一种乳酸菌直投式发酵小黄姜及其制备方法

技术领域：

本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一种乳酸菌直投式发酵小黄姜及其制备方法。

技术背景：

小黄姜是一种分布于我国云南地区的特色蔬菜，其性温、味辣，具有驱寒温肺、开胃健脾、缓解疲劳、抗氧化、抗肿瘤等多种功效。由于新鲜小黄姜辛辣味重、贮存期短、易腐坏变质，所以人们常用泡制的方式将其制作成易于贮藏的风味泡姜。工业上，常使用高盐高酸腌制的方式来生产泡姜，其产品风味单一、营养损失严重且生产周期长(一般在2个月以上)。

CN 111616339公布了《一种泡姜制备方法》，该发明通过原料预处理、腌制、筛分、过滤、泡制等步骤完成。该发明通过盐水和红尖椒的腌制，对生姜进行染色和提味，使其颜色红艳、口感香脆；该发明利用天然辣椒红色素代替了人工色素的添加，同时解决了传统工艺中泡姜产品脆度和口感欠佳的问题。CN 109198528公布了《一种糖醋酱香泡姜及其制备方法》，通过原料预处理、沸水漂烫、柠檬酸浸泡、腌制、干燥、香料煎煮、糖醋液浸泡、抽真空、密封腌制等步骤制成。该发明通过糖醋腌制得到了一种色泽浅黄微红、脆嫩可口、具有独特酱香味和辛辣味的糖醋酱香泡姜，丰富了生姜制品的种类和口感。

直投式发酵是指利用一种或多种纯培养物制成的发酵剂直接投放至基质中进行发酵的一种技术，其具有稳定发酵产品品质、提升产品均一性、缩短发酵周期、丰富产品风味等众多优点。CN 108936477公布了《一种袋内发酵生姜泡菜的制备方法》，主要通过原料预处理、消毒清洗、发酵溶液配制、装袋、发酵等步骤制备而成。该发明通过添加直投式乳酸菌菌粉和植物乳杆菌360初级代谢产物制品与关键参数的控制，有效避免了产品产气变质问题，维持了发酵生姜在保质期的色泽、风味、脆度，实现了生姜泡菜的清洁化、标准化、零排放的生产。

但现有技术普遍存在产品风味多数由香料调配而成、发酵周期长、制作工艺复杂等问题，且高盐分的摄入提升了消费者罹患心血管疾病的风险。

发明内容：

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种风味丰富怡人、具有良好保健功能、发酵周期短的低盐化功能性乳酸菌直投式发酵小黄姜制备方法，其制作过程简单且适合于大规模工业化生产。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供的技术方案之一，是一种乳酸菌直投式发酵小黄姜的方法，该方法选取无腐烂变质、成熟、新鲜的小黄姜，用清水刷洗干净，去除不可食用部分后备用，采用复合乳酸菌直投式发酵获得，具体地，包括以下步骤：

(1)按以下重量份数向发酵容器中加入各原料：

40～60份小黄姜、40～60份纯净水、2～6份食用盐、1～3份葡萄糖、0.5～1.5份蔗糖、0.2份食用氯化钙，搅拌均匀后加入0.001～0.1份复合乳酸菌直投式发酵剂；

(2)混合均匀后于35-37℃下，静置发酵5～15天；

(3)发酵完成后，将小黄姜真空包装并进行巴氏杀菌，即可获得成品。

优选地，所述小黄姜为云南小黄姜；

进一步地，所述复合乳酸菌直投式发酵剂中的菌活为(1-9)×10

优选地，所述复合乳酸菌直投式发酵剂中的菌活为1×10

优选地，所述发酵条件为37℃下发酵10天；

进一步地，所述复合乳酸菌直投式发酵剂包括植物乳植杆菌和戊糖片球菌；

更进一步地，所述复合乳酸菌直投式发酵剂中，植物乳植杆菌和戊糖片球菌等比例添加；

优选地，所述植物乳植杆菌为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)NCU001438，已于2022年8月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO.25608。

优选地，所述戊糖片球菌为戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)NCU006038，已于2022年8月29日保藏与中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.25607。

