苯菊酯，并测试了1x-Est

树脂的催化稳定性和树脂再生的条件在连续催化反应中至关重要，树脂催化剂的对于连续生产生物柴油的应用，取得了良好的效果，但是，反应器的运行稳定性和树脂的再生在很多研究中应用的并不理想。在这项研究中，研究使用实验室规模反应器(填充床反应器)与生物催化剂固定化酶1x-Est

表2 联苯菊酯分析方法准确度的实验结果

Actual dosage：将一定量的联苯菊酯标准样品加到已知含量为20％的乳油中的联苯菊酯悬浮液样品中；Theoretical dosag：联苯菊酯标准样品(同样处理)。

本研究初步解决了如何将开发的新型羧酸酯酶高效广泛的应用在实际生产中的问题。如图12所示，经过10批联苯菊酯农药降解的连续反应后，固定化的1x-Est

1x-Est

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海威高医疗技术发展有限公司

<120> 嗜热羧酸酯酶突变体及其应用

<130> MP22011512

<150> 202210282464.0

<151> 2022-03-22

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 246

<212> PRT

<213> 嗜热乌氏芽孢杆菌(Geobacillus uzenensis)

<400> 1

Met Lys Ile Val Pro Pro Lys Pro Phe Phe Phe Glu Ala Gly Glu Arg

1 5 10 15

Ala Ala Leu Leu Leu His Gly Phe Thr Gly Asn Ser Ala Asp Val Arg

20 25 30

Met Leu Gly Arg Phe Leu Glu Ser Lys Gly Tyr Thr Cys His Ala Pro

35 40 45

Ile Tyr Lys Gly His Gly Val Pro Pro Glu Glu Leu Val Arg Thr Gly

50 55 60

Pro Asp Asp Trp Trp Gln Asp Val Met Asn Ser Tyr Gln Phe Leu Lys

65 70 75 80

Asn Lys Gly Tyr Glu Lys Ile Ala Val Ala Gly Leu Ser Leu Gly Gly

85 90 95

Val Phe Ser Leu Lys Leu Gly Tyr Thr Val Pro Ile Glu Gly Ile Val

100 105 110

Thr Met Cys Ala Pro Met Tyr Val Lys Ser Glu Glu Thr Met Tyr Glu

115 120 125

Gly Val Leu Glu Tyr Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Arg Glu Gly Lys Ser

130 135 140

Ala Glu Gln Ile Glu Gln Glu Met Glu Arg Phe Lys Gln Thr Pro Met

145 150 155 160

Lys Thr Leu Lys Ala Leu Gln Glu Leu Ile Ala Asp Val Arg Ala His

165 170 175

Leu Asp Leu Val Tyr Ala Pro Thr Phe Val Val Gln Ala Arg His Asp

180 185 190

Glu Met Ile Asn Pro Asp Ser Ala Asn Ile Ile Tyr Asn Glu Ile Glu

195 200 205

Ser Pro Val Lys Arg Ile Lys Trp Tyr Glu Gln Ser Gly His Val Ile

210 215 220

Thr Leu Asp Gln Glu Lys Asp Gln Leu His Glu Asp Ile Tyr Ala Phe

225 230 235 240

Leu Glu Ser Leu Asp Trp

245

<210> 2

<211> 741

<212> DNA

<213> 嗜热乌氏芽孢杆菌(Geobacillus uzenensis)

<400> 2

atgaaaattg ttccgccgaa gccgtttttc tttgaagccg gggagcgggc ggcgctgctt 60

ttgcacggat tcactggcaa ttcggctgac gttcggatgc tcgggcgatt ccttgaatcg 120

aaaggctaca catgccatgc cccgatttac aaagggcacg gcgtgccgcc ggaagagctc 180

gtccgcaccg ggccggacga ttggtggcaa gacgttatga acagctatca gtttttaaaa 240

aacaaaggtt acgaaaaaat tgccgtggcc gggttgtcgc ttggaggggt attttcgttg 300

aaattaggtt acactgtacc tatagaaggg attgtgacga tgtgcgcgcc gatgtatgtc 360

aaaagcgagg aaacgatgta tgaaggcgtc ctcgagtatg cgcgcgaata taaaaagcgg 420

gaaggaaaat cggccgaaca aatcgaacag gaaatggaac ggttcaagca gacgccgatg 480

aagacgttga aagccttaca ggagctcatt gccgatgtgc gcgcccatct tgatttggtt 540

tatgcaccga cgttcgtcgt ccaagcgcgc catgatgaga tgatcaatcc cgacagcgcg 600

aacatcattt ataacgaaat tgaatcgccg gtcaaacgga tcaaatggta tgagcagtct 660

ggccatgtga ttacgcttga tcaagaaaaa gatcagctgc atgaagatat ttatgcattt 720

cttgaatcgt tagattggta a 741

<210> 3