提高赖氨酸和戊二胺发酵产量的方法

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，具体地说，涉及一种提高赖氨酸和戊二胺发酵产量的方法。

背景技术

赖氨酸是一种重要的必需氨基酸，在饲料添加剂、医药、保健品等领域有广泛的应用。赖氨酸的工业生产主要是通过微生物发酵的方法，常用的工业菌种包括谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌。在赖氨酸的生物合成过程中，每合成一分子的赖氨酸需要消耗4分子的NADPH。因此，强化NADPH的供给对于提高赖氨酸的产量具有至关重要的作用，目前已经报道的方法包括强化戊糖磷酸循环途径的关键基因表达以提高其代谢通量，通过表达转氢酶基因以实现从NADH到NADPH的转化，用NADH依赖型的脱氢酶替代赖氨酸合成途径中NADPH依赖型的氨基酸脱氢酶。戊二胺的生物合成同样高度依赖NADPH的供给，戊二胺是通过在赖氨酸生产菌株中表达赖氨酸脱羧酶获得的。

NADPH依赖型的甘油醛-3-磷酸脱氢酶催化甘油醛-3-磷酸的不可逆氧化并产生NADPH。之前的文献研究发现，将谷氨酸棒杆菌中NADH依赖型的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因gapA替换为NADPH依赖型的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因gapN可以提高谷氨酸棒杆菌合成赖氨酸的得率，但由于发酵早期细胞内NADPH的浓度过高会显著抑制谷氨酸棒杆菌的生长，从而降低赖氨酸的生产强度。因此，如何动态地调控细胞内NADPH的含量，在不影响细胞生长和赖氨酸生产强度的情况下提高赖氨酸的产量和得率成为亟需解决的技术难题。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高赖氨酸和戊二胺发酵产量的方法。

本发明构思如下：本发明提供一种动态调控细胞内NADH和NADPH含量的方法，通过利用受生长调控的启动子Pald控制谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中gapA基因的表达，以及利用Psod启动子控制额外引入的gapN基因的表达，使得生长早期gapA的表达较强从而维持细胞内正常的NADH浓度和细胞生长速度，而在指数生长中后期以及细胞生长稳定期，由于Pald表达强度的急剧降低以及Psod的表达强度的急剧提高，gapN获得高表达，使得在细胞内NADPH浓度显著提高，从而显著提高赖氨酸的产量和得率，该策略同样适用于显著提高戊二胺的产量。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供重组谷氨酸棒杆菌，所述重组谷氨酸棒杆菌是将谷氨酸棒杆菌的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因gapA的启动子替换为谷氨酸棒杆菌内源的乙醛缩酶脱氢酶基因启动子Pald，并将外源的NADPH依赖型的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因经密码子优化后，通过质粒导入谷氨酸棒杆菌中或通过基因工程手段整合到谷氨酸棒杆菌染色体上构建得到的。

优选地，所述NADPH依赖型的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因来源于变形链球菌(Streptococcus mutans)。

进一步地，所述NADPH依赖型的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因由Psod启动子驱动。

本发明中，出发菌株可以是谷氨酸棒杆菌ATCC 21543。

第二方面，本发明提供重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，所述方法包括：利用基因工程手段将谷氨酸棒杆菌的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因gapA的启动子替换为谷氨酸棒杆菌内源的乙醛脱氢酶基因启动子Pald，并在谷氨酸棒杆菌中过表达由Psod启动子驱动的来源于变形链球菌的NADPH依赖型的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因gapN。

具体地，所述重组谷氨酸棒杆菌的构建方法包括以下步骤：

A、重组菌C.glutamicum-ald的构建

a1、以谷氨酸棒杆菌ATCC 21543的基因组为模板，以ald-up-F和ald-up-R为引物进行PCR，获得基因片段ald-up并进行PCR产物纯化；以谷氨酸棒杆菌ATCC 21543的基因组为模板，以ald-F和ald-R为引物进行PCR，获得基因片段ald并进行PCR产物纯化；以谷氨酸棒杆菌ATCC 21543的基因组为模板，以ald-down-F和ald-down-R为引物进行PCR，获得基因片段ald-down并进行PCR产物纯化；

a2、将谷氨酸棒杆菌自杀性质粒pK18mobsacB用EcoRI/XbaI进行双酶切，利用Gibson Assembly试剂盒将基因片段ald-up、ald、ald-down一步连接到pK18mobsacB上，获得的重组质粒命名为pK18-ald；

a3、将pK18-ald转化到谷氨酸棒杆菌ATCC 21543中，获得的重组菌命名为C.glutamicum-ald；

所述重组菌C.glutamicum-ald包含序列如SEQ ID NO:1所示的由Pald启动子驱动的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因gapA；