进一步地，90℃巴氏杀菌10分钟处理。

优选地，发酵条件为：复合乳酸菌直投式发酵剂(1×10

本发明提供的技术方案之二，是由上述方法制备的发酵小黄姜。

本发明的有益效果在于：

(1)采用复合乳酸菌直投式发酵剂进行直投式发酵，使发酵时间从2个月以上缩短至15天以内，大幅度提高了生产效率；

(2)通过乳酸菌的发酵增加了小黄姜产品中的短链脂肪酸和氨基酸含量，同时赋予了小黄姜柔和的酸味和丰富的发酵香气，大幅度提升了消费者接受度；

(3)本发明制备的乳酸菌发酵小黄姜产品具有优异的抗氧化能力，在DPPH自由基、羟基自由基、ABTS自由基清除能力以及总还原能力方面均具有较好的表现；

(4)本发明制备的乳酸菌发酵小黄姜产品具有优异的黄嘌呤氧化酶抑制活性，具备良好的潜在降尿酸功效；

(5)本发明制备的乳酸菌发酵小黄姜产品对于一些常见癌细胞具有较好的抗肿瘤增殖活性；

(6)低盐工艺的引入降低了生产成本，同时避免了高盐摄入和废水排放所带来的健康风险和环境压力；

(7)本发明制作工艺简单、易于控制，标准化程度高，产品品质稳定，易于实现大规模工业化生产。

具体实施方式：

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

本发明所采用的部分实验或测定方法如下(其余未明确记载的方法均为本领域的常规测定或检测方法)：

(1)挥发性风味化合物检测方法如下：

采用顶空固相微萃取结合气相色谱质谱法，使用安捷伦三重串联四级杆气质色谱串联飞行时间质谱仪测定直投式发酵小黄姜挥发性风味物质组成。具体条件为，

色谱柱：HP-5MS石英毛细管色谱柱(30m×0.25mm，0.25μm)

升温程序：初始温度50℃，维持3min，随后以2℃/min升至100℃并维持2min，然后以4℃/min升至210℃维持5min；载气为氦气，流速1.0mL/min，压力7.6522psi；分流比50:1；EI电离源，电离能量70eV，温度230℃；进样口温度250℃；传输线230℃；质谱扫描范围m/z35～450，2scans/s。

化合物鉴定：质谱数据采集完成后，使用安捷伦公司的MassHunter和UnknownAnalysis软件对GC-Q-TOF/MS原始数据进行峰提取、峰对齐、基线过滤，采用NIST17.0谱库对每种化合物进行比对鉴定，使用峰面积归一法定量。

(2)游离氨基酸检测方法如下：

游离氨基酸检测方法是根据GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的测定》，利用氨基酸分析仪测定样品的氨基酸种类及含量。

(3)有机酸检测方法如下：

样品于4℃下10000rpm离心10min，取1mL上清液过0.22μm水系滤膜后待测定。使用安捷伦1260高效液相色谱仪进行有机酸含量的检测。色谱柱采用BIO-RAD

(4)DPPH自由基清除能力检测方法如下：

小黄姜样品与超纯水1:1混合后匀浆，超声提取30min后离心取上清液备用。将1.0mL提取后的样品加入到1mL的乙醇DPPH自由基溶液(0.1mM)中，混匀后在室温下黑暗环境中温育30min。8000g离心10min后，以1mL PBS和1mL乙醇DPPH溶液的混合物作为对照组，1mL乙醇和1mL提取小黄姜样品作为背景空白，在517nm下测量所得溶液的吸光度。以Trolox作参考标准，将结果表示为μM Trolox。

式中：A

(5)羟基自由基清除能力检测方法如下：

小黄姜样品与超纯水1:1混合后匀浆，超声提取30min后离心取上清液备用。将1mL2.5mM的邻菲罗啉，1mL PBS(pH 7.4)，1mL 2.5mM FeSO

(6)ABTS自由基清除能力检测方法如下：

使用ABTS法对发酵小黄姜的总抗氧化能力进行测定。小黄姜样品与超纯水1:1混合后匀浆，超声提取30min后离心取上清液备用。将ABTS储备液与2.45mmol/L K

(7)总还原能力检测方法如下：

按照铁还原/抗氧化能力(FRAP)法测定发酵小黄姜样品的总还原能力。小黄姜样品与超纯水1:1混合后匀浆，超声提取30min后离心取上清液备用。根据FRAP总抗氧化能力测定试剂盒的说明制备FRAP试剂。测定前制备新鲜FRAP反应试剂并置于37℃水浴。将5μL提取样品加入至180μL FRAP试剂中，并在黑暗中37℃孵育5min。在593nm处测量混合物的吸光度。用0.15，0.3，0.6，0.9，1.2和1.5mM FeSO

(8)抗肿瘤能力检测方法如下：

使用CCK-8法测定发酵小黄姜的抗肿瘤能力。发酵小黄姜样品匀浆后称取2.0g加入70％的乙醇30mL，超声提取20min后离心取上清液，过滤，旋蒸浓缩后真空冻干，备用。将培养好的HepG2、Caco-2和HT-29细胞用胰酶-EDTA消化液消化，随即用DMEM完全培养液(含20％的胎牛血清)重悬细胞并调整细胞浓度为1.0×10

