SNPs分子标记g.474011A＞G及其在湖羊分子标记辅助育种中的应用

技术领域

本发明属于湖羊分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一种与湖羊的断奶到六月龄日增重显著相关的SNPs分子标记g.474011A＞G、引物对、试剂盒及其在湖羊分子标记辅助育种中的应用。

背景技术

湖羊是我国珍稀的绵羊品种，原产于太湖流，所产羔皮花纹美观而著称，是我国特有的羔皮用绵羊品种，也是目前世界上少有的白色羔皮品种，在国际市场上享有很高的声誉，有“软宝石”之称。湖羊肉质鲜美湖羊体型大产肉量高，且肉质鲜美，营养丰富。湖羊肉与其他肉类相比,具有高蛋白、低脂肪、低胆固醇的优点,多汁、膻味小。但湖羊产在肉性能方面与杜泊羊、德国美利奴羊等国外肉用绵羊品种还存在较大差异。因此，非常有必要对湖羊生长性能进行选育，提高湖羊的产肉性能。

本申请人已有授权中国发明专利(公开号：CN109251986A、CN109182553A、CN109251987A、CN109251985A、CN109182554A和CN109055579A)公开了利用GWAS技术筛选的湖羊体尺性状候选功能基因及SNPs，并通过SNPs的群体验证，获得了可用于分子标记辅助育种的SNPs，可用于湖羊肉用性状分子标记辅助育种和湖羊肉用系核心群个体的早期选育。

ARHGAP24基因(也称为p73-RHOGAP或FilGAP)是Rho GTP酶激活蛋白家族的成员，可作为Rho GTP酶的负调节剂，并影响肌动蛋白重塑、细胞极性、细胞迁移、分化和发育，位于细胞质和细胞连接处，在血管生成过程中发挥重要的调节作用。

在哺乳动物中Rho GTP家族与多种细胞功能有关，包括肌动蛋白细胞骨架的重组，细胞生长控制，转录调控和膜运输，在动物生长发育过程中还与肺发育，呼吸系统发育，血管形态发生，心脏发育和转录调控有关。通过GWAS分析在杜洛克猪上发现ARHGAP24与其生长性状显著相关结合此前的研究，ARHGAP24中的突变可能与细胞生长调控中的某些功能有关，从而从一些未知的通路调控进一步影响了湖羊的生长特性，以期为湖羊的选育提供有效的分子标记，为今后绵羊育种提供理论依据。

前期，本申请人还申请了中国发明专利申请(CN114381531A、CN114438232A、CN114574596A、CN114480676A)公开了在ARHGAP24基因内含子1部分区内有15个SNPs,其中与湖羊体重、体尺性状显著相关的SNPs位点有4个：1.g.43756G＞A与湖羊体长显著相关，AA型个体的体长显著高于GA型个体(P＜0.05)，GG型个体与GA，AA型个体相比差异不显著(P＞0.05)。2.g.43815G＞A与湖羊体高显著相关，AA型个体的体高显著高于GG型个体(P＜0.05)，GA型个体与GG，AA型个体相比差异不显著(P＞0.05)。3.g.43851G＞A与湖羊体长显著相关，AA型个体的体长显著高于GA型个体(P＜0.05)，GG型个体与GA，AA型个体相比差异不显著(P＞0.05)。4.g.43917A＞G与湖羊体长和日增重显著相关，AA与GG型个体的体长显著高于AG型个体(P＜0.05)，AA与GG相比差异不显著(P＞0.05)，GG型个体断奶到六月龄日增重显著高于AA型个体，AG型个体与AA，GG相比差异不显著。

发明内容

为了解决分子标记育种中现有技术的欠缺和现实需要求，本发明的目的是提供一种湖羊的断奶到六月龄日增重显著相关的SNPs分子标记及其检测引物对和试剂盒，并提供所述分子标记的筛选方法和在湖羊分子标记育种中的应用。

为了实现上述的发明目的，本申请采用了以下的技术方案：

一种与湖羊的断奶到六月龄日增重显著相关的SNPs分子标记，该分子标记定位为g.474011A＞G；其中，GG基因型的断奶到六月龄日增重显著高于AA、AG基因型个体，AA与AG基因型个体相比差异不显著。