B、重组菌C.glutamicum-ald/pXMJ-gapN的构建

b1、人工合成含有Psod启动子以及密码子优化的来源于变形链球菌的NADPH依赖型的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因gapN，序列如SEQ ID NO:3所示，将该片段连接到谷氨酸棒杆菌的穿梭载体pXMJ19上，获得的重组质粒命名为pXMJ-gapN；

b2、将重组质粒pXMJ-gapN转化到重组菌C.glutamicum-ald中，获得的重组菌命名为C.glutamicum-ald/pXMJ-gapN。

其中，引物序列如下：

ald-up-F：5′-cacagaattcgcaattttaaggtttgctggtg-3′；

ald-up-R：5′-agtggcgtcgacaagcatgttttttgcagggaacgaacctg-3′；

ald-F：5′-caggttcgttccctgcaaaaaacatgcttgtcgacgccact-3′；

ald-R：5′-ataccaacacgaatggtcattgggtctcctttgggccacc-3′；

ald-down-F：5′-ggtggcccaaaggagacccaatgaccattcgtgttggtat-3′；

ald-down-R：5′-cacatctagattagagcttggaagctacgag-3′。

优选地，步骤a3和b2采用电转化法，电击条件：电压2.5KV，电阻200Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)。

第三方面，本发明提供所述重组谷氨酸棒杆菌或按照所述方法构建得到的重组谷氨酸棒杆菌在赖氨酸发酵生产中的应用。

第四方面，本发明提供一种提高赖氨酸发酵产量的方法，所述方法包括：发酵培养所述重组谷氨酸棒杆菌或按照所述方法构建得到的重组谷氨酸棒杆菌，并从发酵产物中收集赖氨酸。

第五方面，本发明提供一种产戊二胺的工程菌，所述工程菌是在所述重组谷氨酸棒杆菌或按照所述方法构建得到的重组谷氨酸棒杆菌中表达赖氨酸脱羧酶基因构建得到的。

优选地，所述赖氨酸脱羧酶基因来源于大肠杆菌(Escherichia coli)。大肠杆菌赖氨酸脱羧酶基因ldcC经密码子优化后的序列如SEQ ID NO:4所示。

第六方面，本发明提供一种提高戊二胺发酵产量的方法，所述方法包括：发酵培养所述的工程菌，并从发酵产物中收集戊二胺。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明提供一种动态调控细胞内NADH和NADPH含量的方法，通过利用受生长调控的启动子Pald控制谷氨酸棒杆菌中gapA基因的表达，以及利用Psod启动子控制额外引入的gapN基因的表达，平衡细胞在不同发酵周期的NADH和NADPH的产量，从而显著提高赖氨酸和戊二胺的产量和生产效率。

具体实施方式

本发明针对上面提到的需要动态控制细胞内NADH和NADPH的含量，以平衡细胞生长和产物赖氨酸或者戊二胺合成的技术问题，通过两个不同类型的启动子Pald和Psod分别控制gapA和gapN基因的表达，以实现不同发酵周期的NADH和NADPH合成的切换。其中Pald启动子在发酵的早期表达强度高，而在细胞发酵的中后期表达强度迅速衰减；Psod在发酵的早期表达强度较低，但在发酵的中后期表达强度迅速的提高。

本发明提供一种通过动态调控谷氨酸棒杆菌中NADPH的供给以提高赖氨酸和戊二胺产量的方法。

本发明采用如下技术方案：

(1)在谷氨酸棒杆菌中将NADH依赖型的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因gapA的原有启动子(SEQ ID NO:2)替换为Pald启动子；(2)在上述菌株中表达包含有Psod启动子的gapN基因；(3)将上述菌株进行发酵培养检测菌体的生长和赖氨酸的产量；(4)在上述菌株中表达赖氨酸脱羧酶ldcC，并进行发酵培养检测戊二胺的产量。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中使用的质粒pEC-K18mob、pK18mobsacB以及载体pXMJ19购自Addgene公司。