其中A

(9)黄嘌呤氧化酶抑制率检测方法如下

按照(8)的方法进行发酵小黄姜样品的提取和制备。黄嘌呤氧化酶抑制率检测方法如下：反应体系为5mL，样品组中分别加入不同浓度的发酵小黄姜样品提取液0.2mL、2.3mL PBS溶液(0.2mmol/L，pH 7.5)、2.0mL黄嘌呤溶液(1.2mmol/L)，25℃恒温水浴20min后加入50U/L黄嘌呤氧化酶溶液，反应10min，每隔1min测定292nm下的吸光值。对照组用PBS缓冲液代替发酵黄姜样品提取液。按下式计算样品的黄嘌呤氧化酶抑制率并根据抑制率计算IC

其中，K

(10)本发明及实施例涉及的乳酸菌直投式发酵剂的制备方法如下：

本领域技术人员可采用任何可使用的发酵和制备方法获得菌剂，满足活菌数即可。在此提供的乳酸菌直投式发酵剂的制备方法仅作为示例：

将植物乳植杆菌(NCU001438或ATCC 8014)和戊糖片球菌(NCU006038或DSM20336)分别接种至MRS液体培养基中连续活化三次，分别以2％(v/v)接种量接种至MRS液体培养基中37℃静置培养24h，离心(4℃，6000×g，10min)收集菌体后分别与菌体质量10％的无菌脱脂乳混合均匀，-80℃下预冻2h，随后分别转移至真空冷冻干燥仪中冻干24h即可获得植物乳植杆菌和戊糖片球菌的单菌发酵剂。用葡萄糖干粉调整单菌发酵剂的菌活为1-9×10

以下通过具体实施例对本发明作进一步地解释说明。

实施例1一种乳酸菌直投式发酵小黄姜的方法

选取无腐烂变质、成熟、新鲜的云南小黄姜，用清水刷洗干净，去除不可食用部分后备用，向发酵容器中加入50份小黄姜、50份纯净水、4份食用盐、2份葡萄糖、1份蔗糖、0.2份食用氯化钙，搅拌均匀后加入0.01份复合乳酸菌直投式发酵剂(1×10

实施例2一种乳酸菌直投式发酵小黄姜的方法

选取无腐烂变质、成熟、新鲜的云南小黄姜，用清水刷洗干净，去除不可食用部分后备用，向发酵容器中加入40份小黄姜、60份纯净水、2份食用盐、1份葡萄糖、0.5份蔗糖、0.2份食用氯化钙，搅拌均匀后加入0.001份复合乳酸菌直投式发酵剂(1×10

实施例3一种乳酸菌直投式发酵小黄姜的方法

选取无腐烂变质、成熟、新鲜的云南小黄姜，用清水刷洗干净，去除不可食用部分后备用，向发酵容器中加入60份小黄姜、40份纯净水、6份食用盐、3份葡萄糖、1.5份蔗糖、0.2份食用氯化钙，搅拌均匀后加入0.1份复合乳酸菌直投式发酵剂(1×10

对比例1

本对比例作为实施例1的对比例，在接种直投式发酵剂步骤中，使用0.01份植物乳植杆菌NCU001438直投式发酵剂(1×10

对比例2

本对比例作为实施例1的对比例，在接种直投式发酵剂步骤中，使用0.01份戊糖片球菌NCU006038直投式发酵剂(1×10

对比例3

本对比例作为实施例1的对比例，在接种直投式发酵剂步骤中，使用0.01份复合乳酸菌直投式发酵剂(1×10

实施例4发酵结果验证1

为验证本发明的有益效果，特对实施例1及对比例1～3最终发酵产品的不同指标进行了测定，发现将植物乳植杆菌NCU001438、戊糖片球菌NCU006038进行混合发酵后(实施例1)，相较于植物乳植杆菌NCU001438、戊糖片球菌NCU006038单独发酵，在挥发性风味物质、氨基酸含量、黄嘌呤氧化酶抑制率以及抗肿瘤活性方面，均有显著提升。具体结果如下：