进一步，本申请提供了一种用于检测所述SNPs分子标记的引物对。

进一步，本申请提供了所述的引物对扩增获得的扩增产物，该扩增产物的序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步，本申请提供了一种用于扩增所述的扩增产物的引物对。

作为优选，所述引物对的序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。

进一步，本申请提供了一种包含所述引物对的试剂盒。

进一步，本申请提供了所述的SNPs分子标记、引物对和试剂盒在筛选湖羊断奶到六月龄日增重性状和湖羊分子标记育种中的应用；其中，GG基因型的断奶到六月龄日增重显著高于AA、AG基因型个体，AA与AG基因型个体相比差异不显著。

进一步，本申请还提供了一种筛选湖羊断奶到六月龄日增重性状的方法，该方法包括以下步骤：提取湖羊外周血基因组DNA，采用所述的引物对进行PCR扩增，对扩增产物中所述的SNPs分子标记进行检测，从而筛选出湖羊的断奶到六月龄日增重性状；其中，GG基因型的断奶到六月龄日增重显著高于AA、AG基因型个体，AA与AG基因型个体相比差异不显著。

作为优选，PCR反应体系为25μL，KOD OneTM PCR Master Mix(TOYOBO,日本)12.5μL，上下游引物各0.2μL，ddH2O 11.1μL；反应程序为：98℃变性10s，退火30s，68℃延伸30s，进行34个循环，PCR结束后4℃保存。

作为优选，采用血液基因组DNA提取试剂盒，提取血液DNA，DNA浓度大于50ng/μL，OD

本发明以213只湖羊为试验材料以ARHGAP24基因为候选基因，采用PCR扩增，产物直接测序以及序列分析技术筛选SNPs，并通过关联分析筛选出显著影响湖羊生长性状的SNPs位点。

本发明发现，在ARHGAP24基因部分区内有12个SNPs,其中与湖羊体重、体尺性状显著相关的SNPs位点有3个：g.474011A＞G与湖羊的断奶到六月龄日增重显著相关，GG基因型的断奶到六月龄日增重显著高于AA,AG基因型个体(P＜0.05)，AA与AG基因型个体相比差异不显著(P＞0.05)。g.474459G＞A与湖羊的断奶到六月龄日增重显著相关，GA基因型个体的体高显著高于GG基因型个体(P＜0.05)，AA基因型个体与GG,GA基因型个体相比差异不显著(P＞0.05)。g.474543G＞A与湖羊的六月龄到周岁日增重，周岁重显著相关，AA基因型个体的周岁日增重，周岁重显著高于GG,GA基因型个体(P＜0.05)，GG,GA基因型个体差异不显著(P＜0.05)。

附图说明

图1：湖羊ARHGAP24基因SNPs检测引物的PCR扩增结果；M：DL5000。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步说明。

1材料与方法

1.1试验材料

试验动物均来自杭州庞大农业开发有限公司的湖羊肉用新类群核心群，共213只，饲养管理按照肉羊标准的饲养管理方法进行饲养，健康无疾病。每个个体采集颈静脉血10mL，置于EDTA抗凝管，-20℃保存。测得所有试验羊的体(斜)长、体高、胸围，每只羊至少测量3次，取平均值作为最终的测量结果，其他体重指标均有羊场提供。

1.2基因组DNA提取和检测

采用血液基因组DNA提取试剂盒(天根,北京)，提取血液DNA，使用

1.3引物的设计及PCR扩增

引物的设计根据Ensembl公布的绵羊ARHGAP24基因序列(Acc:101119904)，利用DNAMAN8.0设计引物，引物的序列如表1

表1湖羊ARHGAP24基因PCR扩增引物

1.4PCR扩增

PCR反应体系为25μL，KOD OneTM PCR Master Mix(TOYOBO,日本)12.5μL，上下游引物各0.2μL，ddH2O 11.1μL。反应程序为：98℃变性10s，退火30s，68℃延伸30s，进行34个循环，PCR结束后4℃保存。

1.5PCR产物测序及序列分析

每个样品均按照表1列出的引物分别进行扩增，扩增产物交由安徽通用生物测序。使用Mutation Surveyor 5.02(Softgenetics，美国)软件分析每个个体的测序峰图确定每个个体突变位置和突变方式。