实施例1将谷氨酸棒杆菌中gapA的原有启动子置换为Pald启动子

谷氨酸棒杆菌ATCC 21543是一株赖氨酸生产菌，本实施例将gapA的原有启动子(SEQ ID NO:2)替换为Pald启动子。

以谷氨酸棒杆菌ATCC 21543的基因组为模板，以ald-up-F(5′-cacagaattcgcaattttaaggtttgctggtg-3′)和ald-up-R(5′-agtggcgtcgacaagcatgttttttgcagggaacgaacctg-3′)为引物进行PCR，获得基因片段ald-up约1.0kb并进行PCR产物纯化。以谷氨酸棒杆菌ATCC 21543的基因组为模板，以ald-F(5′-caggttcgttccctgcaaaaaacatgcttgtcgacgccact-3′)和ald-R(5′-ataccaacacgaatggtcattgggtctcctttgggccacc-3′)为引物进行PCR，获得基因片段ald约0.36kb并进行PCR产物纯化。以谷氨酸棒杆菌ATCC 21543的基因组为模板，以ald-down-F(5′-ggtggcccaaaggagacccaatgaccattcgtgttggtat-3′)和ald-down-R(5′-cacatctagattagagcttggaagctacgag-3′)为引物进行PCR，获得基因片段ald-down约1.0kb并进行PCR产物纯化。将谷氨酸棒杆菌自杀性质粒pK18mobsacB(Journal ofBiotechnology 104(2003)287-299)用EcoRI/XbaI进行双酶切，利用Gibson Assembly试剂盒(NEB)将基因片段ald-up、ald、ald-down一步连接到pK18mobsacB上，获得的重组质粒命名为pK18-ald。利用电穿孔仪(伯乐)将pK18-ald通过电转化转入到谷氨酸棒杆菌ATCC21543中，电击条件为电压2.5KV，电阻200Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)，通过两次筛选获得重组菌，将该重组菌命名为C.glutamicum-ald。该重组菌的关键特征是包含ald启动子的gapA基因组合，序列如SEQ ID NO:1所示。

作为对照，本实施例同时构建了直接敲除gapA基因的对照菌株。以谷氨酸棒杆菌ATCC 21543的基因组为模板，以gap-up-F(5′-cacagaattccgtgcgagcaggtcggtgca-3′)和gap-up-R(5′-atctttagaggagacacaacttagttcacatcgctaacgtgg-3′)为引物进行PCR，获得基因片段gap-up约1.0kb并进行PCR产物纯化。以谷氨酸棒杆菌ATCC 21543的基因组为模板，以gap-down-F(5′-ccacgttagcgatgtgaactaagttgtgtctcctctaaagat-3′)和gap-down-R(5′-cacatctagagctgcatggcgcggtgcgtt-3′)为引物进行PCR，获得基因片段gap-down约1.0kb并进行PCR产物纯化。将谷氨酸棒杆菌自杀性质粒pK18mobsacB(Journal ofBiotechnology 104(2003)287-299)用EcoRI/XbaI进行双酶切，利用Gibson Assembly试剂盒(NEB)将基因片段gap-up、gap-down一步连接到pK18mobsacB上，获得的重组质粒命名为pK18-gap。利用电穿孔仪(伯乐)将pK18-ald通过电转化转入到谷氨酸棒杆菌ATCC 21543中，电击条件为电压2.5KV，电阻200Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)，通过两次筛选获得重组菌，将该重组菌命名为C.glutamicum-△gap。

实施例2表达带有Psod启动子的gapN基因

人工合成包含有Psod启动子以及密码子优化的来源于Streptococcus mutans的gapN基因，序列如SEQ ID NO:3所示，将该片段连接到谷氨酸棒杆菌的穿梭载体pXMJ19上，获得的重组质粒的名称为pXMJ-gapN。将重组质粒pXMJ-gapN通过电转化(条件同实施例1)转入到谷氨酸棒杆菌C.glutamicum-ald，获得的重组菌株命名为C.glutamicum-ald/pXMJ-gapN。

作为对照，同时将pXMJ-gapN通过电转化转入到菌株ATCC 21543和菌株C.glutamicum-△gap，获得的重组菌株分别命名为C.glutamicum/pXMJ-gapN，C.glutamicum-△gap/pXMJ-gapN。

实施例3重组谷氨酸棒杆菌的发酵培养生产赖氨酸

将谷氨酸棒杆菌ATCC 21543以及重组菌株C.glutamicum-ald/pXMJ-gapN，C.glutamicum/pXMJ-gapN，C.glutamicum-△gap/pXMJ-gapN在LB平板上过夜培养。从该新鲜平板上单菌落接种到含有30ml种子培养基的250ml带档板摇瓶中，32℃，200rpm培养12小时。