(1)对主要挥发性风味化合物含量的影响

表1不同发酵菌种对直投式发酵小黄姜主要挥发性风味化合物含量的影响

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注：“-”表示未检测到。

如表1所示，相较于分别采用植物乳植杆菌NCU001438、戊糖片球菌NCU006038进行单菌发酵的对比例1、2，实施例1将植物乳植杆菌NCU001438、戊糖片球菌NCU006038进行混菌发酵后，酯类和醇类的相对含量升高，且挥发性香气种类更丰富，如产生了异戊酸乙酯、丁酸乙酯、水杨酸乙酯等新的香味物质，赋予产品丰富的果香。

如表1所示，相较于采用植物乳植杆菌ATCC 8014和戊糖片球菌DSM20336进行混菌发酵的对比例3，实施例1将植物乳植杆菌NCU001438、戊糖片球菌NCU006038进行混菌发酵后，产品中酯类和醇类物质的相对含量显著高于对比例3，且产生了异戊酸乙酯、丁酸乙酯、水杨酸乙酯。说明采用本发明提供的植物乳植杆菌NCU001438、戊糖片球菌NCU006038进行混菌发酵，相对于采用现有技术中的植物乳植杆菌和戊糖片球菌，在主要挥发性风味化合物的生产上具有明显优势。酯类是具有水果味、甜味的挥发性化合物，可赋予产品更丰富更浓郁的果香气。

综上，实施例1对应的复合乳酸菌直投式发酵剂制备的发酵小黄姜产品具有更丰富更愉悦的香气成分，有助于提升消费者接受度。

(2)对呈味氨基酸含量的影响

表2不同发酵菌种对直投式发酵小黄姜16种呈味氨基酸含量的影响

如表2所示，与对比例1～3相比，实施例1制备的复合乳酸菌直投式发酵小黄姜的总氨基酸、鲜味氨基酸、甜味氨基酸及苦味含量均较高。因此，实施例1使用的复合乳酸菌直投式发酵剂在提高小黄姜总氨基酸水平的同时，能赋予直投式发酵小黄姜更多的鲜味和甜味。

(3)对黄嘌呤氧化酶抑制能力的影响

表3不同发酵菌种对直投式发酵小黄姜黄嘌呤氧化酶抑制能力的影响

如表3所示，实施例1制备的复合乳酸菌直投式发酵小黄姜的黄嘌呤氧化酶抑制IC

(4)对抗肿瘤活性的影响

表4不同发酵菌种对直投式发酵小黄姜抗肿瘤活性的影响

如表4所示，与对比例1～3相比，实施例1制备的复合乳酸菌直投式发酵小黄姜对于HepG2、Caco-2和HT-29等癌细胞的IC

实施例5发酵结果验证2

本发明还对实施例1-3的发酵获得的小黄姜产品的理化指标、有机酸、抗氧化性能进行了测定，结果如下：

(1)不同实施例中直投式发酵小黄姜的主要理化指标

表5主要理化指标

如表5所示，实施例1-3制备的复合乳酸菌发酵小黄姜产品pH较低，总酸度较高，能赋予产品特殊的发酵酸味。实施例1-3制备的发酵小黄姜产品的亚硝酸盐含量均低于2.5mg/kg，远低于国家标准GB2762中酱腌菜亚硝酸盐含量的限量标准(20mg/kg)。此外，所有实施例制备的直投式发酵小黄姜产品盐含量均低于6％，在满足了低盐化的健康需求的同时又降低了高盐废水排放带来的环境压力。

(2)不同实施例直投式发酵小黄姜的有机酸含量

表6有机酸含量

注：“-”表示未检测到。

如表6所示，实施例1-3制备的复合乳酸菌直投式发酵小黄姜的各类有机酸(除草酸外)含量较发酵前均有提升，其中以乳酸含量最高。乳酸、苹果酸及柠檬酸为产品主要提供柔和愉快的酸味滋味。乙酸和异丁酸则属于短链脂肪酸的重要组成，有助于预防和治疗一些代谢综合征。

(4)不同实施例中直投式发酵小黄姜的抗氧化能力

表7直投式发酵小黄姜抗氧化能力

如表7所示，实施例1-3制备的复合乳酸菌直投式发酵小黄姜的DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和总还原能力均较强，说明实施例1-3制备的复合乳酸菌直投式发酵小黄姜具有优异的抗氧化活性。

(5)本发明制备的复合乳酸菌直投式发酵小黄姜产品，即实施例1-3的保质期通过以下感官质量和微生物指标确定：

表8复合乳酸菌直投式发酵小黄姜产品(实施例1-3)保质期评价

如表8所示，本发明制备的复合乳酸菌直投式发酵小黄姜产品在18个月的贮藏期间色泽、脆度、滋味、气味及组织状态等感官指标均未发生变化，微生物菌落总数均为0，未检测到大肠菌群。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。