1.6数据统计与分析

使用little Programe计算PIC值，使用PopGen 32软件计算各SNPs的位点杂合度、Shannon信息含量、基因频率、基因型频率，并检测各位点是否符合Hardy-Weinberg平衡。

多态信息含量分析PIC(Polymorphism information content)，表示一个后代所获得某个等位基因来自于它的亲本的同一个等位基因的可能性，是衡量等位基因片段多态性的理想指标计算公式为：

Pi和Pj分别为第i个和第j个等位基因频率；n为等位基因数

位点杂合度

He(heterozygosity)指每个基因座上所存在的杂合个体的平均频率。杂合度能客观地反应群体的遗传变异水平，平均杂合度值越大，表明群体内遗传差异也越大，遗传多样性丰富，遗传潜力大，应用于动物遗传育种研究效果好；其数值越低，表明遗传一致性越高，说明群体内遗传变异小，遗传潜力也小。计算公式为：

pi表示第i个等位基因频率

Shannon信息含量

SIC(shannon information content)，计算公式为：

SIC＝-ClogPi

其中：Pi为第i个等位基因在群体中的频率，C为常数。

基因频率和基因型频率

①基因的型频率＝基因型个体数/该群体个体数×100％

②基因的频率＝纯合基因型频率+1/2×杂合基因型频率

关联分析

使用一般线性模型(General Linear Model，GLM；SPSS 20)挖掘与湖羊肉用新类群核心群体重、体尺性状关联的SNPs。

由于分析的所有个体均为来自同一饲养场，相同饲养环境和管理条件的雌性羊只，因此数据建模时不包括场效应和性别效应。

具体模型为：Y＝Xβ+e

其中，Y：湖羊肉用新类群核心群体尺性状、体重性状表型值向量；

β：表型均值、SNP等固定效应向量；

e：残差效应向量；

X为β的关联矩阵。

当Y为湖羊肉用新类群核心群初生重表型值向量时，按照模型Y＝Xβ+Sα+e分析。

其中Y：湖羊肉用新类群核心群体尺性状表型值向量；

α：同胞数的固定效应向量；

β：SNP效应向量；

e：残差效应向量；

X、S分别为β、α的关联矩阵。

2试验结果

2.1湖羊ARHGAP24基因SNPs检测PCR扩增结果

各引物PCR产物亮度较高，条带单一，无非特异性扩增(图1)，实际PCR产物与预计PCR扩增产物大小一致，可进行后续PCR-产物直接测序试验。

2.2湖羊ARHGAP24基因PCR扩增产物突变分析结果如表5所示。

表2湖羊ARHGAP24基因的SNPs位点及突变类型、方式

2.3湖羊ARHGAP24基因群体遗传学分析如表3，表4

表3湖羊ARHGAP24基因SNPs位点的遗传参数

表4湖羊SNPs位点群体遗传学分析

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态信息含量(PIC)是用来判定和分析一个遗传标识所表达的信息含量，PIC>0.5是高度多态位点，0.25

PIC值越大说明有效等位基因数与杂合度越大，该群体在此SNP位点的变异性也越高，g.837A＞G、g.171930T＞C、g.171951A＞G、g.474021A＞G、g.474130T＞G、g.474408G＞A、g.474408G＞A、g.474543G＞A为低度多态，g.959A＞G、g.474011A＞G、g.474176A＞G、g.474429G＞A、g.474459G＞A为中度多态。

2.4ARHGAP24基因湖羊的生长性状关联分析

利用“关联分析”中的GLM模型分别进行ARHGAP24基因的15个SNPs与湖羊的生长性状的关联分析(表5)。

分析结果显示：g.474011A＞G与湖羊的断奶到六月龄日增重显著相关，GG基因型的断奶到六月龄日增重显著高于AA和AG基因型个体(P＜0.05)，AA与AG基因型个体相比差异不显著(P＞0.05)。

g.474459G＞A与湖羊的断奶到六月龄日增重显著相关，GA基因型个体的体高显著高于GG基因型个体(P＜0.05)，AA基因型个体与GG、GA基因型个体相比差异不显著(P＞0.05)。

g.474543G＞A与湖羊的六月龄到周岁日增重，周岁重显著相关，AA基因型个体的周岁日增重，周岁重显著高于GG和GA基因型个体(P＜0.05)，GG与GA基因型个体差异不显著(P＜0.05)。

以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施列，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。