种子培养基的配方包括(g/L)：葡萄糖40，(NH

以10％的接种量将种子液接种到含有30ml发酵培养基的500ml带档板摇瓶中，32℃，200rpm培养72h。

发酵培养基配方包括：葡萄糖80g/L，玉米浆10g/L，尿素4.5g/L，硫酸铵45g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，七水硫酸亚铁10mg/L，四水硫酸锰10mg/L，β-丙氨酸5mg/L，烟酸5mg/L，硫胺素-盐酸5mg/L，生物素0.3mg/L，碳酸钙30g/L。

发酵过程中通过液相色谱检测产物浓度以及菌株的生长情况，结果如表1和表2所示。由表1和表2可以看出，通过引入Pald以动态控制gapA的表达以及Psod控制gapN的表达，C.glutamicum-ald/pXMJ-gapN在不影响菌体的情况下，赖氨酸的产量和生产效率都得到了显著的提升，且显著高于直接敲除gapA基因或者不改变gapA表达的对照菌株C.glutamicum/pXMJ-gapN，C.glutamicum-△gap/pXMJ-gapN。因此，本发明所采用的动态控制策略可以显著提高赖氨酸的产量。

表1不同菌株的生长情况(OD

表2不同菌株的赖氨酸产量情况(g/L)

实施例4重组谷氨酸棒杆菌的发酵培养生产戊二胺

以大肠杆菌MG1655的基因组为模板，以ldcC-F(5′-cacagaattccatgaacatcatcgcaatcat-3′)和ldcC-R(5′-cacatctagactagccagccatcttcagga-3′)为引物进行PCR，获得基因片段ldcC约2.1kb并进行PCR产物纯化。将谷氨酸棒杆菌穿梭质粒pEC-K18mob(Journal of Biotechnology 104(2003)287-299)用EcoRI/XbaI进行双酶切，利用Gibson Assembly试剂盒(NEB)将ldcC片段连接到pEC-K18mob上，获得的重组质粒命名为pEC-ldcC。将重组质粒电转到谷氨酸棒杆菌ATCC 21543以及菌株C.glutamicum-ald/pXMJ-gapN，C.glutamicum/pXMJ-gapN，C.glutamicum-△gap/pXMJ-gapN，获得的重组菌株分别命名为C.glutamicum/pEC-ldcC，C.glutamicum-ald/pXMJ-gapN/pEC-ldcC，C.glutamicum/pXMJ-gapN/pEC-ldcC，C.glutamicum-△gap/pXMJ-gapN/pEC-ldcC。

将谷氨酸棒杆菌C.glutamicum/pEC-ldcC，C.glutamicum-ald/pXMJ-gapN/pEC-ldcC，C.glutamicum/pXMJ-gapN/pEC-ldcC，C.glutamicum-△gap/pXMJ-gapN/pEC-ldcC在LB平板上过夜培养。从该新鲜平板上单菌落接种到含有30ml种子培养基的250ml带档板摇瓶中，32℃，200rpm培养12小时。

种子培养基的配方包括(g/L)：葡萄糖40，(NH

以10％的接种量将种子液接种到含有30ml发酵培养基的500ml带档板摇瓶中，32℃，200rpm培养72h。

发酵培养基配方包括：葡萄糖80g/L，玉米浆10g/L，尿素4.5g/L，硫酸铵45g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，七水硫酸亚铁10mg/L，四水硫酸锰10mg/L，β-丙氨酸5mg/L，烟酸5mg/L，硫胺素-盐酸5mg/L，生物素0.3mg/L，碳酸钙30g/L。

发酵过程中通过液相色谱检测产物浓度以及菌株的生长情况，结果如表3和表4所示。由表3和表4可以看出，通过引入Pald以动态控制gapA的表达以及Psod控制gapN的表达，C.glutamicum-ald/pXMJ-gapN/pEC-ldcC在不影响菌体的情况下，戊二胺的产量和生产效率都得到了显著的提升，且显著高于直接敲除gapA基因或者不改变gapA表达的对照菌株C.glutamicum/pXMJ-gapN/pEC-ldcC，C.glutamicum-△gap/pXMJ-gapN/pEC-ldcC。因此，本发明所采用的动态控制策略同样可以显著提高戊二胺的产量。

表3不同菌株的生长情况(OD

表4不同菌株的戊二胺产量情况(g/L)

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。